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Methodenartikel

Kernisolierung aus frischen gefrorenen Hirntumoren für Einzelkern-RNA-seq und ATAC-seq

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DOI:

10.3791/61542

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25. August 2020

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1Neurology Clinic and National Center for Tumor Diseases, University Hospital Heidelberg, 2Bioinformatics and Omics Data Analytics, German Cancer Research Center (DKFZ), 3Clinical Cooperation Unit Neurooncology, German Cancer Research Center (DKFZ), 4Division of Experimental Neurosurgery, Department of Neurosurgery, University of Heidelberg, INF 400, Heidelberg, Germany

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Intratumorale Heterogenität ist ein inhärentes Merkmal von Tumoren, einschließlich Gliomen. Wir haben ein einfaches und effizientes Protokoll entwickelt, das eine Kombination aus Puffern und Gradientenzentrifugation verwendet, um einzelne Kerne aus frischem gefrorenem Gliomgewebe für Einzelkern-RNA- und ATAC-Sequenzierungsstudien zu isolieren.

Zusammenfassung

Adulte diffuse Gliome weisen Inter- und Intratumorheterogenität auf. Bis vor kurzem konzentrierte sich die Mehrheit der groß angelegten molekularen Profiling-Bemühungen auf Massenansätze, die zur molekularen Klassifizierung von Hirntumoren führten. In den letzten fünf Jahren haben Einzelzellsequenzierungsansätze mehrere wichtige Merkmale von Gliomen hervorgehoben. Die meisten dieser Studien haben frische Hirntumorproben verwendet, um einzelne Zellen mit Durchflusszytometrie oder Antikörper-basierten Trennmethoden zu isolieren. In Zukunft wird die Verwendung von frisch gefrorenen Gewebeproben aus Biobanken eine größere Flexibilität für Einzelzellanwendungen bieten. Darüber hinaus wird die nächste Herausforderung mit dem Fortschreiten des Einzelzellfeldes darin bestehen, Multi-Omics-Daten entweder aus einer einzelnen Zelle oder derselben Probenvorbereitung zu generieren, um die Tumorkomplexität besser zu entschlüsseln. Daher werden einfache und flexible Protokolle, die die Datengenerierung für verschiedene Methoden wie Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) und Single-Nucleus-Assay für Transposase-Accessible Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (snATAC-seq) ermöglichen, für das Feld wichtig sein.

Jüngste Fortschritte im Einzelzellbereich in Verbindung mit zugänglichen mikrofluidischen Instrumenten wie der 10-fachen Genomik-Plattform haben Einzelzellanwendungen in Forschungslabors erleichtert. Um die Heterogenität von Hirntumoren zu untersuchen, haben wir ein verbessertes Protokoll zur Isolierung einzelner Kerne aus frischen gefrorenen Gliomen entwickelt. Dieses Protokoll führt bestehende Einzelzellprotokolle zusammen und kombiniert einen Homogenisierungsschritt, gefolgt von Filtration und puffervermittelter Gradientenzentrifugation. Die resultierenden Proben sind reine Einzelkernsuspensionen, die verwendet werden können, um Einzelkern-Genexpression und Chromatin-Zugänglichkeitsdaten aus derselben Kernpräparation zu generieren.

Einleitung

Diffuse niedriggrade Gliome (LGG), der häufigste primäre Hirntumor bei Erwachsenen, sind infiltrative Neoplasmen, die häufig in der Gehirnhemisphäre auftreten. LGGs weisen sowohl inter- als auch intratumorale Heterogenität auf, die nicht nur von der Tumorpopulation, sondern auch von den nicht-malignen Zellen angetriebenwird,die an der Tumorentwicklung und -progression beteiligt sind1,2,3,4,5.

In den letzten zehn Jahren gab es eine Lawine genomischer Daten, die im Bereich der Gliome gesammelt wurden. Diese Daten stammen hauptsächlich aus Massentumorsequenzierungsstudien und haben immens zur molekularen Charakterisierung und der aktuellen Klassifizierung von Hirntumoren5,6,7,8,9,10,11beigetragen . Obwohl diese Studien die breite molekulare Landschaft im Zusammenhang mit Gliomen aufzeigten, gibt es immer noch einen enttäuschenden Mangel an Fortschritten bei der therapeutischen Intervention. Eines der Hindernisse für die Behandlungsresistenz bei Hirntumoren ist die Intratumorheterogenität. Um dieses Problem anzugehen, haben sich verschiedene Studien auf die genomische, transkriptomische, proteomische und epigenetische Heterogenität konzentriert, die in einem Tumor auf Einzelzellebene vorhanden ist12,13,14,15,16,17.

