Mikroskopische Beobachtung der Lymphozytendynamik in Rat Peyers Patches

Summary

Hier beschreiben wir eine präzise Methode zum Sammeln von Thoraxkanallymphozyten und zur Beobachtung der Migration von darm-tropischen Lymphozyten in Ratten-Peyer-Pflastern für 3 Stunden mit Zeitrafferfotografie. Diese Technik kann klären, wie die Dynamik von Lymphozyten unter entzündlichen Bedingungen beeinflusst wird.

Abstract

Naive Lymphozyten zirkulieren unter physiologischem Zustand aus dem Blut in das Lymphgewebe und es wird allgemein als ein wichtiges Phänomen in der Darmimmunität anerkannt. Die Stroma von sekundären Lymphorganen, wie Peyers Pflaster (PPs) oder mesenterischen Lymphknoten, sind, wo naive Lymphozyten Antigene spüren. Naive Lymphozyten zirkulieren durch den Blutkreislauf, um hohe endotheliale Venules zu erreichen, das Portal des Eintritts in PPs. Es wird geschätzt, dass einige Immunmodulatoren die Lymphozytenmigration beeinflussen, aber die genaue Bewertung der Mikrozirkulationsdynamik ist sehr schwierig, und die Festlegung einer Methode zur Beobachtung der Lymphozytenmigration in vivo kann zur Klärung der genauen Mechanismen beitragen. Wir verfeinerten die Methode, Lymphozyten aus dem Lymphkanal zu sammeln und die detaillierte Dynamik von Darm-tropischen Lymphozyten in Ratten-PPs zu beobachten. Wir haben uns für die konfokale Laserscanmikroskopie entschieden, um Ratten-PPs in vivo zu beobachten und sie mit Zeitrafferfotografie aufzuzeichnen. Wir können jetzt klare Bilder erhalten, die zur Analyse der Lymphozytendynamik beitragen können.

Introduction

Peyers Pflaster (PPs) bestehen aus Hunderten von Lymphfollikel in der Lamina propria des Dünndarms. PPs sind in Follikel, die interfollikuläre Region und Keimzentren im unteren Teil der Follikel unterteilt, wo Lymphozyten durch Antigen-Präsentation stimuliert werden. Es gibt keine afferenten Lymphgefäße, und die Antigene dringen über die Epithelzellschicht aus dem Darmlumen in die Lamina propria ein. Die epitheliale Region, die Lymphfollikel bedeckt, wird follikelassoziiertes Epithel genannt, in dem spezialisierte interspersierte M-Zellen Schleimhautantigene aufnehmen. M-Zellen nehmen Antigene von der luminalen Seite auf und Antigene werden dann von dendritischen Zell....

Protocol

Das experimentelle Protokoll wurde vom Animal Research Committee des National Defense Medical College (Nr. 16058) genehmigt. Die Tiere wurden auf Standardlabor Chow (CLEA Japan Inc, Tokyo, Japan) gehalten. Die Labortiere wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health behandelt.

1. Sammlung und Trennung von Lymphozyten

HINWEIS: Da Lymphozyten frisch sein müssen und nicht gelagert werden können, müssen sie für jedes Experiment von Ratten gesammelt werden. Darüber hinaus müssen darm-tropische Lymphozyten direkt aus dem Brustkanal gesammelt werden, wo sie zirkulieren. Es wird erwartet, ....

Results

Sammeln von Lymphozyten aus Lymphe
Um die Ratte auf die Thoraxkanalkannulation vorzubereiten, machen Sie einen Schnitt in den angespannten Brustkanal, wie in Abbildung 1 dargestellt, und halten Sie die Ratte dann in einem Bollman-Käfig, wie in Abbildung 2dargestellt.

Wenn die Lymphozyten gut gesammelt sind, können wir etwa 20 ml/6 h Lymphflüssigkeit mit etwa 10⁷x 10⁸/mL Lymphozyten erhalten. V.......

Discussion

Hier beschrieben wir ein Protokoll zum Sammeln naiver Darm-Tropen-Lymphozyten und zur Beobachtung ihrer Migration in Ratten-PPs. Diese Verfahren können zeigen, wie sich Lymphozyten in der Mikrovaskulatur von PPs bewegen und es ermöglichen, ihre Dynamik unter einem normalen oder medikamentösen Zustand visuell zu vergleichen. Die direkte Beobachtung dieser Dynamik hat viel Verdienst, einen Hinweis auf eine immunologische Veränderung durch einige Medikamente zu erhalten, obwohl der Beobachtungszeitraum auf wenige Stunden be.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A1R+	Nikon		Komfokale Laser-Scanning-Mikroskopie
Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester	Thermo Fisher Scientific	C1157
Hoechest 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Isofluran	Wako Pure Chemical Industries	099-06571
RPMI 1640 Medium	GIBCO	11875093
Texas Rot– Dextran	Thermo Fisher Scientific	D1863