Methodenartikel

Analyse des α-Actinin-Netzwerks in humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten mittels Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie

DOI:

10.3791/61605

⸱

3. November 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Rostock University Medical Center, 2Faculty of Interdisciplinary Research, Department Life, Light & Matter, University Rostock, 3Department of Cardiology, Rostock University Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Bildung eines richtigen Sarcomere-Netzwerks ist wichtig für die Reifung von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten. Wir präsentieren einen super Auflösungs-basierten Ansatz, der die quantitative Bewertung der strukturellen Reifung von Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten ermöglicht, um die Kulturbedingungen zu verbessern, die die Herzentwicklung fördern.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Reifung von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten ist ein kritisches Thema für ihre Anwendung in der regenerativen Therapie, Medikamententests und Krankheitsmodellierung. Trotz der Entwicklung mehrerer Differenzierungsprotokolle bleibt die Erzeugung von iPSC-Kardiomyozyten, die einem erwachsenen Phänotyp ähneln, eine Herausforderung. Ein wichtiger Aspekt der Kardiomyozytenreifung ist die Bildung eines gut organisierten Sarcomere-Netzwerks, um eine hohe Kontraktionskapazität zu gewährleisten. Hier stellen wir einen super auflösungsbasierten Ansatz für die semiquantitative Analyse des α-Actinin-Netzwerks in Kardiomyozyten vor. Mit hilfe der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie wurde ein Vergleich der Sarkomelänge und der Z-Scheibendicke von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten und herzisolierten Herzzellen aus neonatalem Gewebe durchgeführt. Gleichzeitig zeigen wir, wie wichtig geeignete Bildgebungsbedingungen sind, um zuverlässige Daten zu erhalten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass diese Methode geeignet ist, die strukturelle Reife von Herzzellen mit hoher räumlicher Auflösung quantitativ zu überwachen, was den Nachweis selbst subtiler Veränderungen der Sarcomere-Organisation ermöglicht.

Einleitung

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Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) wie Myokardinfarkt oder Kardiomyopathie bleiben die Haupttodesursache in der westlichen Welt1. Da das menschliche Herz nur über schlechte Regenerationsfähigkeit verfügt, bedarf es Strategien, um die Erholung von CVDs zu fördern. Dazu gehören Zellersatztherapien zur Auffüllung verlorener Kardiomyozyten (CM) sowie die Entwicklung neuer antiarrhythmischer Medikamente für eine effiziente und sichere pharmazeutische Intervention. Induzierte pluripotente Stammzelle (iPSC) haben sich als vielversprechende Zellquelle für die unbegrenzte Generierung von humanem CM in vitro erwiesen, geeignet für regenerative Therapien, Krankheitsmodellierung, und für die Entwicklung von Arzneimittel-Screening-Assays2,3,4.

Obwohl es viele verschiedene kardiale Differenzierungsprotokolle gibt, fehlt es iPSC-abgeleitetem CM noch immer an bestimmten phänotypischen und funktionellen Aspekten, die die In-vitro- und In-vivo-Anwendung behindern5,6. Neben elektrophysiologischen, metabolischen und molekularen Veränderungen beinhaltet der Herzreifungsprozess die strukturelle Organisation von Sarkomen, die die grundlegenden Einheiten sind, die für die Kraftgenerierung und Zellkontraktion erforderlich sind7. Während erwachsene CMs ein gut organisiertes kontraktiles Gerät aufweisen, zeigen iPSC-abgeleitete CMs häufig disarrangierte Sarcomere-Filamente, die mit einer reduzierten Kontraktionsfähigkeit und veränderten Kontraktionsdynamik8,9verbunden sind. Im Gegensatz zu reifen CM, die uniaxiale Kontraktionsmuster zeigen, führen die desorientierten Strukturen in unreifen CM zu einer radialen Kontraktion der ganzen Zelle oder fördern das Auftreten von Kontraktionsschwerpunkten9,10.

