microRNAs sind an der Pathogenese der IgA-Nephropathie beteiligt. Wir haben eine zuverlässige Methode zum Nachweis der microRNA-Expression in den Nieren eines IgA-Nephropathie-Mausmodells (HIGA-Mäuse) entwickelt. Diese neue Methode wird es erleichtern, die Beteiligung von miRNAs an der IgA-Nephropathie zu überprüfen.
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Methodenartikel
Nachweis der MicroRNA-Expression in den Nieren von Immunglobulin A nephropathischen Mäusen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Immunglobulin-A-Nephropathie (IgA) ist eine Form der primären Glomerulonephritis, die durch eine abnorme Ablagerung von IgA gekennzeichnet ist und zum Nierenversagen im Endstadium führt. In den letzten Jahren wurde über die Beteiligung von microRNAs (miRNAs) an der Pathogenese der IgA-Nephropathie berichtet. Es gibt jedoch keine etablierte Methode zur Profilierung von miRNAs in der IgA-Nephropathie anhand von Kleintiermodellen. Daher haben wir eine zuverlässige Methode zur Analyse von miRNA in der Niere eines IgA-Mausmodells (HIGA-Maus) entwickelt. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die veränderten Expressionsniveaus von miRNAs in den Nieren von HIGA-Mäusen im Vergleich zu den Konzentrationen in den Nieren von Kontrollmäusen nachzuweisen. Kurz gesagt besteht diese Methode aus vier Schritten: 1) Gewinnung von Nierenproben von HIGA-Mäusen; 2) Aufreinigung der Gesamt-RNA aus Nierenproben; 3) Synthese komplementärer DNA aus Gesamt-RNA; und 4) quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) von miRNAs. Mit dieser Methode konnten wir erfolgreich die Expressionsniveaus mehrerer miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p und miR-21-5p) in den Nieren von HIGA-Mäusen nachweisen. Diese neue Methode kann auch auf andere Studien zur Profilierung von miRNAs bei IgA-Nephropathie angewendet werden.
Einleitung
Die Immunglobulin A (IgA)-Nephropathie ist eine Form der primären Glomerulonephritis, die durch eine abnorme Ablagerung von IgA in der glomerulären Mesangialregion der Nieren gekennzeichnet ist 1,2. Sie ist die häufigste der primären Glomerulonephritis und führt bei 20–40 % der Patienten zu Nierenversagen im Endstadium2. Die Ursache ist noch unbekannt, aber eine anhaltende Schleimhautentzündung wurde in Verbindung gebracht 1,3. Kortikosteroide, Immunsuppressiva und Inhibitoren des Renin-Angiotensin-Systems wurden als therapeutis....
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Protokoll
Tierversuche wurden von der Tierethikkommission der Jichi Medical University genehmigt und entsprechen den Richtlinien für die Verwendung und Pflege von Versuchstieren aus dem Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.
1. Gewinnung von Nierenproben von HIGA-Mäusen
HINWEIS: HIGA-Mäuse zeigen nach einem Alter von 25 Wochen einen stabilen Phänotyp der IgA-Nephropathie 8,9,10,11. Als Kontrollgruppesollten Balb/c-Mäuse 8,9,10,11 ausgewählt werden.....
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Ergebnisse
Wir untersuchten die Expression von miRNAs in den Nieren von HIGA-Mäusen (n=10). Dieses Ergebnis wurde vollständig auf der Grundlage des beschriebenen Protokolls erzielt. Als Kontrolle wurden die Nieren von Balb/c-Mäusen ausgewählt (n=10). In beiden Gruppen wurde ein Alter von 25 Wochen ausgewählt. Nur weibliche HIGA-Mäuse waren beim Lieferanten erhältlich. Die Expressionsniveaus von drei miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p und miR-21-5p; Abbildung 1) festgestellt, die zuvor mit einer IgA-Nephro.......
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Diskussion
Mit dieser neuen Methode konnten wir die Expression von miRNAs in den Nieren eines IgA-Nephropathie-Mausmodells (HIGA-Mäuse) messen. Die IgA-Nephropathie ist eine ungeklärte Erkrankung, die weiterer Forschung bedarf, um ihre Ätiologie und ihre therapeutischen Ziele zu klären 1,3. Die Gewinnung menschlicher Nierenproben ist jedoch sehr invasiv. Diese neue Technik hat insofern den Vorteil, als sie die Untersuchung der IgA-Nephropathie an Kleintieren ermöglicht und .......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Danksagungen
Wir danken Sarah Williams, PhD, von der Edanz Group (www.edanzediting.com) für die Bearbeitung eines Entwurfs dieses Manuskripts.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| BALB/cCrSlc (25 Wochen alt, weiblich) | Japan SLC, Inc. | keine | Maus zur Steuerung |
| HIGA/NscSlc (25 Wochen alt, weiblich) | Japan SLC, Inc. | keine | IgA-Nephropathie Mausmodell |
| MicroAmp Optische 96-Well-Reaktionsplatte für qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-Well-Reaktionsplatte |
| MicroAmp Optischer Klebefilm | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Klebefolie für 96-Well-Reaktionsplatte |
| miScript II RT-Kit | Qiagen | 218161 | Experimentierkit für die Synthese von cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Experimentierkit für die Extraktion von miScript |
| Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | miRNA-spezifischer Primer |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | miRNA-spezifischer Primer |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | miRNA-spezifischer Primer |
| miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | miRNA-spezifischer Primer |
| miScript SYBR Green PCR-Kit | Qiagen | 218073 | Experimentierkit für Echtzeit-PCR |
| QIA-Shredder | Qiagen | 79654 | Spin-Säule zur Biopolymer-Zerkleinerung |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR-System | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR-Gerät |
| QuantStudio 12K Flex Software Version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Software für Echtzeit-PCR-Instrumente |
| Takara Biomasher Standard | Takara Bio | 9790B | Silizium-Homogenisator |
Referenzen
- Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. IgA Nephropathy. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).
- Szeto, C. C., Li, P. K. MicroRNAs in IgA nephropathy. Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).
- Wyatt, R. J., Julian, B. A.
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Nachdrucke und Genehmigungen
