Methodenartikel

Ableitung, Expansion, Kryokonservierung und Charakterisierung von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns aus humaninduzierten Pluripotenten Stammzellen

DOI:

10.3791/61629

⸱

19. November 2020

 ,  , 
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program, Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt eine angepasste Methode zur Ableitung, Erweiterung und Kryokonservierung mikrovaskulärer Endothelzellen des Gehirns, die durch Differenzierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, und zur Untersuchung der Eigenschaften der Bluthirnschranke in einem Ex-vivo-Modell.

Zusammenfassung

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Mikrovaskuläre Endothelzellen (BMECs) im Gehirn können von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unterschieden werden, um ex vivo-Zellmodelle zur Untersuchung der Funktion der Blut-Hirn-Schranke (BBB) zu entwickeln. Dieses modifizierte Protokoll enthält detaillierte Schritte zum Ableiten, Erweitern und Kryokonservieren von BMECs von menschlichen iPSCs, die einen anderen Spender und Reagenzien verwenden als in früheren Protokollen. iPSCs werden mit essentiellen 6 Medium für 4 Tage behandelt, gefolgt von 2 Tagen menschlichen endothelialen Serum-freien Kulturmedium mit grundlegenden Fibroblast wachstumsfaktor, Retinsäure, und B27 Ergänzung ergänzt. An Tag 6 werden die Zellen 2 Tage lang auf eine Kollagen-Fibronectin-Matrix subkultiviert. Die Immunzytochemie wird an Tag 8 für die BMEC-Markeranalyse mit CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 und SLC2A1 durchgeführt. Western Blotting wird durchgeführt, um den BMEC-Markerausdruck und das Fehlen von SOX17, einem endodermalen Marker, zu bestätigen. Angiogenic Potenzial wird mit einem keimenden Assay demonstriert. Der transendotheliale elektrische Widerstand (TEER) wird ab Tag 7 mit Essstäbchenelektroden und Voltohmmeter gemessen. Die Efflux-Transporteraktivität für die ATP-Bindungskassette Unterfamilie B-Mitglied 1 und die ATP-Bindungskassette Unterfamilie C-Mitglied 1 wird an Tag 8 mit einem Mehrplattenleser gemessen. Die erfolgreiche Ableitung von BMECs wird durch das Vorhandensein relevanter Zellmarker, niedrige SOX17-Spiegel, angiogenes Potenzial, Transportaktivität und TEER-Werte Ω x cm2bestätigt. BMECs werden bis zum 10. Tag erweitert, bevor sie auf frisch beschichtete Kollagen-/Fibronectinplatten oder Kryopreservede übergeben werden. Dieses Protokoll zeigt, dass iPSC-abgeleitete BMECs mindestens einmal erweitert und durchlaufen werden können. Nach der Kryokonservierung wurden jedoch niedrigere TEER-Werte und eine schlechtere Lokalisierung von BMEC-Markern beobachtet. BMECs können in Co-Kultur-Experimenten mit anderen Zelltypen (Neuronen, Glia, Pericyten), in dreidimensionalen Gehirnmodellen (Organ-Chip und Hydrogel), zur Vaskularisierung von Hirnorganoiden und zur Untersuchung von BBB-Dysfunktion bei neuropsychiatrischen Störungen eingesetzt werden.

Einleitung

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Blut-Hirn-Barriere-Funktion
Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) bildet eine Grenze, die die Bewegung von Substanzen aus dem Blut zum Gehirn einschränkt. Die BBB besteht aus mikrovaskulären Endothelzellen (BMECs) des Gehirns, die eine Monoschicht bilden, die die Vaskulatur auskundaufzen. BMECs bilden zusammen mit Astrozyten, Neuronen, Pericyten, Mikroglia und extrazellulärer Matrix die neurovaskuläre Einheit. BMECs haben eine streng regulierte parazelluläre Struktur, die es dem BBB ermöglicht, einen hohen transendotheliaalen elektrischen Widerstand (TEER) aufrechtzuerhalten, der die passive Diffusion begrenzt und als Indikator für die Barriereintegrität

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Protokoll

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Human ePSCs wurden von den Fibroblasten gesunder Spender mit einem von den Institutional Review Boards of Massachusetts General Hospital und McLean Hospital genehmigten Protokoll umprogrammiert und wie in früheren Studienbeschrieben 44,45,46charakterisiert.

HINWEIS: Kurz gesagt, Fibroblasten wurden über mRNA-basierte genetische Neuprogrammierung47auf iPSC umprogrammiert. Die iPSCs wurden im Stammzellmedium (SCM) (siehe Materialliste) gehalten und mit einer Dichte von 1,2 x 102 Zellen/ml mit 1 ml SCM, 10 m mit rho-....

