Hier beschreiben wir eine präzise Methode zum Sammeln von Thoraxkanallymphozyten und zur Beobachtung der Migration von darm-tropischen Lymphozyten in Ratten-Peyer-Pflastern für 3 Stunden mit Zeitrafferfotografie. Diese Technik kann klären, wie die Dynamik von Lymphozyten unter entzündlichen Bedingungen beeinflusst wird.
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Methodenartikel
Mikroskopische Beobachtung der Lymphozytendynamik in Rat Peyers Patches
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Naive Lymphozyten zirkulieren unter physiologischem Zustand aus dem Blut in das Lymphgewebe und es wird allgemein als ein wichtiges Phänomen in der Darmimmunität anerkannt. Die Stroma von sekundären Lymphorganen, wie Peyers Pflaster (PPs) oder mesenterischen Lymphknoten, sind, wo naive Lymphozyten Antigene spüren. Naive Lymphozyten zirkulieren durch den Blutkreislauf, um hohe endotheliale Venules zu erreichen, das Portal des Eintritts in PPs. Es wird geschätzt, dass einige Immunmodulatoren die Lymphozytenmigration beeinflussen, aber die genaue Bewertung der Mikrozirkulationsdynamik ist sehr schwierig, und die Festlegung einer Methode zur Beobachtung der Lymphozytenmigration in vivo kann zur Klärung der genauen Mechanismen beitragen. Wir verfeinerten die Methode, Lymphozyten aus dem Lymphkanal zu sammeln und die detaillierte Dynamik von Darm-tropischen Lymphozyten in Ratten-PPs zu beobachten. Wir haben uns für die konfokale Laserscanmikroskopie entschieden, um Ratten-PPs in vivo zu beobachten und sie mit Zeitrafferfotografie aufzuzeichnen. Wir können jetzt klare Bilder erhalten, die zur Analyse der Lymphozytendynamik beitragen können.
Einleitung
Peyers Pflaster (PPs) bestehen aus Hunderten von Lymphfollikel in der Lamina propria des Dünndarms. PPs sind in Follikel, die interfollikuläre Region und Keimzentren im unteren Teil der Follikel unterteilt, wo Lymphozyten durch Antigen-Präsentation stimuliert werden. Es gibt keine afferenten Lymphgefäße, und die Antigene dringen über die Epithelzellschicht aus dem Darmlumen in die Lamina propria ein. Die epitheliale Region, die Lymphfollikel bedeckt, wird follikelassoziiertes Epithel genannt, in dem spezialisierte interspersierte M-Zellen Schleimhautantigene aufnehmen. M-Zellen nehmen Antigene von der luminalen Seite auf und Antigene werden dann von dendritischen Zellen eingefangen und in Richtung naiver Lymphozyten präsentiert, die durch das Endothel von hohen endothelialen Venulen (HEVs)inPPs fließen. PPs spielen eine wichtige Rolle bei der Darmimmunität und sind mit dem frühen Stadium der Entzündung verbunden. Viele molekulare Wechselwirkungen beinhalten den Eintritt von Lymphozyten zu sekundären Lymphorganen (SLOs), einschließlich Adhäsionsmoleküle, Chemokine2,3und Sphingosin-1-Phosphat4; Daher gibt es viele erwartete therapeutische Ziele. Daher ermöglicht die Beobachtung der Lymphozytendynamik innerhalb von PPs, einen Einblick in das sehr frühe Stadium der Entzündung zu erhaschen und die Nützlichkeit mehrerer vielversprechender Medikamente zu untersuchen.
Die Methode konzentriert sich hier auf die Migration von Lymphozyten in PPs, die mehrere Verfahren umfasst (Kannulation in den Brustkanal5 und Das Sammeln von Lymphozyten und Langzeitbeobachtung nach der Injektion in gesammelte Lymphozyten). Da diese Verfahren komplex sind und es schwierig war, genau zu sehen, wie jedes Verfahren in früheren Berichten durchgeführt wurde, haben wir hier einige Tipps erwähnt, um eine erfolgreiche Beobachtung zu erreichen. Zum Beispiel war die Cannulation der Rohre in den Brustkanal sehr schwierig, und die anfängliche Erfolgsrate der Cannulation betrug weniger als 50%. Wir haben die Methode jedoch verbessert und eine Erfolgsquote von über 80 % erzielt. Wir haben einige weitere Tipps in diesem Manuskript erwähnt, die für die erfolgreiche Beobachtung notwendig sind, um die quantitative Auswertung der transendotheliale Migration von Lymphozyten unter verschiedenen Bedingungen zu ermöglichen.
