Konstruktion von Mutanten im Serotyp 1 Streptococcus pneumoniae Stamm 519/43

Summary

Hier beschreiben wir einen S. pneumoniae Serotyp 1 Stamm 519/43, der genetisch verändert werden kann, indem er seine Fähigkeit nutzt, DNA und ein Suizid-Plasmid auf natürliche Weise zu erwerben. Als Prinzipienbeweis wurde eine isogene Mutante im Pneumolysin-Gen (Ply) hergestellt.

Abstract

Streptococcus pneumoniae Serotyp 1 ist nach wie vor ein großes Problem in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen, insbesondere in Afrika südlich der Sahara. Trotz seiner Bedeutung wurden Studien zu diesem Serotyp durch den Mangel an genetischen Werkzeugen behindert, um ihn zu modifizieren. In dieser Studie beschreiben wir eine Methode zur genetischen Modifikation eines klinischen Serotyp-1-Isolats (Stamm 519/43). Interessanterweise wurde dies erreicht, indem die Fähigkeit der Pneumokokken ausgenutzt wurde, DNA auf natürliche Weise zu erwerben. Im Gegensatz zu den meisten Pneumokokken war die Verwendung von linearer DNA jedoch nicht erfolgreich; Um diesen wichtigen Stamm zu mutieren, musste ein Selbstmord-Plasmid verwendet werden. Diese Methodik hat die Mittel für ein tieferes Verständnis dieses schwer fassbaren Serotyps geschaffen, sowohl in Bezug auf seine Biologie als auch auf seine Pathogenität. Um die Methode zu validieren, wurde das wichtigste bekannte Pneumokokken-Toxin, Pneumolysin, mutiert, da es einen bekannten und leicht zu verfolgenden Phänotyp aufweist. Wir zeigten, dass die Mutante erwartungsgemäß ihre Fähigkeit verlor, rote Blutkörperchen zu lysieren. Indem wir in der Lage waren, ein wichtiges Gen im interessierenden Serotyp zu mutieren, konnten wir verschiedene Phänotypen für Funktionsverlustmutanten bei intraperitonealen und intranasalen Infektionen beobachten, die für andere Serotypen beobachtet wurden. Zusammenfassend belegt diese Studie, dass der Stamm 519/43 (Serotyp 1) genetisch verändert werden kann.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, der Pneumokokkus) ist weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. Bis vor kurzem wurden fast 100 Serotypen von S. pneumoniae entdeckt 1,2,3,4,5,6,7. Jährlich sterben rund 700.000 Kinder unter 5 Jahren^{an der} invasiven Pneumokokkenerkrankung (IPD) 8. S. pneumoniae ist weltweit die Hauptursache für bakterielle Pneumonie, Mittelohrentzündung, Meningitis und Septikämie⁹.

Im afrikanischen Meningitis-Gürtel ist Serotyp 1 für Meningitis-Ausbrüche verantwortlich, bei denen der Sequenztyp (ST) ST217, ein extrem virulenter Sequenztyp, 10,11,12,13,14,15 dominant ist. Seine Bedeutung in der Meningitis-Pathologie wurde mit der von Neisseria meningitidis im afrikanischen Meningitis-Gürtel^{verglichen 16}. Serotyp 1 ist oft die Hauptursache für IPD; Es ist jedoch sehr selten in der Kutsche zu finden. Tatsächlich ist dieser Serotyp in Gambia für 20% aller invasiven Erkrankungen verantwortlich, wurde jedoch nur bei 0,5% der gesunden Träger gefunden^14,17,18,19. Genetischer Austausch und Rekombination in kompetenten Pneumokokken erfolgt im Allgemeinen eher bei der Beförderung als bei invasiven Erkrankungen²⁰. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Serotyp 1 eine der kürzesten Trageraten aufweist, die bei Pneumokokken beschrieben wurden (nur 9 Tage). Daher wurde vorgeschlagen, dass dieser Serotyp eine viel niedrigere Rekombinationsrate aufweisen könnte als andere²¹.

Eingehende Studien sind notwendig, um den Grund für die niedrige Beförderungsrate von Serotyp-1-Stämmen und ihre Bedeutung für invasive Erkrankungen in Afrika südlich der Sahara zu verstehen.

