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Methodenartikel

Etablierung des Transkriptionsprofils von psoriasiformen kutanen in vitro unter Verwendung von HaCaT-Zellen, die mit einer Kombination von Zytokinen stimuliert wurden

5K Ansichten

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DOI:

10.3791/61537

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15. März 2021

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1State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, West China Medical School, Sichuan University and Collaborative Innovation Center for Biotherapy, 2Department of Cardiovascular Medicine, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird eine Methode zur Etablierung eines in vitro psoriasiformen kutanen Entzündungsmodells auf Transkriptionsebene unter Verwendung einer Kombination von fünf Zytokinen (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) auf HaCaT-Zelllinie vorgestellt.

Zusammenfassung

Psoriasis ist eine häufige chronisch entzündliche Hauterkrankung, die durch ein angeborenes und adaptives Immunsystem vermittelt wird und durch eine abnormale Proliferation und Differenzierung der epidermalen Keratinozyten und eine Infiltration von Entzündungszellen gekennzeichnet ist. Hautspezifische Keratinozyten sind wichtige Akteure der angeborenen Immunität, reagieren auf Immunzellen und Umweltreize und spielen damit eine wichtige Rolle bei der Immunpathogenese der Psoriasis. Hier stellen wir eine Methode zur Induktion einer psoriasiformen Keratinozytenentzündung auf Transkriptionsebene mit HaCaT-Zelllinie unter Verwendung von fünf proinflammatorischen Zytokinkombinationen (M5-Kombination) vor, darunter IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α und Oncostatin M. Die Ergebnisse zeigen, dass M5-Kombinations-induzierte HaCaT-Zellen erhöhte Spiegel an antimikrobiellen Peptiden (BD2, S100A7, S100A8 und S100A9), Chemokinen und Zytokinen (CXCL1, CXCL2, CXCL8, CCL20, IL-1β, IL-6 und IL-18). Die mRNA-Spiegel der Keratinozyten-Differenzierungsmarker (Keratin1, Keratin10, Filaggrin und Loricrin) waren herunterreguliert, was mit den Transkriptomdaten übereinstimmte, die von Psoriasis-ähnlichen Keratinozyten abgeleitet wurden. Die hier beschriebene Methode etabliert daher in vitro eine psoriasiforme Hautentzündung auf Transkriptionsebene und trägt zur Erforschung der molekularen Pathogenese der Psoriasis bei.

Einleitung

Psoriasis ist eine häufige, nicht ansteckende chronisch-entzündliche Hauterkrankung, die durch eine fehlregulierte Immunantwort ausgelöst wird und die Keratinozyten betrifft, die überwiegend die Epidermisbilden 1, und die durch eine ungewöhnlich schnelle Vermehrung von Keratinozyten mit Hyperkeratose und Parakeratose gekennzeichnet ist. Psoriasis betrifft etwa 3 % der weltwilden Population2. Die Krankheitslast wird durch verschiedene Komorbiditäten weiter erhöht, darunter Herz-Kreislauf-Erkrankungen und das metabolische Syndrom, das durch das Syndromverursacht wird 3.

Die Epidermis besteht aus fünf Schichten von Keratinozyten, die sich morphologisch mit dem Differenzierungsprozess verändern: das Stratum basal, das Stratum spinosum, das Stratum granulosum, das Stratum lucidum (zu finden an Handflächen und Fußsohlen) und das Stratum corneum, die hier von der inneren zur äußeren Oberfläche beschriebenwerden 4. Eine Veränderung der Epidermisdifferenzierung führt zu einer gestörten Hautbarriere, die für die Pathogenese entzündlicher Hauterkrankungen wichtig ist 5,6,7,8. Keratinozyten spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung einer intakten epidermalen Barriere, um Wasserverlust zu verhindern und Umwelteinflüsse wie UVB-Exposition, Allergene und Krankheitserregerzu bekämpfen 9. Gesunde Menschen zeigen ein Gleichgewicht zwischen der Proliferation der Basalzellen und der Abschuppung des Stratum corneum, während mehrere Hautkrankheiten, einschließlich Psoriasis, durch ein Ungleichgewicht dieses komplexen Mechanismus gekennzeichnet sind10.