In früheren Berichten war es schwierig, die dreidimensionalen Veränderungen im Laufe der Zeit zu verstehen, wie die intravenöse Injektion von Indientinte, um die Gefäßstruktur von PPs6zu färben, oder das Mikroskop ist monofokal7. In den letzten Jahren hat eine Beobachtungsmethode mit einigen photoconvertiblefluoreszenzproteintransgenen Tieren wie Kaede-Mäusen systematische zelluläre Bewegungen in vivo8geklärt. Die andere Studie verdeutlichte CD69 unabhängige Abschaltung von Lymphozyten austritt aus PPs9. Wir verwendeten konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM) wegen seiner hohen Analysefähigkeit. Jetzt können wir leicht hochauflösende Bilder erhalten und sie verwenden, um die Lymphozytendynamik zu analysieren.
In diesem Bericht haben wir eine Reihe von Methoden zur Bewertung der Lymphozytenmigration in PPs demonstriert. Zuerst zeigten wir raffinierte Methoden der thorakalen Kanalkannulation, um Lymphozyten zu sammeln. Zweitens haben wir die Beobachtungsmethoden auf verschiedene Weise verbessert, um objektive Organe nach Möglichkeit unter mikroskopischer Beobachtung zu erhalten, so dass wir 3 Stunden lang qualitativ hochwertige Bilder erhalten können. Drittens quantifizierten wir die zellulären Bewegungen der Lymphozytenmigration, um die Auswirkungen einiger Medikamente zu bewerten. Diese geänderten Protokolle werden zur Entwicklung von Mukosal-Immunologie-Evaluierungen beitragen.
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Protokoll
Das experimentelle Protokoll wurde vom Animal Research Committee des National Defense Medical College (Nr. 16058) genehmigt. Die Tiere wurden auf Standardlabor Chow (CLEA Japan Inc, Tokyo, Japan) gehalten. Die Labortiere wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health behandelt.
1. Sammlung und Trennung von Lymphozyten
HINWEIS: Da Lymphozyten frisch sein müssen und nicht gelagert werden können, müssen sie für jedes Experiment von Ratten gesammelt werden. Darüber hinaus müssen darm-tropische Lymphozyten direkt aus dem Brustkanal gesammelt werden, wo sie zirkulieren. Es wird erwartet, dass alle Eingriffe innerhalb von 6 Stunden abgeschlossen sein werden und alle Instrumente, Handschuhe und Oberflächen sauber sind. Um die Tiere in einem physiologisch stabilen Zustand zu halten, sollten alle im Experiment verwendeten Salz- und anderen Flüssigkeiten warm gehalten werden.
- Bilden Sie ein Konservenrohr (1 mm Durchmesser) wie eine Heparinkurve (ein Radius von ca. 5 mm), nachdem Sie es in heißes Wasser (ca. 80–90 °C) eintauchen, und fixieren Sie es mit Klebeband für einige Stunden im Voraus an einer Kunststoffplatte.
- Anästhetisieren Sie eine männliche Wistar-Ratte (8-12 Wochen) mit intraperitonealer Injektion einer Mischung aus Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) und Betulphar (2,5mg/kg) und schneiden Sie das Körperhaar des Bauches mit einem Haarschneider. Entfernen Sie das Haar fest nach der Rasur, so dass das Haar nicht in die Bauchhöhle.
- Nach der Bestätigung, dass die stabile Tiefe der Anästhesie für den Eingriff erforderlich ist, wird durch Zehenkneifen erhalten, machen Sie einen Schnitt mit chirurgischer Schere horizontal von der Mittellinie zum linken subcostalen Bereich. Achten Sie darauf, die Blutgefäße im parietalen Peritoneum nicht zu beschädigen, indem Sie die Gefäße unter Licht beobachten.
- Wickeln Sie den Magen mit nasser Gaze und bewegen Sie den Magen sanft nach rechts außerhalb des Körpers, um die retroperitonealen Organe zu offenbaren. Legen Sie eine Kerbe zwischen den Erector-Muskeln der Wirbelsäule und dem Fettgewebe mit chirurgischer Schere und trennen Sie sie unverblümt mit den Fingern.
- Das Bindegewebe um den Brustkanal vorsichtig abstreifen. Das überschüssige Bindegewebe nimmt mit dem Alter zu. Setzen Sie den Brustkanal direkt unter dem linken Krusten des Zwerchfells kauenal aus, bis eine Länge von 20 mm des Brustkanals sichtbar war. Mit Präzisionspinzette oder nassen Wattestäbchen trennen Sie die Adhäsionen zwischen Brustkorb und Aorta sanft.
