Histologische Färbungen mit frei schwebenden Gewebeschnitten

Summary

Die Free-Floating-Technik ermöglicht es Forschern, histologisch basierte Färbungen einschließlich Immunhistochemie an festen Gewebeschnitten durchzuführen, um biologische Strukturen, Zelltypen sowie Proteinexpression und -lokalisation sichtbar zu machen. Dies ist eine effiziente und zuverlässige histochemische Technik, die für die Untersuchung einer Vielzahl von Geweben wie Gehirn, Herz und Leber nützlich sein kann.

Abstract

Die Immunhistochemie ist eine weit verbreitete Technik zur Visualisierung spezifischer Gewebestrukturen sowie der Proteinexpression und -lokalisation. Zwei alternative Ansätze werden häufig verwendet, um die Gewebeschnitte während des Färbeverfahrens zu handhaben, ein Ansatz besteht darin, die Abschnitte direkt auf Glasobjektträgern zu montieren, während ein zweiter Ansatz, der freischwebende Ansatz, es ermöglicht, feste Abschnitte zu erhalten und zu färben, während sie in Lösung suspendiert sind. Obwohl Slide-Mounted- und Free-Floating-Ansätze zu ähnlichen Ergebnissen führen können, ermöglicht die Free-Floating-Technik eine bessere Penetration von Antikörpern und sollte daher die Methode der Wahl sein, wenn dickere Schnitte für die 3D-Rekonstruktion des Gewebes verwendet werden sollen, zum Beispiel wenn der Fokus des Experiments darauf liegt, Informationen über dendritische und axonale Projektionen in Hirnregionen zu gewinnen. Da die Schnitte in Lösung gehalten werden, können in einem einzigen Aliquot problemlos 30 bis 40 Schnitte aufgenommen werden, deren Handhabung insbesondere bei groß angelegten biomedizinischen Studien weniger aufwendig ist. Hier zeigen wir, wie die Free-Floating-Methode auf die fluoreszierende immunhistochemische Färbung angewendet werden kann, wobei der Schwerpunkt auf Hirnschnitten liegt. Wir werden auch diskutieren, wie die Free-Floating-Technik leicht modifiziert werden kann, um den individuellen Bedürfnissen der Forscher gerecht zu werden und an andere Gewebe sowie andere histochemische Färbungen wie Hämatoxylin, Eosin und Kresylviolett anzupassen, solange die Gewebeproben richtig fixiert werden, typischerweise mit Paraformaldehyd oder Formalin.

Introduction

Die Immunfärbung ist eine populäre Forschungspraxis, die vor 130 Jahren mit der Entdeckung von Serumantikörpern im Jahr 1890 durch von Behring¹ begann. Während des frühen 20. Jahrhunderts wurden Farbstoffe an Antigene und später an Antikörper gebunden, um Reaktionen zu quantifizieren und zu visualisieren¹, und 1941 entwickelte Albert Coons die ersten fluoreszierenden Antikörpermarkierungen, eine Entdeckung, die die Lichtmikroskopie revolutionierte ^2,3. Der Begriff "Immunfärbung" umfasst viele Techniken, die nach diesem Prinzip entwickelt wurden, einsch....

Protocol

1. Gewebevorbereitung für die Kryosektion

1. Fixiertes Gewebe in eine geeignete Einbettform einbetten (siehe Materialtabelle), um einen Probenblock mit einer geeigneten Probenmatrix zu erzeugen (siehe Materialtabelle) und auf Trockeneis einfrieren. Lagern Sie Probenblöcke bei -80 °C, bis sie zum Schneiden bereit sind.
   ANMERKUNG: Festsitzende Gewebe werden in der Regel durch Perfusionierung von erwachsenen (ca. 2,5 – 30 Monate alten) männlichen oder weiblichen Nagetieren (Maus oder Ratte)³⁴ in Übereinstimmung mit der verfügbaren ethischen Erlaubnis mit einem geeigneten Fixiermittel (z. B. 10 % Formalin....

Results

Das Gesamtschema der Verwendung der Free-Floating-Methode zur Durchführung eines fluoreszierenden immunhistochemischen Assays ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein repräsentatives Beispiel für eine fluoreszierende IHC unter Verwendung der Free-Floating-Methode im Gehirn von Mäusen, bei der die Expression des sauren Gliafibrillenproteins (GFAP) untersucht wird, ist in Abbildung 2 sowohl bei niedrigerer als auch bei höherer Vergrößerung dargestellt, um die Gesamtqua.......

Discussion

Die Immunhistochemie (IHC) ist eine vielseitige Technik, die für die Identifizierung der Proteinexpression und -lokalisation in Gewebeschnitten von entscheidender Bedeutung ist. Dieser Assay wird in der gesamten wissenschaftlichen Gemeinschaft verwendet, um die Eigenschaften von Gewebe über Stadien der normalen Funktion bis hin zu Krankheitszuständen besser zu verstehen. IHC wird in einer Vielzahl von Bereichen eingesetzt, von der klinischen Diagnose von Krankheiten wie Krebs bis hin zu ersten Entdeckungen in der präklin.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-Well-Platten	Corning	3513
6-Well-Platten	Corning	3516
Klarer Nagellack	Benutzerpräferenz	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Einbettformen	Thermo Scientific	1841
Ethylenglykol	Benutzerpräferenz	N/A
Formalinlösung	Fisher Scientific	SF98-4
Pferdeserum, hitzeinaktiviert	Gibco	26050088
Objektträgerboxen	Elektronenmikroskopie Dienstleistungen	71370
PBS	Benutzerpräferenz	N/A
Primärer Antikörper	Benutzerpräferenz	N/A
Rechteckige Deckgläser	VWR	48393-081	24 x 50 mm
Rechteckige Färbeschale	Elektronenmikroskopie Dienstleistungen	70312
Runder Künstlerpinsel #2	Princeton Select Serie	3750R	Marke nicht wichtig
Sekundärantikörper	Benutzerpräferenz	N/A
Probenmatrix zum Einbetten	von OCT Tissue-Tek, Sakura	4583
Fleckenablage – Objektträger-Färbesystem	Elektronenmikroskopie Dienstleistungen	71396-B	Verwendung mit dunklem Deckel
Saccharose	Benutzerpräferenz	N/A
Superfrost Plus Mikro-Objektträger	VWR	48311-703
TBS	Benutzerpräferenz	N/A
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield Antifade-Eindeckmedium	Vektor Laboratories	H-1000	Nicht aushärtende Well-Einsätze
für 12-Well-Platten	Corning Netwells	3477
Well-Einsätze für 6-Well-Platten	Corning Netwells	3479
Whatman Filterpapier	Millapore-Sigma	WHA1440042