Keratinozyten bilden nicht nur die Barrierefunktion, sondern sind auch ein wichtiger Bestandteil des Immunsystems der Haut. In den Immunpathogenesen der Psoriasis führt die Aktivierung von hautresidenten Typ-1-T-Helferzellen (Th1) und Typ-17-T-Helferzellen (Th17) zu einer erhöhten Produktion von IFN-γ bzw. IL-17A. Diese Zytokine induzieren eine erhöhte Synthese von Chemokinen (CCL20, CXCL1/2/8/9/10/11), antimikrobiellen Peptiden (BD2, LL37, S100A7/8/9/12) und anderen Entzündungsfaktoren (TNF-α, IL-6, IFN-β) in Keratinozyten, was zur Rekrutierung von mehr Th1, Th17 und Neutrophilen in die Haut führt, wodurch die IL-17/IL23-Achse weiter verstärktwird 11. Die Wechselwirkung zwischen Keratinozyten und Immunzellen ist für die Induktion und Aufrechterhaltung der Psoriasisverantwortlich 11.

Komplexe Zytokinnetzwerke wurden bei Psoriasis beschrieben, und die zentrale Rolle von proinflammatorischen Zytokinen (wie IL-23, IL-22, IL-17, IL-1α, Oncostatin M (OSM) und TNF-α), die durch die Infiltration von Immunzellen produziert werden, wurde hervorgehoben12,13. In der Tat haben frühere Studien gezeigt, dass erhöhte Spiegel von IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α und OSM in vitro ein Profil von psoriasiformen Keratinozyten auf normalen menschlichen epidermalen Keratinozyten induzierten14.

Immortale Keratinozyten-Zelllinien (HaCaT), die leichter zu gewinnen und zu kultivieren sind als primäre Keratinozyten mit besserer Reproduzierbarkeit, wurden häufig für die Untersuchung von Psoriasisverwendet 15,16,17,18,19,20. Im Gegensatz zu humanen Papillomavirus16 E6/E7-transformierten HEK001- und KerTr-Zellen ist die HaCaT-Zelllinie in der Lage, Differenzierungsgenprodukte zu exprimieren, einschließlich Keratin1 (KRT1), Keratin10 (KRT10), Loricrin und Filaggrin 20,21,22, wodurch sie ein vielversprechendes Werkzeug ähnlich wie primäre Keratinozyten zur Untersuchung der Regulation von Keratinisierung und Proinflammation darstellen.

KRT5/14 ist das Hauptkeratinpaar vom Typ I und Typ II, das in proliferativen basalen Keratinozyten exprimiert wird, während differenzierte Keratinozyten in den suprabasalen Schichten KRT5/14 herunterregulieren und KRT1/10 als Hauptkeratinpaar exprimieren23. Beim Vergleich der Psoriasis-Läsion mit gesunder Haut umfassten die Veränderungen der Keratinexpression eine Abnahme von KRT1/1024,25 und eine Zunahme von KRT5/14 in der Psoriasis-Epidermis26, gekennzeichnet durch Hyperproliferation und Parakeratose27. Loricrin ist ein terminaldifferenzierendes Strukturprotein, das mehr als 70 % der verhornten Hülle ausmacht und zur Schutzbarriere des Stratum corneumbeiträgt 28, die in der Haut von Psoriasis-Patienten herunterreguliertwird 29. Filaggrin wird in den letzten Stadien der Keratinozytendifferenzierung exprimiert und ist an der Aggregation einer gerüstartigen verhornten Hüllebeteiligt 30, verminderte Expression in der Haut von Psoriasis-Läsionen29.