- Führen Sie diesen Prozess sorgfältig durch, da einige Ratten Arteriolen haben, die sich von der Baucharterie verzweigen, die sich über den Brustkanal kreuzen, oder einen kurzen Brustkanal aufgrund einer höheren Position des Lymphplexus (kleine Thoraxkanäle, die sich wie Spinnennetze ausbreiten). Vermeiden Sie unnötigen Kontakt mit dem Brustkanal, um ödeme zu vermeiden.
- Tragen Sie eine Ligatur durch eine Schnur (3-0 Seide) auf den Brustkanal direkt unter dem linken Kruste des Zwerchfells auf. Der kaudale Thoraxkanal wird distended.
- Machen Sie ein Loch (5 mm Durchmesser) in der Bauchwand, indem Sie die Schneide der chirurgischen Schere stechen, das haargekrümmte Kanulationsrohr passieren und das Rohr an einer Stelle auf den Iliopsoas-Muskel legen. Füllen Sie das Cannulationsrohr mit normaler Salin, die 10 U/ml Heparin enthält.
- Nachdem Sie eine Schnur (3-0 Seide) unter den distended Thoraxkanal gesetzt haben, stechen Sie den Brustkanal mit der scharf geschnittenen Kante eines Kanulationsrohrs, können Sie ihn etwa 5 mm in Richtung des Schwanzes anbringen und den Brustkanal zur Fixierung mit einem Kanulationsrohr aufstellen.
- Um Die Saline zur Vermeidung von Austrocknung zu liefern, erstellen Sie ein Loch (3 mm Durchmesser) an der vorderen Wand des Magens mit präzisionspräziser Pinzette und übergeben Sie das Siliziumrohr (2 mm Durchmesser) durch den Pyloric-Ring an das Zwölffingerdarm. Nachdem Sie eine Wunde genäht und die Tiere in Bollmans Käfigen gehalten haben, beginnen Sie, zuckerhaltige Salzwäsche aus dem Siliziumrohr mit einer Durchflussrate von 3 ml/h in das Zwölffingerdarm jeder Ratte einzufließen. Bedecken Sie den gesamten Käfig mit einem Papiertuch, um ihn warm zu halten.
- Fixieren Sie das Konservenrohr am Loch in der Mitte des Deckels eines 50-ml-Koninusrohrs auf Eis, das 6 U/ml Heparin, 10% fetales Rinderserum und RPMI 1640 medium (pH 7.4; siehe Materialtabelle) enthält, und sammeln Sie thorakale Kanallymphozyten (TDLs) auf Eis. Achten Sie darauf, die Spitze des Rohres nicht an die Wand des konischen Rohres zu kontaktieren, um Kanülenrohrverschluss durch Fibringerbildung im Inneren des Rohres zu verhindern. Lymphflüssigkeit (ca. 20 ml) einschließlich ca. 1,0 x 108x 109 Lymphozyten kann in 6 Stunden erhalten werden. Um die Lymphozyten unter Vollständiger Anästhesie zu erhalten, wird die Anästhesieebene überwacht und der Lymphfluss entsprechend beobachtet. Die gleichen Anästhetika werden in der gleichen Dosis etwa 3 Stunden nach Ratten in Ballmans Käfig gesetzt, um tiefe Anästhesie kontinuierlich für 6 Stunden zu erhalten.
2. Lymphozytenkennzeichnung mit Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester (CFDSE)
- CFDSE(Materialtabelle) in Dimethylsulfoxid (DMSO) bis 15,6 mM auflösen (500 g CFDSE gelöst in 60 l DMSO).
- Inkubieren Sie Lymphozyten (1 x 108x 109) in 50 ml RPMI 1640 mit 50 l CFDSE-Lösung für 30 min bei 37 °C, wie zuvor beschrieben10.
3. Versuchsaufbau für mikrovaskuläre Studien
- Anästhetisieren Empfängerratten (8-12 Wochen) mit intraperitonealer Injektion einer Mischung aus Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) und Betulphar (2,5mg/kg) und bestätigen die Tiefe der Anästhesie durch Zehenkneifung. Befeuchten Sie den Bauch, bevor Sie das Fell pflegen, um die Haarkontamination zu minimieren. Öffnen Sie dann den Bauch des Empfängers Wister Ratte über einen Mittellinienschnitt.
