Kernisolierung aus frischen gefrorenen Hirntumoren für Einzelkern-RNA-seq und ATAC-seq

Summary

Intratumorale Heterogenität ist ein inhärentes Merkmal von Tumoren, einschließlich Gliomen. Wir haben ein einfaches und effizientes Protokoll entwickelt, das eine Kombination aus Puffern und Gradientenzentrifugation verwendet, um einzelne Kerne aus frischem gefrorenem Gliomgewebe für Einzelkern-RNA- und ATAC-Sequenzierungsstudien zu isolieren.

Abstract

Adulte diffuse Gliome weisen Inter- und Intratumorheterogenität auf. Bis vor kurzem konzentrierte sich die Mehrheit der groß angelegten molekularen Profiling-Bemühungen auf Massenansätze, die zur molekularen Klassifizierung von Hirntumoren führten. In den letzten fünf Jahren haben Einzelzellsequenzierungsansätze mehrere wichtige Merkmale von Gliomen hervorgehoben. Die meisten dieser Studien haben frische Hirntumorproben verwendet, um einzelne Zellen mit Durchflusszytometrie oder Antikörper-basierten Trennmethoden zu isolieren. In Zukunft wird die Verwendung von frisch gefrorenen Gewebeproben aus Biobanken eine größere Flexibilität für Einzelzellanwendungen bieten. Darüber hinaus wird die nächste Herausforderung mit dem Fortschreiten des Einzelzellfeldes darin bestehen, Multi-Omics-Daten entweder aus einer einzelnen Zelle oder derselben Probenvorbereitung zu generieren, um die Tumorkomplexität besser zu entschlüsseln. Daher werden einfache und flexible Protokolle, die die Datengenerierung für verschiedene Methoden wie Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) und Single-Nucleus-Assay für Transposase-Accessible Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (snATAC-seq) ermöglichen, für das Feld wichtig sein.

Jüngste Fortschritte im Einzelzellbereich in Verbindung mit zugänglichen mikrofluidischen Instrumenten wie der 10-fachen Genomik-Plattform haben Einzelzellanwendungen in Forschungslabors erleichtert. Um die Heterogenität von Hirntumoren zu untersuchen, haben wir ein verbessertes Protokoll zur Isolierung einzelner Kerne aus frischen gefrorenen Gliomen entwickelt. Dieses Protokoll führt bestehende Einzelzellprotokolle zusammen und kombiniert einen Homogenisierungsschritt, gefolgt von Filtration und puffervermittelter Gradientenzentrifugation. Die resultierenden Proben sind reine Einzelkernsuspensionen, die verwendet werden können, um Einzelkern-Genexpression und Chromatin-Zugänglichkeitsdaten aus derselben Kernpräparation zu generieren.

Introduction

Diffuse niedriggrade Gliome (LGG), der häufigste primäre Hirntumor bei Erwachsenen, sind infiltrative Neoplasmen, die häufig in der Gehirnhemisphäre auftreten. LGGs weisen sowohl inter- als auch intratumorale Heterogenität auf, die nicht nur von der Tumorpopulation, sondern auch von den nicht-malignen Zellen angetrieben^wird,die an der Tumorentwicklung und -progression beteiligt sind¹,^2,3,4,5.

In den letzten zehn Jahren gab es eine Lawine genomischer Daten, die im Bereich der Glio....

Protocol

Frische gefrorene Gliomproben wurden aus der Gewebebank des Nationalen Zentrums für Tumorerkrankungen (NCT) in Heidelberg gewonnen. Die Verwendung von Patientenmaterial wurde vom Institutional Review Board der Medizinischen Fakultät Heidelberg genehmigt und die Einwilligung aller in die Studie einbezogenen Patienten eingeholt.

1. Experimentelle Vorbereitung

1. Führen Sie alle Schritte auf Eis oder bei 4 °C durch.
2. Vorkühlschläuche, Geschirr, Rasierklingen, Douncer und Stößel auf 4 °C.
3. Bereiten Sie alle Puffer im Voraus vor. Diese Puffer sind bei Raumtemperatur stabil. Sterilfiltration wird empfohlen, insbesondere f....

Results

Die Einzelkerngenomik ist ein sich entwickelndes Feld mit begrenzten Daten und Protokollen. Ein kritischer Faktor, der das Ergebnis von Einzelkernassays beeinflusst, ist die Isolierung reiner und intakter Kerne. Wir haben zwei veröffentlichte Protokolle (DroNc-seq- und Omni-ATAC-seq-Protokolle) kombiniert, um in relativ kurzer Zeit hochwertige und reine Kerne aus frischen gefrorenen Gliomgewebeblöcken zu isolieren und so die Stabilität der Transkripte zu erhalten (Abbildung 1).

Discussion

Das Gebiet der intratumoralen Heterogenität befindet sich in einem spannenden Stadium, wobei neuartige Assays und Plattformen entwickelt werden, um das vorhandene Wissen herauszufordern und zu erweitern. Intratumorale Heterogenität ist ein entscheidender Faktor, der zum Fortschreiten der Krankheit und zur Resistenz gegen die derzeitigen Behandlungsmodalitäten bei Gliomen beiträgt²⁸. Jüngste Studien zu Hirntumoren haben sich auf diesen wichtigen Aspekt^{konzentriert,}indem sie einzellige tr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma	M6250
CaCl2	Sigma	21115-100ML
Dounce Homogenisator	Aktives Motiv	40401
EDTA (0,5 M)	Thermo Scientific	R1021
Falcon 15 mL konische Zentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	352096
Iodixanol (aka Optiprep)	Stammzelltechnologien	07820
MACs Smart Strainers (30 & Mikro; m)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS SmartStrainers (100 & Mikro; m)	Miltenyi Biotec	130-098-463
Mg(Ac)2	Sigma	63052-100ML
NP-40	Abcam	ab142227
Zellkern-Isolationskit: Nuclei EZ Prep	Sigma	NUC101-1KT
Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)	Sigma	P7626
Vorabscheidungsfilter (20 & Mikro; m)	Miltenyi Biotec	130-101-812
Safe Lock Röhrchen 1,5 mL	Eppendorf	0030120086
Safe Lock Röhrchen 2,0 mL	Eppendorf	0030120094
Einzelzell ATAC	10x Genomik
Einzelzell-Genexpression	10x Genomik
Saccharose	Sigma	S0389
Pipettenspitzen mit breiter Bohrung (1000 & Mikro; L)	Themo Fisher Scientific	2079GPK
Pipettenspitzen mit breiter Bohrung (200 & Mikro; L)	Themo Fisher Scientific	2069GPK