Insgesamt war es unser Ziel, ein inflammatorisches Keratinozytenmodell in HaCaT-Zellen unter Verwendung einer Zytokinkombination zu generieren, die in der Lage sein wird, einige Merkmale von Psoriasis-Hautläsionen, einschließlich der Initiierung einer Immunantwort, der Proliferation von Keratinozyten und der Differenzierung, synergistisch zu rekapitulieren.

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Protokoll

Führen Sie die Schritte 1 bis 3 unter sterilen Bedingungen durch. Das gesamte Kulturmedium enthielt 0,1 mg/ml Penicillin und Streptomycin.

1. Vorbereitung der Zellen

  1. 1 x 106 HaCaT-Zellen in 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) in einer 100 mm Zellkulturschale. Inkubieren Sie die Kulturschale bei 37 °C in einem befeuchteten 5 %CO 2 -Inkubator für 2 Tage.
  2. Wenn die Kultur eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht, nehmen Sie das Medium vorsichtig aus der Kulturschale und waschen Sie die Zellen mit 5 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Schütteln Sie die Kulturschale vorsichtig von Hand.
  3. Entfernen Sie PBS und geben Sie 2 ml 0,25% ige Trypsin-EDTA-Lösung in die Zellen. Schütteln Sie die Kulturschale vorsichtig, damit die Lösung die Monoschicht der Zellen vollständig bedecken kann.
  4. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Inkubator für 5 Minuten, bis sich die Zellen unter Phasenkontrastmikroskopie sichtbar von der Oberfläche der Kulturschale gelöst haben.
    HINWEIS: Die Morphologie der Zellen sollte rund erscheinen. Wenn die Zellen nicht gut abgelöst sind, inkubieren Sie für einen zusätzlichen Zeitraum von 5 Minuten unter manuellem Rühren.
  5. Sobald die Zellen abgelöst sind, fügen Sie 5 ml DMEM plus 10 % FBS hinzu, um Trypsin zu inaktivieren, und sammeln Sie die Zellsuspension mit einer Pipette in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
  6. Das Röhrchen mit der Zellsuspension bei 180 x g für 5 min zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand.
  7. Geben Sie 10 mL DMEM plus 10 % FBS-Medium zum Pellet und pipettieren Sie das Medium vorsichtig auf und ab, um die Zellen in Suspension zu bringen.

2. Zellaussaat in der 6-Well-Platte

  1. Aussaat der Zellen mit einer Dichte von 2,0 x 105 Zellen/Well in einer 6-Well-Kulturplatte.
  2. Inkubieren Sie die 6-Well-Kulturplatte bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Inkubator über Nacht, bevor Sie die M5-Kombinationsstimulation durchführen, damit die Zellen an der Platte haften bleiben.

3. M5-Stimulation von HaCaT-Zellen

  1. Bereiten Sie ein M5-Zytokin-Kombinationsmischmedium vor, das 10 ng/ml rekombinantes IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α und Oncostatin M-Protein in DMEM mit 2 % FBS enthält.
    HINWEIS: Die M5-Kombination bestand aus einer Rekombination von IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α und Oncostatin M. Die synergistische Wirkung der M5-Kombination rekapituliert einige Merkmale der Psoriasis, wie die Hochregulierung von Chemokinen und die Produktion antimikrobieller Peptide31.
  2. Entfernen Sie nach der Zellkultur über Nacht den Überstand und pipettieren Sie 2 ml M5-Kombinationsmischmedium in jede Vertiefung.
  3. Kultivieren Sie die Zellen weiter; Die Zelllysate wurden nach 24 h für die mRNA-Quantifizierung (Schritt 4) entnommen oder der Kulturüberstand wurde nach 48-72 h für die Bestimmung der Zytokinspiegel mit dem ELISA-Assay 32,33,34,35,36,37 (Schritt 6) entnommen.