Obwohl es in den letzten Jahren bemerkenswerte technologische Fortschritte im Einzelzellbereich gegeben hat, ist einer der wichtigsten einschränkenden Faktoren die Verfügbarkeit frischer Proben, die benötigt werden, um die Zellen zu isolieren und diese Experimente durchzuführen. Um diese Einschränkung zu überwinden, gab es mehrere erfolgreiche Versuche, Assays wie snRNA-seq und snATAC-seq aus gefrorenem Gewebe durchzuführen, wobei Kerne anstelle von Zellen verwendet wurden18,19. Die meisten dieser Methoden basieren entweder auf fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) oder Filtrationsstrategien. Sowohl Einzelzell- als auch Einzelkernansätze haben ihre Stärken und Nachteile. Einzelzellansätze pflegen mitochondriale Transkripte, die zwar informativ sein können, aber aufgrund ihrer hohen Häufigkeit auch die Transkriptomabdeckung reduzieren können. Einzelkernisolationsansätze eliminieren einen hohen Prozentsatz der mitochondrialen Fraktion, wodurch eine tiefergehende Abdeckung der Kerntranskripte ermöglichtwird 20.

Es gibt verschiedene kommerziell verfügbare Plattformen, die in den letzten Jahren verwendet wurden, um Einzelzellgenomikdaten zu untersuchen, einschließlich RNA-seq und ATAC-seq. Eine der bekanntesten Plattformen ist die 10x Genomics Chromium-Plattform für einzellige Genexpression und Einzelzell-ATAC-Profiling. Da die Plattform mit Hilfe von mikrofluidischen Kammern arbeitet, können Ablagerungen oder Aggregate das System verstopfen, was zum Verlust von Daten, Reagenzien und wertvollen klinischen Proben führt. Daher hängt der Erfolg von Einzelzellstudien weitgehend von der genauen Isolierung einzelner Zellen/Kerne ab.

Das Protokoll, das wir hier demonstrieren werden, ist eine leicht modifizierte Kombination der Protokolle DroNc-seq und Omni-ATAC-seq und verwendet einen ähnlichen Ansatz wie neuere Studien, die snRNA-seq verwenden, um neurologische Störungen und neuronale Zelltypen im menschlichen Gehirn zu verstehen18,19,21,22,23,24. Das Protokoll verwendet eine Kombination aus enzymatischer /mechanischer Dissoziation gefrorener Proben, gefolgt von Filtration und Gradientenzentrifugation und ermöglicht eine schnelle und genaue Isolierung einzelner Kerne aus frischem gefrorenem Gliomgewebe. Wir haben dieses Protokoll erfolgreich verwendet, um snRNA-seq- und snATAC-seq-Daten aus dem gleichen Kernpräparat aus Hirntumorproben zu generieren.

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Protokoll

Frische gefrorene Gliomproben wurden aus der Gewebebank des Nationalen Zentrums für Tumorerkrankungen (NCT) in Heidelberg gewonnen. Die Verwendung von Patientenmaterial wurde vom Institutional Review Board der Medizinischen Fakultät Heidelberg genehmigt und die Einwilligung aller in die Studie einbezogenen Patienten eingeholt.

1. Experimentelle Vorbereitung

  1. Führen Sie alle Schritte auf Eis oder bei 4 °C durch.
  2. Vorkühlschläuche, Geschirr, Rasierklingen, Douncer und Stößel auf 4 °C.
  3. Bereiten Sie alle Puffer im Voraus vor. Diese Puffer sind bei Raumtemperatur stabil. Sterilfiltration wird empfohlen, insbesondere für Saccharose. Die Stoffpräparate sind modifiziert von Corces et al.19. Siehe Tabellen 1-7.
  4. Entfernen Sie Proben aus flüssigem Stickstoff oder -80 °C Gefrierfach und halten Sie sie bis Schritt 2.1 auf Trockeneis.

