Vorhersage der Amputation mit lokal zirkulierenden mononukleären Progenitorzellen bei angioplasty-behandelten Patienten mit kritischer LimbIschemia

Periphere arterielle Erkrankung (PAD) ist durch eine chronische und progressive gefäßverstopfung mit Einschränkung der Blutversorgung^{gekennzeichnet 1}. Auf globaler Ebene betrifft PAD der unteren Gliedmaßen etwa 10% der älteren Bevölkerung, während bis zu 7% solcher Fälle der Gliedmaßenamputation unterzogen werden^2,3.

Critical Limb Ischemia (CLI) stellt die seriöseste Präsentation von PAD¹dar. Patienten erleben in der Regel Schmerzen in Ruhe, Geschwüre, oder Gangrän, die auf verstopfte Arterien zurückzuführen sind; während die klinische Prognose ungünstig ist und durch ein Risiko von 30% für Gliedmaßenamputation und Mortalität während 1 Jahr^3,4,5gekennzeichnet ist.

Angioplastie ist ein minimalinvasives endovaskuläres Verfahren, das den Blutfluss in die untere Extremität bei Patienten mit CLI wiederherstellen kann; jedoch benötigen einige Patienten unweigerlich eine größere Gliedmaßenamputation, auch nach der Angioplastietherapie^1,5. Die frühzeitige Identifizierung ungünstiger Ergebnisse nach der Angioplastie ist aufgrund der Möglichkeit der Therapiedurchsetzung sehr wertvoll.

Herkömmliche Risikofaktoren können eine begrenzte Vorhersagefähigkeit für eine größere Gliedmaßenamputation beiPatienten mit CLI, die angioplasty unterzogen 6 . Pathophysiologie-orientierte Biomarker stellen neuartige Methoden mit potenziellen klinischen Anwendungen dar, die bei Erkrankungen im Zusammenhang mit Gefäßverletzungen besonders nützlich sein können⁷. Heutzutage ist die Beteiligung von Zellpopulationen, die endotheliale Reparatureigenschaften besitzen, an der Stelle der atherosklerotischen Plaque, zunehmend^anerkannt8^,9.

Mononukleare Progenitorzellen (MPCs) werden aus dem Knochenmark abgeleitet und eigene strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Stammzellen mit vaskulären regenerativen Fähigkeiten. Aufgrund der Fähigkeit von MPC, sich zu vermehren, zu migrieren und Gefäßhaftung zu zeigen; Diese Zellen sind gute Kandidaten geworden, um endotheliale Reparatur als Reaktion auf Ischämie^10,11,12zu reflektieren. Darüber hinaus hat das kontinuierliche Interesse an Mechanismen, die einer Gefäßverletzung zugrunde liegen, die Erforschung der prognostischen Rolle lokal auftretender Biomarker motiviert, da sie als Rewiderspiegelung von Gefäßschäden und^Reparatur7^,13,14angesehen werden.

Der Zweck dieser Studie ist es, zu beschreiben, wie die Menge der MPCs zu bestimmen, die in der Nähe der vaskulären Obstruktion bei Patienten mit CLI unter einer Angioplastie zirkulieren; und wie die Beziehung zwischen MPCs mit Indikatoren für endotheliale Dysfunktion und Gliedmaßenamputation zu bewerten.

Im Vergleich zur Prognose, die auf Komorbiditäten und intrinsischen Gefäßmerkmalen basiert, zeigt die Menge der lokalen MPCs spezifische Fähigkeit, klinische Ergebnisse in Bezug auf endotheliale Dysfunktion und Gliedmaßenamputation vorherzusagen. Konsequenterweise haben einige Studien die prognostische Rolle ähnlicher Biomarker bei der Bewertung von Patienten mit PAD^15,16beschrieben.