Hier berichten wir über ein Protokoll, das eine genomweite Mutagenese eines bestimmten Serotyp-1-Stammes ermöglicht, 519/43. Dieser Stamm kann leicht neue DNA erwerben und in sein Genom rekombinieren. Diese Methode ist noch nicht übergreifend, aber sie ist sehr effizient, wenn sie im 519/43-Hintergrund durchgeführt wird (andere Ziele wurden mutiert, Manuskripte sind in Vorbereitung). Durch die einfache Verwendung des 519/43-Stammes und die Nutzung seiner natürlichen Kompetenz sowie die Substitution der Art und Weise, wie die exogene DNA bereitgestellt wird, konnten wir das Pneumolysin-Gen (ply) in diesem Serotyp-1-Stamm mutieren. Diese Methode stellt eine Verbesserung gegenüber der von Harvey et ^al.22 vorgestellten Methode dar, da sie in einem Schritt durchgeführt wird, ohne dass die DNA durch einen anderen Serotyp geleitet werden muss. Nichtsdestotrotz und aufgrund der Variabilität zwischen den Stämmen wurde keine Methode für alle Stämme standardisiert. Die Fähigkeit, bestimmte Gene zu mutieren und ihre Auswirkungen zu beobachten, wird ein tiefgreifendes Verständnis der Serotyp 1 S. pneumoniae-Stämme ermöglichen und Antworten auf die Rolle dieser Stämme bei Meningitis in Afrika südlich der Sahara liefern.

Protocol

1. Erzeugung des mutierenden Amplikons mittels SOE-PCR²³ und Amplifikation der Spectinomycin-Kassette

1. Beginnen Sie mit der Durchführung einer PCR zur Amplifikation der Homologiearme (Ply 5' (488 bp) bzw. Ply3' (715 bp)) der flankierenden Regionen des Ply-Gens aus dem Stamm 519/43. Verwenden Sie die Primer plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATATTTCG) und plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTCTCTTATCCTCTACC).
2. Verwenden Sie die folgenden PCR-Bedingungen für Schicht5': Denaturierung bei 94 °C für 60 s, Schritt 2: Denaturierung bei 94 °C für 30 s, Schritt 3: Glühen bei 58 °C für 30 s, Schritt 4: Verlängerung bei 72 °C für 30 s, Schritt 5: Zurück zu Schritt 2 und Wiederholung für 35 Zyklen, Schritt 6: endgültige Verlängerung bei 72 °C für 30 s.
   1. Verwenden Sie die gleichen PCR-Bedingungen für ply3' mit Ausnahme der Verlängerungszeit in Schritt 4 und Schritt 6, wo sie 60 s betragen sollte.
3. Analysieren Sie die PCR-Produkte durch Gelelektrophorese und entfernen Sie das Amplikon aus dem Gel.
4. Reinigen Sie die PCR-Amplikons gemäß dem Protokoll, das in den Anweisungen des Herstellers (Materialtabelle) beschrieben ist.
5. Verwenden Sie äquimolare Mengen beider Homologiearme als Vorlagen in der SOE-PCR. Verschmelzen Sie die beiden Amplikons mit den Primern plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) und plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTCTCTCTTATCCTCTACC).
6. Verwenden Sie die folgenden SOE-PCR-Bedingungen (Schritt 1: Denaturierung bei 94 °C für 2 min, Schritt 2: Denaturierung bei 94 °C für 30 s, Schritt 3: Glühen bei 58 °C für 30 s, Schritt 4: Verlängerung bei 68 °C für 60 s, Schritt 5: Zurück zu Schritt 2 und Wiederholung für 25 Zyklen, Schritt 6: endgültige Verlängerung bei 68 °C für 90 s).
7. Analysieren Sie das SOE-PCR-Produkt durch Gelelektrophorese. Entfernen Sie es mit einem Gel-Extraktionskit aus dem Gel und befolgen Sie die Anweisungen.
8. Amplifizieren Sie die Spectinomycin-Kassette aus dem Plasmid pR412 unter den folgenden PCR-Bedingungen: Schritt 1: Denaturierung bei 94 °C für 60 s, Schritt 2: Denaturierung bei 94 °C für 30 s, Schritt 3: Glühen bei 55 °C für 30 s, Schritt 4: Verlängerung bei 68 °C für 60 s, Schritt 5: Gehen Sie zurück zu Schritt 2 und wiederholen Sie den Vorgang für 25 Zyklen, Schritt 6: Endverlängerung bei 68 °C für 60 s.
   1. Verwenden Sie die Primer BamHI_SP2F2 (GGATCC, CTA, GAA, CTA, GTG, GAT, CCC, CC) und BamHI_SP2R2 (GGATCC, AA, TCT, TCT, GCA, GAT, TTT, AC, ATG, ATC, ATC). Das Plasmid pR412 wurde von Dr. Marc PrudHomme (CNRS-Université Paul Sabatier, Toulouse, Frankreich) erworben.
9. Analysieren Sie die PCR-Amplikons durch Gelelektrophorese. Das resultierende PCR-Amplikon wird wie oben beschrieben entfernt und gereinigt.

