Exosomenisolierung nach in vitro Stoßwellentherapie

Zusammenfassung

Exosomen werden bei der In-vitro-Anwendung von Stoßwellen freigesetzt. Hier beschreiben wir, wie man Stoßwellen auf kultivierte Endothelzellen aufbringt und anschließend Exosomen für weitere Untersuchungen isoliert.

Zusammenfassung

Die Stoßwellentherapie wird routinemäßig bei orthopädischen Indikationen wie Tendinopathien wie lateraler Epicondylitis (Tennisarm) und Achillessehnenentzündung (Fersensporn) sowie bei nicht heilenden Wunden und Knochen angewendet. Die Kombination aus einer angiogenen und einer entzündungshemmenden Wirkung der Stoßwellentherapie führt trotz unterschiedlicher Krankheitsbilder zu einer Regeneration im Weichgewebe und in den Knochen. In über 30 Jahren klinischer Anwendung wurden keine Nebenwirkungen beobachtet. Darüber hinaus zeigte die Grundlagenforschung sogar regenerative Effekte auf das ischämische Myokard.

In einer früheren Arbeit konnten wir zeigen, dass der mechanische Stimulus von kultivierten Zellen über eine Exosomenfreisetzung in eine biologische Reaktion übersetzt wird. Der genaue Mechanismus muss jedoch noch geklärt werden. Bei der Anwendung der Stoßwellentherapie ist die mechanische Kopplung von entscheidender Bedeutung, da selbst kleine Luftblasen Stoßwellen absorbieren können. Die zuvor beschriebene Wasserbadmethode ist eine valide Methode, um eine adäquate und reproduzierbare Stoßwellenapplikation in vitro zu gewährleisten.

Wir waren in der Lage, ein praktikables und replizierbares Protokoll zur Isolierung von Exosomen aus kultivierten Zellen nach Stoßwellenanwendung zu entwickeln. Dabei zeigen wir eine Möglichkeit, die zugrundeliegenden Mechanismen der Mechanotransduktion sowie das regenerative und angiogene Potenzial von Stoßwellen-freigesetzten Exosomen zu untersuchen.

Einleitung

Schockwellen (SW) sind Schalldruckwellen, die in der Natur auftreten, wenn in kurzer Zeit eine hohe Energiemenge freigesetzt wird (z.B. Donner mit Blitz). In der klinischen Routine werden Stoßwellen in der Lithotripsie seit über 30 Jahren eingesetzt, um Nierensteine ohne relevante Nebenwirkungen zu zersetzen ^1,2. Zufällig wurde im Röntgenbild nach dem Zerfall des Nierensteins eine Verdickung des Beckenknochens beobachtet. Diese Beobachtung bildete die Grundlage für die Erforschung von Knochenheilungsstörungen und führte zur Behandlung von Pseudarthrosen an langen Knochen

Protokoll

Humane Endothelzellen der Nabelschnurvene wurden aus einem Kaiserschnitt an der Klinik für Gynäkologie gewonnen. Daher wurde die schriftliche Einverständniserklärung der Patienten eingeholt. Die Genehmigung erfolgte durch die Ethikkommission der Medizinischen Universität Innsbruck (Nr. UN4435).

HINWEIS: Arbeiten Sie unter einer sterilen Laminar-Flow-Haube, um eine Kontamination zu vermeiden.

1. 24 h vor dem Experiment

1. Bereiten Sie das exosomenfreie endotheliale Wachstumsmedium vor, indem Sie fötales Rinderserum (FCS) bei 4 °C und 120.000 x g über Nacht ultraz....

Ergebnisse

Unter Verwendung des beschriebenen Protokolls haben wir sowohl humane Endothelzellen (HUVECs) als auch humane Endothelzellen der Koronararterien (CAECs; PromoCell) bis hin zur Stoßwellentherapie (z. B. Orthowave 180c). Die freigesetzten Vesikel wurden mittels Nano-Tracking-Analyse (NTA) quantifiziert. Dabei konnten wir eine Zunahme der Mikrovesikelfreisetzung unter SW-Therapie beobachten (Abbildung 1A,B). Die Bildgebung von HUVECs-freigesetzten Vesikeln mittels Transmissions.......

Diskussion

In mehreren Grundlagenforschungsarbeiten konnte die regenerative Wirkung der Stoßwellentherapie nachgewiesen werden und wird routinemäßig in orthopädischen Indikationen angewendet ^3,4,5. In verschiedenen Tiermodellen konnte die regenerative Wirkung auf das ischämische Myokard nachgewiesen werden und zur Initiierung der CAST-HF-Studie führen ^9,10

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zellkulturflaschen	Zellentar	658170	75 cm2
Auffangröhrchen – Falcon Tube	Corning	352070
Wachstumsmedium für Endothelzellen-2 BulletKit	; Lonza	CC-3162
Basalmedium für das Wachstum von Endothelzellen	Lonza	CC-3121
Fötales Rinderserum	Sigma	F0804
Parafilm	Pechiney	PM996
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	gibco	14190-904
Stoßwellen-Applikator	MTS	Orthowave 180c