4. Ernte von mRNA von M5-stimulierten HaCaT-Zellen

  1. Aspirieren Sie das M5-Kombinationsmischmedium und waschen Sie es einmal mit 1-2 mL kaltem PBS.
  2. Aspirieren Sie PBS und geben Sie 1 ml handelsübliche Guanidiumisothiocyanatlösung direkt in die Kulturschale, um die Zellen zu lysieren.
  3. Pipettieren Sie das Lysat mehrmals auf und ab, um es zu homogenisieren und in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. 5 Min. bei Raumtemperatur ruhen lassen.
  4. 200 μl Chloroform zugeben, das Röhrchen ca. 20 s kräftig schütteln und die Probe 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  5. Zentrifugieren bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C.
  6. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein frisches 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  7. 500 μl Isopropanol in die wässrige Phase geben und vorsichtig mischen. 5 Min. bei Raumtemperatur ruhen lassen.
  8. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 15 min bei 4 °C.
  9. Aspirieren Sie Isopropanol und fügen Sie 1 ml 75%iges Ethanol hinzu. Waschen Sie das Pellet einmal.
  10. Zentrifugieren Sie bei 7.500 x g für 5 min bei 4 °C. Gießen Sie das Ethanol ab und lassen Sie die Pellets an der Luft trocknen.
  11. Geben Sie 30 μl DEPC-behandeltes Wasser in das RNA-Pellet. Bereiten Sie sich auf den RT-PCR-Nachweis vor.

5. Analyse der mRNA-Expression mittels Real-Time PCR

  1. Führen Sie die cDNA-Synthese mit 1 μg Gesamt-RNA unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
    HINWEIS: 1 μg Gesamt-RNA für den SYBR Green RT-PCR-Assay.
  2. Bereiten Sie das PCR-Reaktionsgemisch vor. 12,5 μl SYBR-Premix EX Taq II, 1 μl PCR Forward Primer (10 μM), 1 μl PCR Reverse Primer (10 μM), 2 μg cDNA und 8,5 μl dH2O. Das Endvolumen beträgt 25 μl pro Reaktion.
    HINWEIS: Eine Liste der Primersequenzen von Genen, die in dieser Studie für die RT-PCR-Analyse verwendet wurden, ist in Tabelle 1 aufgeführt.
  3. Im Thermocycler inkubieren. Die Zyklusbedingungen umfassten einen Denaturierungsschritt bei 95 °C für 30 s, 40 Zyklen bei 95 °C für 5 s, 60 °C für 30 s, 72 °C für 20 s und eine Schmelzkurvenanalyse.
  4. Analysieren Sie RT-PCR-Experimentdaten, indem Sie relative Unterschiede in der Genexpression von Ct-Werten (Schwellenwert) unter Verwendung von 2-ΔΔCT-Gleichungenberechnen. Verwenden Sie β-Aktin als interne Kontrolle für die relative quantitative Standardisierung der Genexpression in der RT-PCR.

6. Entnahme des Zellkulturüberstands für den ELISA

  1. Pipettieren Sie jedes Zellkulturmedium in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Zentrifugieren Sie bei 1500 x g für 10 min bei 4 °C.
  3. Den Überstand aliquotieren und sofort bei -80 °C lagern.