2. Erzeugung des Plasmids pSD1 und chemische Umwandlung von E. coli Dh5α

1. Führen Sie eine Ligatur gemäß den Herstellerangaben des pGEMT-easy system I (Materialtabelle) durch. In einem Mikrozentrifugenröhrchen werden 5 μl 2x Ligationspuffer, 1 μl pGEMTeasy, 2 μl des ply_SOE Produkts, 1 μl T4-DNA-Ligase und Wasser zu einem Gesamtvolumen von 20 μl gegeben. Über Nacht bei 4 °C inkubieren. Dadurch entsteht das Plasmid pSD1.
2. Transformieren Sie chemisch kompetente E. coli Dh5α mit pSD1. Beginnen Sie mit der Inkubation von 50 μl chemisch kompetentem E. coli Dh5α mit 3 μl pSD1-Ligationsreaktion für 15 Minuten auf Eis. Anschließend werden die Zellen einem thermischen Schock (42 °C, 30 s) ausgesetzt. Legen Sie die Zellen für 2 Minuten auf Eis.
3. Entfernen Sie die Zellen aus dem Eis und fügen Sie 350 μl S.O.C.-Medien hinzu. Inkubation der Kultur für 2 h bei 37 °C, 120 U/min.
4. Platte der Transformation auf Luria Bertani Agar (LBA) ergänzt mit 0,4 mM IPTG, 0,24 mg/ml X-Gal für die Blau/Weiß-Selektion und 100 μg/ml Ampicillin, um sicherzustellen, dass alle in der Platte wachsenden Kolonien das Plasmid-Rückgrat haben. Weiße Kolonien enthalten pSD1.
5. Wählen Sie drei weiße Kolonien und richten Sie über Nacht ein Wachstum in 10 ml LB ein, ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin. Die Kulturen werden über Nacht bei 37 °C unter Schütteln inkubiert.
6. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Kulturen bei 3.082 x g und verwenden Sie das Pellet zur Plasmidextraktion.

3. Plasmid-DNA-Extraktion, Restriktionsverdau von pSD1 und Spectinomycin-Gen und Assemblierung von pSD2

1. Extrahieren Sie die Plasmid-DNA gemäß den Anweisungen, die mit dem kommerziellen Kit geliefert werden (Materialtabelle).
2. Richten Sie einen BamHI-Restriktionsaufschluss sowohl für das pSD1-Plasmid als auch für die zuvor amplifizierte und gereinigte Spectinomycin-Kassette ein. Verwenden Sie die folgenden Bedingungen und Mengen, die in Tabelle 1 beschrieben sind.
3. Inkubation der Restriktionsaufschlussreaktionen und Kontrollen bei 37 °C für 3 h.
4. Analysieren Sie den Restriktionsaufschluss durch Elektrophorese, entfernen Sie die Bande und reinigen Sie sie gemäß den Anweisungen, die mit dem handelsüblichen Kit geliefert werden (Materialtabelle).
5. Als nächstes bereiten Sie eine Ligationsreaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialtabelle) unter Verwendung des BamHI-verdauten pSD1 und Spectinomycin (aus Schritt 3.2) vor. In einem Mikrozentrifugenröhrchen die folgenden Reaktionskomponenten zugeben: 5 μl 2x Ligationspuffer, 2 μL pSD1, 2 μl Spectinomycin-Kassette, 1 μl T4-DNA-Ligase und über Nacht bei 4 °C inkubieren. Dadurch entsteht das Plasmid pSD2.
6. Umwandlung des Plasmids pSD2 in chemisch kompetentes E. coli Dh5α, wie in Schritt 2.2 beschrieben.
7. Wählen Sie die Transformanten, die das Plasmid pSD2 tragen, basierend auf ihrer Fähigkeit aus, in LBA zu wachsen, das mit 100 μg/ml Spectinomycin und Ampicillin ergänzt wird.
8. Führen Sie eine Plasmid-DNA-Extraktion (pSD2) wie oben beschrieben und gemäß den Anweisungen des Herstellers (μl) durch.