Zur Verbesserung der Herzreife wurden mehrere Ansätze angewendet, einschließlich 3D-Zellkulturmethoden, elektrische und mechanische Stimulation sowie die Verwendung extrazellulärer Matrizen, die in vivo Bedingungen11,12,13imitieren. Um den Erfolg und die Effizienz dieser verschiedenen Kulturbedingungen zu bewerten, sind Techniken erforderlich, um den Grad der strukturellen Reifung von iPSC CM zu überwachen und abzuschätzen, z. B. durch mikroskopische Techniken. Im Gegensatz zur herkömmlichen konfokalen Bildgebung ist die Auflösung bei der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) etwa 10-fach höher. Diese Technik wiederum ermöglicht eine genauere Analyse, die auch subtile Veränderungen der zellulären Strukturen erkennt14. Unter Berücksichtigung der hohen Auflösung der PALM-basierten Bildgebung war das übergeordnete Ziel dieser Methode die mikroskopische Bewertung der Sarkomereife in iPSC-abgeleiteten CMs durch präzise Bestimmung der Z-Scheibendicke und Sarcomere-Länge. In früheren Studien haben sich diese strukturellen Merkmale als geeignete Parameter zur Beurteilung der Herzreife erwiesen15. Zum Beispiel, kranke iPSC-CM fehlt volle Länge Dystrophin zeigen reduzierte Sarcomere Länge und Z-Bandbreite Breite im Vergleich zu Wild-Typ-Zellen16. Ebenso wurde die Länge der einzelnen Sarkome gemessen, um die Auswirkungen topografischer Hinweise auf die Herzentwicklung zu untersuchen16. Daher haben wir diesen Ansatz angewandt, um die strukturelle Reifung des Sarcomere-Netzwerks in iPSC-CM zu bewerten, indem wir die Sarcomere-Länge und die Z-Scheibendicke quantitativ messen.

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Protokoll

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Alle Schritte in diesem Protokoll mit neonatalen und erwachsenen Mäusen wurden nach den ethischen Richtlinien für die Tierpflege des Universitätsklinikums Rostock durchgeführt.

1. Kultivierung und Dissoziation von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten

  1. Differenzieren Sie hiPSC-CMs 25 Tage lang mit einer 2D-Monolayer-Methode, wie zuvorbeschrieben 17.
  2. Vorwärmedissoziation Medium bis 37 °C und unterstützen mittlere raumtemperatur.
  3. Waschen Sie Zellen zweimal mit PBS.
  4. Vorgewärmtes Dissoziationsmedium zu zellen hinzufügen und 12 min bei 37 °C und 5%CO2brüten.
  5. Fügen Sie den Zellen ein Unterstützungsmedium hinzu.
    HINWEIS: Das Volumen des hinzugefügten Unterstützungsmediums muss doppelt so groß sein wie das Volumen des Dissoziationsmediums, das in Schritt 1.4 verwendet wird.
  6. Lösen Sie die Zellen mit einer 5 ml serologischen Pipette.
  7. Zentrifugenzellen bei 200 x g für 5 min und das Pellet in 3 ml hiPSC-CM Kulturmedium17wieder aufsetzen.
  8. Samenzellen in 8 Brunnenglasbodenkammern mit einer Zelldichte von 75.000 Zellen/Well und Kultur für 3 Tage.

2. Erwachsenen-Kardiomyozyten-Isolierung

  1. Isolation und Kultivierung von erwachsenen Kardiomyozyten von NMRI-Mäusen wurde durchgeführt, wie zuvor berichtet18.
  2. Samenzellen in 8 Brunnenglaskammer rutsche und Kultur für einen Tag.

3. Isolierung und Kultivierung von neonatalen Kardiomyozyten

  1. Isolationsverfahren von neonatalen Kardiomyozyten, die von NMRI-Mäusen erhalten wurden, wurde wie zuvorbeschrieben 19durchgeführt.
  2. Samen isolierte Zelle in 8 Gutglaskammer gleiten bei einer Zelldichte von 75.000 Zellen/ Well und Kultur für 3 Tage in neonatalen CM Kulturmedium19.

4. Immunofluoreszenzkennzeichnung des α-Actinin-Netzes

HINWEIS: Für optimale Ergebnisse werden Zellen in 8 Brunnenglasbodenkammern kultiviert. Die Etikettierung sollte einen Tag vor der Bildgebung erfolgen.