2. Gewebedissektion und Dissoziation

  1. Frische gefrorene Gewebeprobe (10-60 mg) in eine vorgekühlte Petrischale geben. Frisches gefrorenes Tuch mit einer Rasierklinge in kleine Stücke auf Eis hacken/ hacken.
  2. 500 μL gekühlter Kernlysepuffer werden in ein vorgekühltes 1,5 ml Röhrchen gegeben. Legen Sie die Gewebestücke in das 1,5-ml-Röhrchen, das den Kernlysepuffer enthält, und geben Sie es in einen Douncer (Materialtabelle).
    HINWEIS: Es gibt zwei Dounce Homogenisatorstößel: "lose" oder "A" Stößel für die anfängliche Probenreduktion und "tight" oder "B" Stößel für die vollständige Probenhomogenisierung.
  3. Verdoppeln Sie die Gewebestücke mit dem "losen" Stößel für etwa 20 Hübe, bis die Reibung reduziert ist. Wenn Ablagerungen vorhanden sind, kann die Probe durch Filtration mit einem 100-mm-Sieb vorgeräumt werden.
  4. Dounce mit dem "engen" Stößel für 20 Schläge, um eine vollständige Gewebehomogenisierung zu erreichen.
  5. Das Homogenat (ca. 500 μL) wird in ein vorgekühltes 2 mL Röhrchen überführen. Fügen Sie 1 ml gekühlten Lysepuffer hinzu. Sanft mischen und 5 min auf Eis inkubieren. Vorsichtig mit einer Breitrohrpipettenspitze mischen und während der Inkubation 1-2 mal wiederholen.
  6. Filtern Sie das gesamte Homogenat mit einem 30 μm Siebgewebe, sammeln Sie es in einem 15 mL Falcon Rohr und geben Sie es wieder in ein neues vorgekühltes 2 mL Rohr um. Ein einzelnes Sieb reicht typischerweise für das gesamte Homogenat aus.
  7. Überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop, um die Entfernung großer Ablagerungen und die Unversehrtheit der Kernmembran zu überprüfen. Kerne müssen rund sein und die Kernmembran sollte nicht verzerrt werden. Wenn Ablagerungen vorhanden sind, können Kerne erneut gefiltert werden.
  8. Zentrifuge die Kerne bei 500 x g für 5 min bei 4 °C auf einer Tischzentrifuge. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie ~ 50 μL mit Pellet zurück, das die Kerne enthält. Das Pellet vorsichtig in einem weiteren 1 ml Kernlysepuffer resuspendieren und 5 min auf Eis inkubieren.
  9. Zentrifuge die Kerne bei 500 x g für 5 min bei 4°C. Entfernen Sie den Überstand ohne störendes Pellet, fügen Sie 500 ml 1x Homogenisierungspuffer (HB) hinzu (Tabelle 4) und inkubieren Sie für 5 min ohne Wiederaufwirbeln. Dann resuspendieren Sie die Kerne in einem weiteren 1,0 ml 1x HB.
  10. Zentrifuge die Kerne bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Kerne vorsichtig in 200 μL 1x HB in ein neues 2,0 ml Röhrchen.

3. Gradientenzentrifugation

  1. Fügen Sie 200 μL 50% Iodixanollösung (Tabelle 5) hinzu, um eine Endkonzentration von 25% Iodixanol zu erhalten. 10 mal mit Pipette auf 300 ml gut mischen.
  2. 300 μL 29% ige Iodixanollösung (Tabelle 6) werden unter die 25% ige Mischung geben. Verwenden Sie eine P1000-Feinspitze, um eine Vermischung der Schichten zu vermeiden.
  3. 300 μl 35%ige Iodixanollösung (Tabelle 7) werden unter die 29%ige Mischung geben. Verwenden Sie eine P1000-Feinspitze, um eine Vermischung der Schichten zu vermeiden.
    Achtung: Dieser Schritt erfordert eine schrittweise Entfernung der Pipettenspitze während des Pipettierens, um eine übermäßige Volumenverschiebung zu vermeiden.
  4. Legen Sie die Proben in eine Schwenkschaufelzentrifuge, drehen Sie sie 20 min bei 3.500 x g bei 4°C mit ausgeschalteter Bremse.
  5. Entfernen Sie die Proben vorsichtig ohne Zuschütteln und beobachten Sie sie unter Licht. Zwischen der zweiten und dritten Schicht sollte ein klares weißes Band aus 95% reinen Kernen sichtbar sein (Abbildung 1).