Basierend auf früheren Ergebnissen⁷kann die hier beschriebene Methode für eine frühzeitige Identifizierung der Population mit einem Risiko für unerwünschte vaskuläre Ergebnisse in mehreren klinischen Umgebungen nützlich sein, wie z. B. untere Gliedmaßen und koronare Ischämie, Schlaganfall, Vaskulitis, Venenthrombose und andere mit Gefäßverletzungen und Reparaturen.

Die Ethikkommission für institutionelle Forschung des Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" ISSSTE genehmigte dieses prospektive Protokoll, alle eingeschriebenen Patienten erteilten schriftliche Einwilligung in Kenntnis der Sachlage.

1. Bewertung des Gefäßblocks der unteren Extremität, Blutentnahme und Ballonangioplastie

HINWEIS: Die für dieses Experiment verwendete Studienstichprobe, die aus 20 Diabetikern im Alter von 68 Jahren und 10 von 20 Personen bestand, waren männlich. Die Hälfte der Stichprobe waren Raucher und die häufigsten Komorbiditäten waren Typ-2-Diabetes mellitus, systemische arterielle Hypertonie und/oder Dyslipidämie. Die Probe sollte auf Alters-, Geschlechts- und Komorbiditäten standardisiert werden. Eine mögliche Verzerrung aufgrund des klinisch-demografischen Einflusses auf das Verhältnis zwischen MPCs und CLI konnte nicht ausgeschlossen werden.

1. Bewertung des klinischen Schweregrads der Gliedmaßen-Ischämie gemäß der Rutherford-Klassifikation¹³ (siehe Ergänzende Tabelle 1).
2. Führen Sie angiographie, Blutentnahme und Ballon-Angioplastie durch.
   1. Verwenden Sie Antikoagulanzien und Anästhetika vor der Operation.
   2. Legen Sie eine 18 G Nadel in das Blutgefäß an der ausgewählten Leistenstelle.
   3. Platzieren Sie einen Einführer und bringen Sie einen flexiblen Führungsdraht voran. Dann wird die erste Anleitung für einen 6 Fr Einführungser weiter geändert.
   4. Verwenden Sie die periodische Injektion von Kontrastmedien oder_CO2 unter fluoroskopischer Anleitung, um arterielierte Flugbahn und vaskuläre blockierte Stellen zu identifizieren (Abbildung 1).
      HINWEIS: Verwenden Sie Kontrastmedien 40 ccm, verdünnt 1:1 in 0,9% Kochrat, oder CO₂ bei 10 bis 20 ml pro Schuss bei einem Druck von 12 psi.
   5. Führen Sie zwei 0,014 Fr Navigationsführungsdrähte und zwei 0,014 Fr-Unterstützungsführungsdrähte in das Schiff ein und bringen Sie sie bis zur gesperrten Stelle vor.
      HINWEIS: Zwei 0,014 Fr Führungsdrähte (260 cm lang) werden für die Navigation und zwei 0,014 Fr Führungsdrähte (260 cm lang) zur Unterstützung während eines einzigen Verfahrens verwendet.
   6. Führen Sie 5 Fr- und 3 Fr-Katheter nacheinander ein und sammeln Sie 10 ml Blut von der nächstgelegenen Stelle bis zur Gefäßverstopfung. Blutproben auf Eis aufbewahren.
      HINWEIS: Kathetergrößen können 5 Fr und 3 Fr sein, und sie werden während des Verfahrens geändert.
   7. Führen Sie einen Führungsdraht erneut an. Führen Sie dann einen Angioplastie-Ballonkatheter ein, der einen aufblasbaren Ballon am Ende des Katheters enthält. Fördern Sie den Angioplastie-Ballonkatheter und platzieren Sie den Ballon direkt an der Stelle der Läsion. Führen Sie die Angioplastie durch Aufblasen des Ballons gegen die blockierende Plaque an der Gefäßwand aus. Überprüfen Sie die Wiederherstellung des Blutflusses.
      HINWEIS: Ein Stent kann im blockierten Bereich platziert werden, um die Arterie nach dem Eingriff offen zu halten.
   8. Führen Sie einen Katheter ein und fahren Sie bis zur nächstgelegenen Stelle zum Gefäßblock vor. Sammeln Sie 10 ml Blut in 30 min Zeitintervall nach Angioplastie. Blutproben auf Eis aufbewahren.
      HINWEIS: Die Entnahme von Blutproben vor und nach der Angioplastie wird empfohlen, um den Einfluss der Angioplastie auf die Anzahl der MpCs weiter zu bewerten.
   9. Entfernen Sie alle Drähte unter fluoroskopischer Führung.
   10. Bieten Sie postoperative Pflegeverfahren, einschließlich Anti-Koagulationstherapie mit Enoxaparin bei 1 mg/kg subkutan alle 12 h, Aspirin 100 mg, Statin, und Analgesie. Komprimieren Sie an der Stelle der Gefäßpunktion während 24 h.