- Legen Sie eine Ratte auf eine tragbare Edelstahlplatte (ca. 120 x 300 mm) mit einem Rechteckloch um die Mitte, das mit einem Glasschlitten (24 x 50 mm) bedeckt ist. Wählen Sie ca. 10 cm des Ileal-Segments einschließlich PPs zur Beobachtung.
- Den Darm so warm wie möglich und feucht mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) auf 37 °C erwärmt halten. Einweichen Gaze, die verwendet wird, um den Dünndarm mit PBS zu bedecken.
- Während sie eine kontinuierliche Anästhesie mit 2 % Isofluran gibt (siehe Materialtabelle), stellen Sie das Dia auf die Bühne des Mikroskops und wählen Sie geeignete Bereiche für die Beobachtung der Mikrozirkulation in PPs, wo einige HEVs durch die Serosa verlaufen. PPs reichen in der Größe; größere eignen sich zur Beobachtung der Mikrozirkulation mit CLSM. Der Dünndarm ist stellenweise nicht gerade; ein gerades Segment von mindestens 2 cm Länge ohne Spannung ist zur Beobachtung geeignet.
- Bedecken Sie das angrenzende Darmsegment und die Mesentery mit saugfähiger Baumwolle, die mit PBS getränkt ist. Legen Sie das Darmsegment zwischen zwei gerollten Baumwollkugeln und positionieren Sie es so weit wie möglich vom Körper der Ratte, um zu verhindern, dass es durch den Herzschlag und die Atmung der Ratte vibriert.
- Mit einer 1 ml Spritze langsam (über 1 min) CFSE-markierte TDLs (1 x 108 Zellen) in die Jugularvene der Empfängerratten injizieren. Eine schnelle intravenöse Injektion kann die systemische Durchblutung beeinflussen.
4. Mikrozirkulation von Lymphozyten
- Kontinuierliche Überwachung von TDLs in der Mikrovaskulatur von PPs mit CLSM und Aufnahme auf einem Computer für 3 Stunden mit Zeitraffer-Fotografie in 30 s Intervallen. Die Tiefe von der Serosa bis zum HEV von PPs beträgt ca. 25 m, was die Beobachtung der Stroma- und Kapillarlymphgefäße bis zu einer Tiefe von 30 m ermöglicht.
- Injizieren Sie Texas Red-Dextran (25 mg/kg) in die Jugularvene jeder Empfängerratte, um den Blutkreislauf zu färben, und Hoechest 33342 (5 mg/kg), um die Zellkerne zu färben.
- (Optional) Um die Lymphozytendynamik zu quantifizieren, definieren Sie Lymphozyten, die an HEVs halten, mehr als 30 Sekunden als "klebende Lymphozyten" und Lymphozyten, die von HEVs zu Stroma auswandern, als "wandernde Lymphozyten". Berechnen Sie dann den durchschnittlichen Prozentsatz der Migration (wandernde Lymphozyten / klebende Lymphozyten + wandernde Lymphozyten) pro Sichtfeld (ca. 0,3 mm2).
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Ergebnisse
Sammeln von Lymphozyten aus Lymphe
Um die Ratte auf die Thoraxkanalkannulation vorzubereiten, machen Sie einen Schnitt in den angespannten Brustkanal, wie in Abbildung 1 dargestellt, und halten Sie die Ratte dann in einem Bollman-Käfig, wie in Abbildung 2dargestellt.
Wenn die Lymphozyten gut gesammelt sind, können wir etwa 20 ml/6 h Lymphflüssigkeit mit etwa 107x 108/mL Lymphozyten erhalten. V...
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Diskussion
Hier beschrieben wir ein Protokoll zum Sammeln naiver Darm-Tropen-Lymphozyten und zur Beobachtung ihrer Migration in Ratten-PPs. Diese Verfahren können zeigen, wie sich Lymphozyten in der Mikrovaskulatur von PPs bewegen und es ermöglichen, ihre Dynamik unter einem normalen oder medikamentösen Zustand visuell zu vergleichen. Die direkte Beobachtung dieser Dynamik hat viel Verdienst, einen Hinweis auf eine immunologische Veränderung durch einige Medikamente zu erhalten, obwohl der Beobachtungszeitraum auf wenige Stunden be...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Forschung wurde durch Stipendien des National Defense Medical College und durch ein Forschungsstipendium für Gesundheits- und Arbeitswissenschaften für die Erforschung hartnäckiger Krankheiten vom Ministerium für Gesundheit, Arbeit und Wohlfahrt, Japan, unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| A1R+ | Nikon | Komfokale Laser-Scanning-Mikroskopie | |
| Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isofluran | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 Medium | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Rot– Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