  1. Vorwärme 4% PFA bei 37 °C.
  2. Fix iPSC-CM durch Zugabe von 4% Paraformaldehyd direkt in die Kulturmedien (1:1 Verdünnung) und inkubieren bei 37 °C für 15 min. Die endgültige Konzentration von PFA für die Fixierung beträgt 2%.
  3. Inkubieren Sie feste Zellen in 0,2% Triton-X, in PBS verdünnt, für 5 min bei Raumtemperatur.
  4. Waschen Sie Zellen zweimal mit PBS, jeweils 5 min.
  5. 1% BSA-Lösung hinzufügen (in PBS verdünnt) und 60 min bei Raumtemperatur brüten.
  6. Bereiten Sie 150 l primäre Antikörperlösung vor, indem Sie α-Actinin-Antikörper 1:100 in 1% BSA verdünnen, der 0,05% Triton-X enthält. Zu den Zellen hinzufügen und bei Raumtemperatur 60 min brüten.
  7. Waschen Sie Zellen zweimal mit 0,2% BSA-Lösung, jeweils 5 min.
  8. Bereiten Sie 150 l Sekundärantikörperlösung vor, indem Sie den Ziegen-Anti-Maus-Antikörper Alexa647 1:100 in 1% BSA verdünnen, der 0,05% Triton-X enthält. Zu den Zellen geben und bei Raumtemperatur 40 min brüten.
  9. Waschen Sie Zellen zweimal mit 0,2% BSA-Lösung, jeweils 5 min.
  10. Waschen Sie Zellen zweimal mit PBS, jeweils 5 min. Beschriftete Zellen bei 4 °C bei 4 °C bis zur PALM-Bildgebung im Dunkeln halten.

5. Vorbereitung des PALM-Bildgebungspuffers

HINWEIS: Es ist wichtig, den PALM-Bildgebungspuffer für jedes Experiment neu vorzubereiten.

  1. Bereiten Sie 50% Glukoselösung vor, indem Sie 25 g Glukose in 50 ml destilliertem Wasser auflösen.
  2. Bereiten Sie einen Basispuffer mit 50 mM Tris-HCl, 10% Glukose und 10 mM Natriumchlorid vor.
    1. Stellen Sie den pH-Wert mit Salzsäure auf 8,0 an.
  3. Bereiten Sie die Pyranoseoxidase-Lösung vor, indem Sie 0,6 mg Pyranoseoxidase in 316 l Grundpuffer auflösen.
  4. Bereiten Sie die Kataalaselösung vor, indem Sie 7 mg Katanasain in 500 l Grundpuffer auflösen. Gründlich mischen und zentrifugieren bei 10.000 x g für 3 min. Halten Sie den Überstand für die weitere Verwendung. Die Katasselösung kann mehrere Tage bei 4 °C aufbewahrt werden.
  5. Bereiten Sie 500 l PALM-Bildgebungspuffer vor, indem Sie 316 L Pyranoseoxidase-Lösung, 25 l Kataalaselösung, 100 l 50% Glukoselösung, 50 l Cysteamin, 5 l Cyclooctatetraen und 3,5 l β-Mercaptoethanol mischen. Die letzte katalytische Aktivität von Pyranoseoxidase und Kataalase muss 7,5 U bzw. 35,00 U betragen.
    HINWEIS: Der PALM-Bildgebungspuffer bietet optimale Bildbedingungen für 3-5 h. Wenn die Blinkfähigkeit des Fluoreszenzfarbstoffs abnimmt, bereiten Sie einen neuen Puffer aliquot vor.

6. PALM Bildaufnahme

  1. Schalten Sie das Mikroskop vor Gebrauch mindestens 3 h ein und bringen Sie die Probe vor der Bildgebung auf Raumtemperatur, um eine thermische Gleichgewichtslösung zu ermöglichen. Wenn das Mikroskop mit einer Inkubationskammer ausgestattet ist, stellen Sie die Temperatur auf 30 °C ein.
  2. Reinigen Sie das Objektiv und den Boden des Kammerschlittens mit einem geeigneten Reinigungslösungsmittel.
  3. Fügen Sie 300 L PALM-Bildgebungspuffer in einen Brunnen beschrifteter Zellen ein und legen Sie das Kammerschlitten in den Bühnenhalter des Mikroskops ein.
  4. Legen Sie die PALM-Bildaufnahmeparameter fest.
    1. Wählen Sie 1.57 N.A. 100x Ölziel für den Erwerb.
    2. Wählen Sie den PALM-Modus und aktivieren Sie die TIRF-Einstellungen.
    3. Passen Sie die Anzahl der zu erwerbenden Frames an. Normalerweise reichen 5 000-10 000 Rahmen aus, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Die Anzahl der erworbenen Rahmen hängt jedoch stark von der Etikettierungseffizienz und der Blinkfähigkeit des Fluoreszenzfarbstoffs ab und kann vom Benutzer angepasst werden.
    4. Stellen Sie die UV-Laserleistung auf 0,1% und 647 Laser auf 0,2% ein.
    5. Legen Sie die Verstärkungsstufe auf 50-100 fest.
    6. Schalten Sie die Laserbeleuchtung ein und wählen Sie eine Zielzelle aus. Der Verstärkungsgrad kann erhöht werden, wenn die Signalintensität zu niedrig ist (abhängig von der Fluoreszenzkennzeichnung).
    7. Laserbeleuchtung ausschalten
  5. PALM Bildaufnahme
    1. Reduzieren Sie den Gewinn auf 0 und erhöhen Sie die Laserleistung (ex 647) auf 100%.
    2. Bleichen Sie die Zielzelle für 5 s.
    3. Erhöhen Sie den Gewinn auf 50 und starten Sie die PALM-Bildaufnahme.
      HINWEIS: Gain muss angepasst werden, um eine ausreichende Signalintensität zu erhalten, während übersättigte Pixel vermieden werden sollten. Wenn die Signalintensität abnimmt, erhöhen Sie den Verstärkungsgrad.
  6. Optional die UV-Laserleistung stetig steigern (0,1%-10%) die Signalintensität zu erhöhen und das Blinken des Fluorophors zu fördern.