2. Quantifizierung der zirkulierenden mononuklearen Vorläuferzellen (MPCs) (Abbildung 2)

1. In ein frisches 15 ml konisches Rohr 6 ml des gesammelten Blutes übertragen und 1:1 (v/v) mit PBS verdünnen.
   HINWEIS: Verarbeiten Sie das Blut innerhalb von 1 h aus der Sammlung.
2. Bereiten Sie sich auf die Dichtegradiententrennung vor, indem Sie jeweils 2 ml des Dichtegradientenmediums zu jeweils 3 Reagenzgläsern hinzufügen. Fügen Sie dann 3 gleiche Volumen-Aliquots des verdünnten Blutes in jedes Reagenzglas.
   HINWEIS: Nicht mehr als drei Viertel der maximalen Kapazität des Reagenzglases.
3. Zentrifuge bei 1.800 x g für 30 min bei 4 °C. Sammeln Sie die Als Ring vorhandene Schnittstellenschicht mit einer Pipette, und übertragen Sie sie in ein neues Rohr. 2 ml PBS hinzufügen und bei 1.800 x g für 6 min bei 4 °C drehen. Speichern Sie das Pellet, da dies MPCs enthält.
4. Waschen Sie das Pellet, das MPCs enthält, mit PBS durch Zentrifugation, wie in Schritt 2.3 beschrieben. Verwenden Sie frische PBS für jede Wäsche und Drehung bei 1.800 x g für 2 min bei 4 °C. Wiederholen Sie den Vorgang 6 Mal.
5. Verwenden Sie nach der letzten Wäsche 1 ml PBS, um das Zellpellet wieder aufzuhängen. Verdünnen Sie 20 l der Zellsuspension mit 20 l 0,4% Trypan blau, 1:1 (v/v). Verwenden Sie 10 l dieser Zellsuspension für die Zellzählung mit Hilfe eines Hämozytometers und eines Lichtmikroskops.
6. Aliquot 1 x 10⁶ MFC in zuvor beschrifteten 5 ml Durchflusszytometrieröhren.
   HINWEIS: Bereiten Sie entsprechende isotypübereinstimmende Kontrollantikörper vor.
7. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 1.800 x g für 6 min bei 4 °C. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand.
8. Primären Antikörper in 100 l Antikörper-Inkubationslösung [1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM, BSA 0,05%] verdünnen und in das Rohr geben. 10 s aufsetzen und 20 min bei 4 °C im Dunkeln bebrüten.
   HINWEIS: Die Endkonzentrationen der primären Antikörper, die im vorliegenden Protokoll verwendet wurden, waren CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50. Das Protokoll kann bei diesem Schritt gestoppt werden, indem Lymphozyten in 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert und Proben bis zu 24 h bei 4 °C gelagert werden.
9. Zentrifugieren Sie bei 1.800 x g für 2 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand. Resuspend in 500 l mit 1x PBS, pH 7,4, EDTA 2 mM.
10. Führen Sie eine Flusszytometrieanalyse durch.
    1. Richten Sie den Hintergrund mit isotypgerechten Kontrollantikörpern ein. Dann, auf der FSC / SSC-Plot wählen Lymphozyten verbreiten, versuchen, Zellablagerungen auszuschließen, Restgranulozyten, und andere Partikel. Eine solche Verteilung wird als 100% betrachtet.
       HINWEIS: Lymphozyten breiten sich in der Regel im unteren linken Bereich des Grundstücks aus.
    2. Verwenden Sie ein Tor mit gemeinsamem Immunophenotyp mit einer hohen Anzahl von Zellen CD45⁺ und CD34⁺. Wählen Sie dann die Option für doppelte positive Immunophenotypen aus, die Gate verwenden, das zuvor CD45⁺, CD34⁺identifiziert hat, und entweder KDR (VEGFR-2)⁺, CD133⁺ oder CD184⁺hinzufügen. Identifizieren Sie MPCs-Subpopulationen anhand ihrer spezifischen Zelloberflächenmarker. Melden Sie sich als Prozentsatz der Gated-Ereignisse.
11. Identifizieren Sie die wichtigsten Teilpopulationen von MPCs. In der vorliegenden Studie wurden die analysierten Immunphenotypen CD45⁺CD34⁺CD133⁺; CD45⁺CD34⁺CD184⁺; CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺; CD45⁺CD34⁺KDR⁺; CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD133⁺ CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD184^7,17.
    HINWEIS: Diese Zelloberflächenmarker wurden für die Studie verwendet: CD45 (Lymphozyten), CD34 (endotheliale und/oder vaskuläre Zellen), KDR (VEGFR-2) (Membranmarker von Endothelzellen), CD133 (Endothelvorläuferzellen) und CD184 (hämatopoetische Stammzellen und Endothelzellen).