4. Isolierung von Kernen

  1. Saugen Sie die oberen Schichten an, bis sich die weißen Kerne in der Interphase von 29% -35% banden.
  2. Sammeln Sie das Kernband in einem Volumen von 200 ml, geben Sie es in ein frisches Rohr und filtern Sie es mit einem 20 μm Filter (Materialtabelle).
    HINWEIS: Die Kerne müssen vor der Filtration nicht wieder aufgewendet werden.
  3. Überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop, um die Entfernung großer Ablagerungen und die Unversehrtheit der Kernmembran zu überprüfen. Kerne müssen rund sein und die Kernmembran sollte nicht verzerrt werden.
  4. Zählen Sie Kerne mit Trypan-Blaufärbung auf einem Hämozytometer und aliquoten Kernen für snRNA-seq/snATAC-seq.

5. Einzelkern-RNA und ATAC seq

  1. Sofortige Verarbeitung der Kerne unter Verwendung der Einzelzell-Genexpression und einzelliger ATAC-Reagenz-Kits (Materialtabelle).
    HINWEIS: Die Kernprobenkonzentrationen für das 10x Genomics-System betragen 1500-3000 Kerne pro μL für snRNA-seq und 3500-7000 Kerne pro m μL für snATAC-seq. Die Kerne können mit 1x PBS verdünnt werden.
  2. Sequenzieren Sie die resultierenden Bibliotheken in der Genomics Core Facility.
  3. Führen Sie eine Qualitätskontrollanalyse der Daten durch. Kerne werden für die weitere Analyse einbezogen, wenn sie Unique Molecular Identifier (UMI) >1000, die Anzahl der Gene >500 und Prozent der mitochondrialen Gene <5% enthalten und innerhalb des Mittelwerts + drei Standardabweichungen der UMIs und Gene liegen.

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Ergebnisse

Die Einzelkerngenomik ist ein sich entwickelndes Feld mit begrenzten Daten und Protokollen. Ein kritischer Faktor, der das Ergebnis von Einzelkernassays beeinflusst, ist die Isolierung reiner und intakter Kerne. Wir haben zwei veröffentlichte Protokolle (DroNc-seq- und Omni-ATAC-seq-Protokolle) kombiniert, um in relativ kurzer Zeit hochwertige und reine Kerne aus frischen gefrorenen Gliomgewebeblöcken zu isolieren und so die Stabilität der Transkripte zu erhalten (Abbildung 1).

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Diskussion

Das Gebiet der intratumoralen Heterogenität befindet sich in einem spannenden Stadium, wobei neuartige Assays und Plattformen entwickelt werden, um das vorhandene Wissen herauszufordern und zu erweitern. Intratumorale Heterogenität ist ein entscheidender Faktor, der zum Fortschreiten der Krankheit und zur Resistenz gegen die derzeitigen Behandlungsmodalitäten bei Gliomen beiträgt28. Jüngste Studien zu Hirntumoren haben sich auf diesen wichtigen Aspektkonzentriert,indem sie einzellige tr...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Wir danken dem Single Cell Open Lab (scOpenLab) am Deutschen Krebszentrum (DKFZ) für hilfreiche Gespräche. Diese Forschung wurde von der Deutschen Krebshilfe, Max-Eder-Programm Fördernummer 70111964 (S.T.) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-MercaptoethanolSigmaM6250
CaCl2Sigma21115-100ML
Dounce HomogenisatorAktives Motiv40401
EDTA (0,5 M)Thermo ScientificR1021
Falcon 15 mL konische ZentrifugenröhrchenFisher Scientific352096
Iodixanol (aka Optiprep)Stammzelltechnologien07820
MACs Smart Strainers (30 & Mikro; m)Miltenyi Biotec130-098-458
MACS SmartStrainers (100 & Mikro; m)Miltenyi Biotec130-098-463
Mg(Ac)2Sigma63052-100ML
NP-40Abcamab142227
Zellkern-Isolationskit: Nuclei EZ PrepSigmaNUC101-1KT
Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)SigmaP7626
Vorabscheidungsfilter (20 & Mikro; m)Miltenyi Biotec130-101-812
Safe Lock Röhrchen 1,5 mLEppendorf0030120086
Safe Lock Röhrchen 2,0 mLEppendorf0030120094
Einzelzell ATAC10x Genomik
Einzelzell-Genexpression10x Genomik
SaccharoseSigmaS0389
Pipettenspitzen mit breiter Bohrung (1000 & Mikro; L)Themo Fisher Scientific2079GPK
Pipettenspitzen mit breiter Bohrung (200 & Mikro; L)Themo Fisher Scientific2069GPK

Referenzen

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