4. Transformation des Stammes 519/43 von S. pneumoniae

1. Bereiten Sie eine Nachtkultur von S. pneumoniae 519/43 in BHI vor und lassen Sie sie bei 37 °C, 5% CO₂ statisch wachsen.
2. Am nächsten Tag werden die Kulturen 1:50 und 1:100 in 10 ml frischer BHI-Brühe verdünnt. Inkubieren Sie die Kulturen statisch bei 37 °C, bis der OD_{595 nm} zwischen 0,05 und 0,1 liegt (optimale DNA-Erfassung näher an 0,1 OD).
3. Sobald ein OD von 0,1 erreicht ist, nehmen Sie 860 μl und füllen Sie es in ein Mikrozentrifugenröhrchen um. In dasselbe Mikrozentrifugenröhrchen geben Sie: 100 μl 100 mM NaOH, 10 μl 20% (w/v) BSA, 10 μl 100 mM CaCl 2,₂ μl 50 ng/ml CSP1²⁴ und 500 ng pSD2.
4. Die Reaktion wird statisch bei 37 °C für 3 h inkubiert.
5. Platte 330 μl auf 5% Blutagarplatten (BA), ergänzt mit 100 μg/ml Spectinomycin, stündlich über die 3 Inkubationsstunden.
6. Inkubation der Platten über Nacht bei 37 °C, 5% CO₂. Patchen Sie Spectinomycin-resistente Kolonien auf eine andere BA-Platte, die mit 100 μg/ml Spectinomycin ergänzt wurde, sowie auf BA-Platten, die mit 100 μg/ml Ampicillin ergänzt wurden. Inkubieren Sie beide Plattensätze über Nacht unter den oben genannten Bedingungen. Die Ampicillinplatten sollen auf das Vorhandensein des Plasmidrückgrats getestet werden.
7. Bestätigen Sie das Vorhandensein der Spectinomycin-Kassette durch PCR unter Verwendung der Primer plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) und SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). Bestätigen Sie die Mutation durch PCR mit den Primern plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) und plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACCCTGAT), die außerhalb der mutierten Region anhaften.
8. Bestätigen Sie die Integration an der richtigen Stelle des Genoms durch Sequenzierung mit den Primern plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) sowie Primern mit ihrer Bindungsstelle in der Spectinomycin-Kassette sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACCACC), sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG) und spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.

Results

Das hier beschriebene Protokoll beginnt mit der Verwendung von PCR zur Amplifikation des linken und rechten Homologiearms, während gleichzeitig 191 bp aus der mittleren Region des Lagengens gelöscht werden. Während der Durchführung der PCR wird eine BamHI-Stelle am 3'-Ende des linken Homologiearms und am 5'-Ende des rechten Homologiearms eingeführt (Abbildung 1A). Darauf folgt die PCR-SOE, bei der linke und rechte Homologiearme zu einem Amplikon fusioniert werden (

Discussion

Streptococcus pneumoniae, insbesondere Serotyp 1, ist nach wie vor eine globale Bedrohung, die invasive Pneumokokkenerkrankungen und Meningitis verursacht. Trotz der Einführung verschiedener Impfstoffe, die vor Serotyp 1 schützen sollten, ist dieser Serotyp in Afrika immer noch in der Lage, Ausbrüche zu verursachen, die zu einer hohen Morbidität und Mortalität führen¹³. Die Fähigkeit, diesen Serotyp genetisch zu manipulieren, ist aufgrund seiner klinischen Relevanz von entscheidender Bede...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuPrime Pfx DNA-Polymerase	Invitrogen	12344024	Wird zur Amplifikation der Fragmente
Ampicillin-Natriumsalz	Sigma Aldrich	A9518	Wird zur Bakterienselektion im Stadium 1 (pSD1) verwendet.
Blut-Agar-Base-Oxoid		CM0055	Wird verwendet, um S. pneumoniae Transformanten
Rinderserum Albumin	Sigma	55470	zur Züchtung von S. pneumoniae Transformation
Brain Heart Infusion		Oxoid CM1135	zur Züchtung von S. pneumoniae Zellen
Calciumchlorid Cacl2	Sigma	449709	für S. pneumoniae Transformation
kompetenzstimulierendes Peptid 1	AnaSpec	AS-63779	zur Verwendung für S. pneumoniae Transformation
Luria Broth Agar	Gibco	22700025	zur Beschichtung und Auswahl von pSD1 und pSD2
Luria Broth Base (Miller's Formulation)	Gibco	12795027	zur Beschichtung und Auswahl von pSD1 und pSD2
Monarch Gel Extraction Kit	NEB	T1020S	Wird verwendet, um die Banden aus dem DNA-Gel
Monarch Plasmid zu extrahieren Miniprep Kit	NEB	T1010S	Wird verwendet, um Plasmid aus den Zellen
zu extrahieren pGEM T-easy	Promega	A1360	wird als Selbstmordplasmid
S.O.C. verwendet.	Invitrogen	15544034	zur Rückgewinnung von Zellen nach der Transformation
Natriumhydroxid (NaOH)	Sigma	S0899	zur S.pneumoniae Transformation
Spectinomycinhydrochlorid	SigmaAldrich	PHR1426	zur Bakterienselektion
Subklonierungseffizienz DH5α Kompetente Zellen	Invitrogen	18265017	zur Herstellung von pSD1 und pSD2 verwendet