7. Analyse der Zytokinexpression mittels ELISA

  1. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um alle Reagenzien, den Arbeitsstandard und die Proben vorzubereiten. Eine dreifache serielle Verdünnung von Standard mit Probenverdünnungsmittel im Bereich von 2.000 bis 2,74 pg/ml. Proben 1:2 mit Probenverdünnungsmittel verdünnen.
  2. Fügen Sie 100 μl Standard und Probe pro Vertiefung hinzu. Decken Sie die Vertiefungen mit dem Deckel ab und verschließen Sie die Platte mit Paraffinfolie. 2,5 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Nach 2,5 h die Lösung verwerfen. Geben Sie 300 μl Waschpuffer für 3 Minuten in jede Vertiefung der Platte und aspirieren Sie. Wiederholen Sie den Vorgang vier weitere Male. Nach dem letzten Waschen drehen Sie die Platte um und klopfen Sie auf saugfähiges Papier, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen.
  4. Geben Sie 100 μl der Nachweis-Antikörperlösung in jede Vertiefung. Die Platte auf einem Shaker 2 h bei 37 °C inkubieren.
    HINWEIS: Biotinylierte Nachweis-Antikörperlösung wird in jedem ELISA-Kit hergestellt.
  5. Aspirieren und waschen Sie jede Vertiefung der Platte fünfmal mit 300 μl Waschpuffer. Nach dem letzten Waschen die Platte umdrehen und auf saugfähiges Papier klopfen, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen.
  6. Geben Sie 100 μl HRP-Streptavidin-Konjugat in jede Vertiefung. 45 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren.
  7. Verwerfen Sie die Lösung, indem Sie sie nach der Inkubation mit einer Pipette aspirieren. Waschen Sie jede Vertiefung der Platte fünfmal mit 300 μl Waschpuffer. Nach dem letzten Waschen drehen Sie die Platte um und klopfen Sie auf das saugfähige Papier, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen.
  8. Führen Sie die Detektion durch, indem Sie 100 μl TMB-Substrat in jede Vertiefung geben. 30 min bei 37 °C im Dunkeln inkubieren.
  9. Geben Sie 50 μl Stopplösung, wenn sich die Farbe entwickelt, in jede Vertiefung. Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Sofort bei 450 nm ablesen.

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Ergebnisse

Die M5-Kombinationsstimulation induzierte eine Entzündungsreaktion von HaCaT-Zellen.
HaCaT-Zellen wurden mit oder ohne M5-Zytokin-Kombination für 24 h stimuliert. Die mRNA-Expression von Psoriasis-bezogenen Genen, die an der Regulation der Immun- und Entzündungschemokine und antimikrobiellen Peptide beteiligt sind, wurde untersucht. Die neutrophilen Chemokine CXCL138, CXCL239, CXCL8

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Diskussion

Hierin wird ein Verfahren beschrieben, bei dem fünf Zytokinkombinationen (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) in HaCaT-Zelllinie verwendet werden, um ein in vitro psoriasiformes kutanes Entzündungsprofil auf Transkriptionsebene zu etablieren. Dieses Protokoll kann für die Untersuchung des Mechanismus von Genen in der Pathogenese der Psoriasis sowie für das Screening von therapeutischen Medikamenten gegen Psoriasis angepasst werden. Jüngste Berichte haben gezeigt, dass die Überexpression vo...

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Offenlegungen

Die Autoren berichteten von keinem potenziellen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China unterstützt [81703132, 31271483, 81472650, 81673061, 81573050, 31872739 und 81601462]

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEM– Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11965092
fötales RinderserumGibco10100139C
HaCaT-ZellenChina Center for Type CultureCollectionGDC0106Weniger als 15 Generationen
Menschliches IL-1β ELISA-KitBeyotimePI305
IL-6 ELISA KitBeyotimePI330
Human IL-8 ELISA KitBeyotimePI640
IL-1 alpha HumanProspecCYT-253Rekombinantes Protein
IL-17 HumanProspecCYT-250Rekombinantes Protein
IL-22 HumanProspecCYT-328Rekombinantes Protein
OSM HumanProspecCYT-231Rekombinantes Protein
PBSGibco10010049pH 7,4
Penicillin-StreptomycinGibco15140163
PrimeScrip RT ReagenzienkitTAKARARR047A
TB Grün Premix Ex TaqTAKARARR420A
TNF alpha MenschProspecCYT-223Rekombinantes Protein
TRIzo ReagenzInvitrogen15596018
Trypsin-EDTA (0,25%), PhenolrotGibco25200072
Human

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