7. Rekonstruktion der PALM-Daten

  1. Öffnen Sie die Image J-Software und importieren Sie PALM-Daten.
  2. Open Thunderstorm Plugin und "Run analysis"
    1. Geben Sie im Menü"Kamera-Setup" Pixelgröße und EM-Verstärkung ein.
      HINWEIS: Bei Verwendung von 100x Objektiven und 1,6-facher Vergrößerungslinse ist eine Pixelgröße von 100 nm geeignet. Da die Pixelgröße jedoch von den Hardware-Features des Mikroskops und der Kamera abhängt, die für die PALM-Bildgebung verwendet werden, müssen Benutzer diesen Parameter sorgfältig überprüfen und anpassen. EM-Verstärkungswerte können aus den Metadaten abgerufen werden.
    2. Im Menü"Laufzeitanalyse" parametern wie folgt einstellen: B-Spline-Reihenfolge: 3, B-Spline-Skala: 2,0, Spitzenintensitätsschwelle: stf(Wave.F1), Anpassungsradius: 3, Anfangssigma: 1,6, Vergrößerung: 5,0, Aktualisierungsfrequenz: 50, Seitenverschiebungen: 2. Bestätigen Sie, indem Sie auf die Schaltfläche "Ok" klicken.
  3. Nachbearbeitung des rekonstruierten PALM-Bildes
    1. Wählen Sie im Menü "Plot histogram" den Parameter "Sigma" aus.
    2. Verwenden Sie das Werkzeug "Rechteck", um einen ROI auszuwählen, ohne mögliche Artefakte, und wenden Sie den ROI auf den Filter an. ROI-Werte werden im Filterbefehlsfeld angezeigt.
    3. Fügen Sie den ROI-Werten "& uncertainty <25" hinzu. Ein möglicher Filterbefehl sieht wie folgt aus: "(sigma > 48.6821 & sigma < 1117.40) & uncertainty <25". Wenden Sie ausgewählte Sigma-Werte an.
    4. Geben Sie im Menü "Duplikateentfernen " einen Abstandsschwellenwert von "10 nm" ein und wenden Sie ihn an.
    5. Im"Merging-Menü" legen Sie den maximalen Abstand auf "20", maximale Frames pro Molekül auf "0" und maximale Off-Frames auf "1" fest. Wenden Sie Einstellungen an.
    6. Wählen Sie im "Drift-Korrekturmenü" Kreuzkorrelation aus und setzen Sie "Anzahl der Abschnitte" auf "5" und "Vergrößerung" auf "5.0". Wenden Sie Driftkorrektureinstellungen an.
    7. Speichern Sie das endgültige PALM-Bild und exportieren Sie die nachgestellten Daten, falls gewünscht.

