Quantifizierung der zirkulierenden schweinespezifischen DNA im Blut eines Xenotransplantationsmodells

Summary

In diesem Protokoll wurden schweinespezifische Primer entwickelt, Plasmiden enthaltende Porenspezifische DNA-Fragmente konstruiert und Standardkurven für die Quantifizierung festgelegt. Anhand artspezifischer Primer wurde cpsDNA durch qPCR in Schweine-zu-Maus-Zelltransplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Transplantationsmodellen quantifiziert.

Abstract

Xenotransplantation ist eine praktikable Methode zur Behandlung von Organversagen. Jedoch, wie die Immunabstoßung von Xenotransplantation effektiv zu überwachen ist ein Problem für Ärzte und Forscher. Dieses Manuskript beschreibt eine einfache und effektive Methode zur Überwachung der Immunabstoßung in Schweine-zu-Maus-Zelltransplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Transplantationsmodellen. Zirkulierende DNA ist ein potenziell nicht-invasiver Biomarker für Organschäden. In dieser Studie wurde zirkulierende schweinespezifische DNA (cpsDNA) während der Xenograft-Abstoßung durch quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) überwacht. In diesem Protokoll wurden schweinespezifische Primer entwickelt, Plasmiden enthaltende Porenspezifische DNA-Fragmente konstruiert und Standardkurven für die Quantifizierung festgelegt. Artspezifische Primer wurden dann verwendet, um cpsDNA durch qPCR in Schweine-zu-Maus-Zell-Transplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Transplantationsmodellen zu quantifizieren. Der Wert dieser Methode legt nahe, dass es als eine einfache, bequeme, kostengünstige und weniger invasive Methode verwendet werden kann, um die Immunabstoßung von Xenotransplantation zu überwachen.

Introduction

Organversagen ist eine der Haupttodesursachen¹. Transplantation von Zellen, Geweben und Organen ist ein effektiver Weg, um Organversagen zu behandeln². Dennoch schränkt der Mangel an Spenderorganen die klinische Anwendung dieser Methode^{ein 3,4}. Studien haben gezeigt, dass Schweine als potenzielle Quelle menschlicher Organe für die klinische Transplantation verwendet werden können^5,6. Die artenübergreifende Organtransplantation ist jedoch mit einer gefährlichen Immunabstoßung konfrontiert. Daher ist es wic....

Protocol

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften des Institutional Review Board des Shenzhen Second People es Hospital, First Affiliated Hospital der Shenzhen University durchgeführt.

1. Entwerfen Sie porcine spezifische Primer

1. Führen Sie eine Vollgenom-BLAST-Analyse durch, um porenspezifische Gene zu identifizieren, die sich von denen von Menschen, Affen oder Mäusen unterschieden, mit der Software NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
2. Designprimer nach 19 schweinespezifischen Genen (Tabelle 1) mit der Software von Primer 5.

2. Isolierun....

Results

In diesem Protokoll wurden schweinespezifische Primer entwickelt, Plasmiden enthaltende Porenspezifische DNA-Fragmente konstruiert und Standardkurven für die Quantifizierung festgelegt (Abbildung 4). Die Spezifitäten der 19 Primer wurden von PCR bestätigt. Artspezifische Primer (Primer #4 und Primer #11) wurden dann verwendet, um cpsDNA durch qPCR in Schweine-zu-Maus-Zell-Transplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Transplantationsmodellen zu quantifizieren.

Discussion

Die Quantifizierung der zirkulierenden Poren-DNA stellt einen praktikablen Ansatz zur Überwachung der Immunabstoßung von Xenotransplantationen dar. Gadi et al.²⁴ fanden heraus, dass der von Spendern abgeleitete zirkulierende DNA-Gehalt (ddcfDNA) im Blut von Patienten mit akuter Abstoßung signifikant höher war als der von Patienten ohne Abstoßung. Diese Studien deuten darauf hin, dass ddcfDNA ein häufiger Biomarker für die Überwachung von Organtransplantatschäden sein kann. In den letzten Jahren wu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Biowest, Barcelona, Spanien	111860
BamHI-HF	New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, USA	R3136S
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Axygen  Biosciences, Union City, CA, USA	MCT-150-C
0,2 mL PCR-Röhrchen	Axygen  Biowissenschaften, Union City, CA, USA	PCR-02-C
C57BL / 6	Mäuse Medical Animal Center der Provinz Guangdong,   China		8 ~ 10 Wochen
Zentrifuge	Thermo  Fischer  Scientific, Waltham, MA, USA	Micro 21R 2-Log
DNA Ladder	New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, USA	N3200S	0.1– 10.0 kb
Markierung I	Tiangen, Peking, China	MD101-02	0.1– 0,6 kb
DNA-Mini-Säule (HiBind DNA-Mini-Säulen)	Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA	DNACOL-01
DNA-Ladepuffer	Solarbio, Peking, China	D1010
E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I und E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II	Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA	D6942
D6943
EcoR I	Takara  Biografie, Shiga, Japan	1040S Weibliche
Bama Minischweine	BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China		2 ~ 4 Monate
Genomisches DNA-Extraktionskit?	Tiangen, Peking, China	DP304-02
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	Toyobo, Osaka, Japan	QPK-201
Gel Doc XR	Bio-Rad, Hercules, USA
Männliche Cynomolgus-Affen	Guangdong Landau Biotechnologie, Guangzhou, China		8 Jahre
Nukleinsäure-Farbstoff (Gelred)	Biotium, Fremont, USA	42003
Polymerase (Premix Taq)	Takara  Bio, Shiga, Japan	RR901A
pMD19-T Plasmid	Takara   Bio, Shiga, Japan	D102A
qPCR-Maschine	Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA
Serum/zirkulierendes DNA-Extraktionskit	Tiangen, Peking, China	DP339
TAE	sangon Biotech, Shanghai, China	B548101