3. Beziehung von MFC mit Änderung der Endothelfunktion und hämodynamischen Test (FMD)

1. Bestimmen Sie die strömungsvermittelte Dilatation (FMD), die Prä- und Postangioplastie.
   1. Verwenden Sie einen vaskulären linearen Wandler, um den Durchmesser der Brachialarterie zu messen.
   2. Legen Sie die Manschette des Sphygmomanometers über der Messstelle in den Unterarm und insufflaten Sie 50 mmHg über dem systolischen Blutdruck für 5 min und deflaten.
   3. Bestimmen Sie den Durchmesser der Brachialarterie innerhalb der nächsten 60 s erneut. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um MKS zu schätzen.
      HINWEIS: Berechnen Sie den Dilatationsgrad anhand der Gleichung (%) = (maximaler Durchmesser nach transienter Ischämie - Basaldurchmesser) × 100 / Basaldurchmesser.
2. Korrelieren Sie die Anzahl der MpC mit dem Basis-MKS-Wert und dem Post-Angioplastie-Delta der MKS.

4. Prognostische Fähigkeit von MPCs für Gliedmaßenamputation

1. Planen Sie regelmäßige medizinische Termine nach Ballon-Angioplastie und Patientenentladung, um die Qualität des Blutflusses in die untere Extremität zu bewerten.
2. Bewerten Sie die klinische Schwere der Gliedmaßen-Ischämie nach 2 Wochen nach der Angioplastie. Bewerten Sie die Lösung von Ruheschmerzen, niedrigere Ischämie und die Erhaltung eines funktionellen Fußes, gemäß der Rutherford-Klassifikation¹³.
3. Vergleichen Sie den klinischen Schweregrad der Gliedmaßen-Ischämie, an der Basislinie im Vergleich zur Nachbeobachtung. Identifizieren Sie die Fälle, die aufgrund ungünstiger Ergebnisse einer größeren Amputation bedürfen.
4. Korrelieren Sie die Anzahl der MPC mit dem Anteil der Patienten, die eine größere Amputation der unteren Extremität benötigen.

Blutproben aus blockierten Arterien, an der für Angioplastie adressierten Stelle, wurden von 20 Diabetikern im Alter von 68 Jahren und 10 von 20 Männern entnommen. Die Hälfte der Stichprobenpopulation waren Raucher. Vaskuläre Läsionen wurden hauptsächlich als Rutherford Klasse VI bewertet; in der Erwägung, dass Patienten eine höhere Prävalenz von Typ-2-Diabetes Mellitus (100%), Bluthochdruck (70%) Dyslipidämie (55%).