8. Analyse von Sarcomere-Filamenten

  1. Analyse der Sarcomere-Länge
    1. Öffnen Sie die Image J-Software und importieren Sie das rekonstruierte PALM-Image.
    2. Zeichnen Sie eine Linie zwischen ausgewählten Sarcomere-Strukturen senkrecht zur Z-Scheibe, um den kürzesten Abstand zwischen Denakin-Filamenten zu messen.
    3. Wählen Sie "Plotprofil" im Menü "Analysieren" und erfassen Sie die Länge zwischen zwei Spitzen. Da die Sarkome-Länge innerhalb einer Zelle variieren kann, sollten mindestens 20 Sarkome in verschiedenen Bereichen der Zielzelle gemessen werden.
  2. Analyse der Z-Scheibendicke
    1. Öffnen Sie die Image J-Software und importieren Sie das rekonstruierte PALM-Image.
    2. Konvertieren Sie das rekonstruierte PALM-Bild in ein 8-Bit-Modusbild.
    3. Öffnen Sie das Graterkennungs-Plugin und geben Sie die folgenden Parameter ein: Linienbreite: 20, hoher Kontrast: 230, niedriger Kontrast: 10, Sigma: 0,79, unterer Schwellenwert: 25,84, minimale Linienlänge: 20.
    4. Legen Sie "Estimate width", "Extend line" und " Displayresults" fest.
    5. Klicken Sie auf "Ok" und verwenden Sie "Mittlere Linienbreite" aus der Ergebnistabelle für weitere Analysen.

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Ergebnisse

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Zur Schätzung des Grades der strukturellen Reifung von CM wurden neonatale, vollreife Erwachsene und iPSC CM zunächst als CM mit α-Actinin-Antikörper nazierend, um das Sarcomere-Netzwerk zu visualisieren. Nach der PALM-Erfassung wurden Bilder rekonstruiert und die Z-Scheibendicke mit einer Plugin-basierten Bildverarbeitungssoftware zur automatischen Erfassung der Breite einzelner Filamente gemessen. Die Sarcomere-Länge wurde berechnet, indem der Abstand zwischen zwei benachbarten Intensitätsspitzen gemessen wurde, der be...

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Diskussion

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Die Generierung funktioneller iPSC-abgeleiteter CM in vitro ist wichtig für regenerative Therapien, Die Krankheitsmodellierung und die Entwicklung von Arzneimittel-Screening-Plattformen. Jedoch, unzureichende Reife dieser CM ist ein großes Hindernis in der kardiovaskulären Forschung20. In diesem Zusammenhang sind hochauflösende Bildgebungstechniken erforderlich, die die Überwachung des strukturellen Reifungszustands von iPSC-abgeleitetem CM ermöglichen. Gleichzeitig kann die Superauflösungsmikrosk...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde vom EU-Strukturfonds (ESF/14-BM-A55-0024/18) unterstützt. Darüber hinaus wird H.L. durch das FORUN-Programm des Universitätsklinikums Rostock (889001 und 889003) und die Josef und Käthe Klinz Stiftung (T319/29737/2017) unterstützt. C.I.L. wird vom Clinician Scientist Program des Universitätsklinikums Rostock unterstützt. Gefördert wird die R.D. von der DFG (DA1296/6-1), der DAMP-Stiftung, der Deutschen Herzstiftung (F/01/12) und dem BMBF (VIP+ 00240).

Wir danken Madeleine Bartsch für ihre technische Unterstützung bei der iPSC-Zellkultur und der Herzdifferenzierung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
humane iPSC-ZelllinieTakaraY00325
µ-Slide 8 Well Glass Bottomibidi80827
0,5 ml Eppendorf TubeEppendorf30121023
RinderserumalbuminSigma AldrichA906
Kardiomyozyten-DissoziationskitStammzelltechnologien05025
KatalaseSigma AldrichC40-1G
CyclooctatetraenSigma Aldrich138924-1G
CysteaminSigma Aldrich30070-10g
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca2+ und Mg2+Thermo Fisher14190169
F(ab')2-Ziege Anti-Maus IgG Alexa Fluor 647Thermo FisherA-21237
Fidschi Bildverarbeitungssoftware (Bild J)
GlukoseCarl RothX997.2
SalzsäureSigma AldrichH1758
LSM 780 ELYRA PS.1 SystemZeiss
ParaformaldehydMerck8187150100
PyranoseoxidaseSigma AldrichP4234-250UN
sarkomerischer α-Aktinin-Antikörper [EA-53]Abcamab9465
NatriumchloridSigma AldrichS7653
steriles WasserCarl Roth3255.1
Triton X-100Sigma AldrichX100
Trizma-BaseSigma AldrichT1503
β-MercaptoethanolSigma AldrichArtikel-Nr.: 63689

Referenzen

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