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Ergebnisse

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BMEC-Differenzierung
Einige kritische Schritte in diesem Protokoll sollten genau befolgt werden (Abbildung 1). E6 mittlere Nutzung an Tag 1 ist wichtig, da es oft für die Ableitung von Neuroektoderm Linie von iPSCs innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums, die reproduzierbare Ergebnisse über mehrere Zelllinien36. Ein weiterer wichtiger Schritt ist der 4. Tag der Differenzierung, bei dem E6-Medium auf hESFM mit verdünnten (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF .......

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Diskussion

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Änderungen und Fehlerbehebung

In diesem Protokoll haben wir einige Änderungen bei der Verwendung einer häufig verwendeten extrazellulären Matrix und Zellkulturmedien während der iPSC-Kultivierung für die Ableitung von BMECs vorgenommen (Abbildung 1). Diese Änderungen hatten keinen Einfluss auf die Fähigkeit, BMECS aus menschlichen iPSCs abzuleiten, wie im Lippmann-Protokoll1beschrieben. Eine iPSC-Leitung eines anderen gesun.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch den National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH113858 (to R.K.), a National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL) unterstützt. ein National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (nach R.K.), ein Sydney R Baer Jr Foundation Grant (zu P.L.), der Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (nach R.K.), die Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (zu R.K.), die Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (zu R.K.), das Harvard Stem Cell Institute (zu R.K.) und von Steve Willis und Elissa Freud (zu R.K.). Wir dan....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2′,7′-DichlordidifluoresceindiacetatSigma AldrichD6883-50MG
AccutaseSigma AldrichA6964-100mL
Alexa Fluor 488 Esel Anti-Maus IgGLife TechnologiesA-21202
Alexa Fluor 555 Esel Anti-Kaninchen IgGLife TechnologiesA-31572
B27 ErgänzungThermo Fisher Scientific17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Maus-mAb-Zellsignalisierung3528S
CLDN5 (Claudin-5)Thermo Fisher Scientific35-2500
Kollagen IV aus menschlicher PlazentaSigma AldrichC5533-5mg
Corning 2 ml Kryo-Fläschchen aus Polypropylen mit InnengewindeCorning  8670
Corning  Costar Zellkulturplatten mit flachem Boden (6 Vertiefungen)Corning353046
Corning  Falcon Zellkulturplatten mit flachem Boden (24 Wells)Corning353047
Corning Transwell Multi-Well-Platte mit permeablen Polyester-Membraneinsätzen (12 Wells)Corning3460
Countess ObjektträgerThermo Fisher ScientificC10228
DMEM/F12 (ohne Phenolrot)Thermo Fisher Scientific
DMSOSigma AldrichD2438-50mL
EselsserumSigma AldrichD9663-10ML
DPBS (+/+)Gibco/Thermo Fisher Scientific14040-117
Epithel Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2World Precision InstrumentsN/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher)Thermo Fisher Scientific
Fötales Rinderserum (FBS)Sigma AldrichF2442
FibronektinSigma AldrichF2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basal Membrane MatrixThermo Fisher ScientificA1413202
Hanks' Balance Salzlösung mit Calcium und Magnesium Thermo Fisher Scientific24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochlorid, TrihydratThermo Fisher ScientificH3570
Humanes endotheliales serumfreies MediumThermo Fisher Scientific11111044
InCell Analyzer 6000General ElectricN/A
Invitrogen Countess Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificN/A
MK-571Sigma AldrichM7571-5MG
NutriStemStemgent01-0005
OccludinThermo Fisher Scientific33-1500
Paraformaldehyd 16%Elektronenmikroskopie Dienstleistungen15710
Perkin Elmer Envision 2103 Multi-Plate ReaderPerkin ElmerN/A
Rekombinant Human VEGF 165Peprotech100-20
Rekombinant Human FGF-basic (154 a.a.)Peprotech100-18B
RetinsäureSigma AldrichR2625-100MG
Rhodamin 123Sigma Aldrich83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1)ThermoFisherPA1-21041
SOX17Zellsignalisierung81778S
TJP-1 (ZO-1)ThermoFisherPA5-28869
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50ML
Trypanblauer Farbstoff (0,4%) zur Verwendung mit dem Countess Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificT10282
Valspodar (Sigma) (Cyclosporin A)Sigma AldrichSML0572-5MG
Versene LösungThermo Fisher Scientific15040066
Y-27632 Dihydrochlorid (ROCK-Inhibitor)Tocris/ Thermo Fisher Scientific1254
A1413202A1516401

Referenzen

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  1. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
  2. Smith, Q. R., Rapoport, S. I.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Brain Microvascular Endothelial CellsHuman Induced Pluripotent Stem CellsBlood Brain BarrierEndothelial DifferentiationTEER MeasurementEfflux Transporter ActivityImmunocytochemistryWestern BlottingSprouting AssayCryopreservation

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