Eine 30-tägige klinische Nachbeobachtung nach der Angioplastie der unteren Gliedmaßen wurde durchgeführt. Der Prozentsatz der MPC-Subpopulationen am Ausgangswert oder der Dynamik nach der Angioplastie korrelierte (Spearman-Analyse) mit dem Grad der endotheliaalen Dysfunktion, wie von der MKS bewertet; und die Ausgangsanzahl der MpC wurde zwischen Patienten verglichen, die sich nach der Angioplastie einer Gliedmaßenamputation unterziehen oder nicht (U-Mann Whitney). Die Studie zeigte, dass die Basis-MPCs-Subpopulation CD45+CD34+KDR+ negativ mit MKS korreliert(Abbildung 3A, links), während die Änderung der MPCs CD45+CD34+CD133+CD184+ nach Angioplastie signifikant mit der MKS-Verbesserung korreliert(Abbildung 3B, rechts). Darüber hinaus wurde bei den Patienten, die sich zu einer Gliedmaßenamputation entwickelten, eine erhöhte Ausgangsanzahl von MpC-Subpopulation-CD45+CD34+KDR+ (Abbildung 4A,B, links) beobachtet; sowie die Post-Angioplastie-Reduktion der MpC-Subpopulation CD45+CD34+CD133+CD184+ (Abbildung 4A,C, rechts).

Abbildung 1: Angiographie der unteren Gliedmaßen und Blutentnahme. (A) Gefäßbahn, die durch Kontrastmedien unter Fluoroskopie belegt wird. (B) Gefäßverstopfung vor Angioplastie. (C) Gefäßverstopfung nach Angioplastie. (D) Der Gefäßchirurg verwendet einen Katheter, um Blut vom nächstgelegenen Ort zur Gefäßverstopfung und Atherom-Plakette zu sammeln, und der Laborforscher ist bereit, die Blutprobe zu erhalten. Pfeile zeigen die Stelle von Gefäßverstopfungen an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Blutprobenvorbereitung und mononukleäre Vorläuferzellen (MPCs). (A) Dichtegradientenvorbereitung. (B) Lymphozyten Ringtrennung nach Blutzentrifugation. (C) Sammlung der Lymphozytenphase. (D) Zentrifugation. (E) Pelletbildung am Boden des Reagenzglases. (F) Anzahl der Zellenaufhängungen. (G) Vorbereitung von Lymphozyten zur Durchflusszytometrie. (H) Bestimmung der Zellsubpopulationen durch Durchflusszytometrie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Beziehung zwischen MpK mit hämodynamischen Indikatoren. (A) Position des Ultraschalls, um MKS und repräsentative Ergebnisse zu erhalten. (B) Beziehung zwischen Basiswerte %MPCs (links, CD45+CD34+KDR+; rechts, CD45+CD34+CD133+CD184+) und FMD-Basiswerten; sowie das Verhältnis von (C) %MPCs nach Angioplastie mit MKS-Verbesserung nach Angioplastie. Abkürzungen: MPCs, Mononukleare Progenitorzellen; MKS, Flow Mediated Dilation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: MPCs und Prognose der Amputation der unteren Gliedmaßen nach Angioplastie. (A) Repräsentative Durchflusszytometriebilder von MPCs-Subpopulationen. (B) Die Zuordnung der Basiswerte %MPCs (links, CD45+CD34+KDR+; rechts, CD45+CD34+CD133+CD184+), oder (C) %MPCs nach Angioplastie, mit Amputation der unteren Gliedmaßen nach Angioplastie, während einer 30-tägigen Nachbeobachtung. Abkürzungen: MPCs, Mononukleare Progenitorzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Akte 1: Rutherfords Klassifizierung der Schwere der Gliedmaßen-Ischämie. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren haben nichts zu verraten.