Name: Ableitung, Expansion, Kryokonservierung und Charakterisierung von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns aus humaninduzierten Pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Erfahren Sie die Differenzierung, Expansion und Kryokonservierung von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns aus humanen iPSCs. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Blut-Hirn-Schranken-Funktionen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch den National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH113858 (to R.K.), a National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL) unterstützt. ein National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (nach R.K.), ein Sydney R Baer Jr Foundation Grant (zu P.L.), der Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (nach R.K.), die Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (zu R.K.), die Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (zu R.K.), das Harvard Stem Cell Institute (zu R.K.) und von Steve Willis und Elissa Freud (zu R.K.). Wir danken Dr. Annie Kathuria für ihre kritische Lektüre und ihr Feedback zum Manuskript.

Human ePSCs wurden von den Fibroblasten gesunder Spender mit einem von den Institutional Review Boards of Massachusetts General Hospital und McLean Hospital genehmigten Protokoll umprogrammiert und wie in früheren Studienbeschrieben 44,45,46charakterisiert.
HINWEIS: Kurz gesagt, Fibroblasten wurden über mRNA-basierte genetische Neuprogrammierung47auf iPSC umprogrammiert. Die iPSCs wurden im Stammzellmedium (SCM) (siehe Materialliste) gehalten und mit einer Dichte von 1,2 x 102 Zellen/ml mit 1 ml SCM, 10 m mit rho-assoziiertem Proteinkinase-Inhibitor (ROCKi) Y-27632 und 10% (v/v) Dimethylsulfid (DMSO) in kryopreserveden Durchstechflaschen in flüssigem Stickstoff bei -160 °C gelagert. Alle nachstehenden Verfahren werden in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.
1. Kellermembranmatrixverdünnung und Plattenbeschichtung
<ol><li>Verdünnter (1:50) Wachstumsfaktor reduzierte Kellermembranmatrix, die vom Engelbreth-Holm-Schwarmtumor in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) ohne Phenolrot gereinigt wurde.</li>
	<li>Beschichten Sie Zellkulturplatten mit der entsprechenden Menge an verdünnter Kellermembranmatrix (d.h. 6-Well-Platte = 1ml, 12-Well-Platte = 0,5 ml) und bebrüten diese Platten mindestens 1 Stunde bei 37 °C.</li>
</ol>2. iPSC Wartung
HINWEIS: Die maximale Konfluenz pro Brunnen in einer 6-Well-Flachbodenplatte beträgt 1,2 x 106 Zellen.
<ol><li>Thaw kryokonreserved iPSCs in SCM mit 10 'M Y-27632 und Platte auf eine 6-Well-Platte mit verdünntem Wachstumsfaktor reduziert Kellermembran Matrix beschichtet.</li>
	<li>Halten Sie iPSCs in SCM mit 10 M Y-27632 für die ersten 24 Stunden nach dem Auftauen aufrecht. Wechseln Sie nach 24 Stunden auf frisches Medium.</li>
	<li>Bewahren Sie iPSCs in SCM auf, bis die Zellen vor dem Passieren 80-90% Koninfluenza erreichen.<ol>
<li>Berechnen Sie, wie viele iPSCs für die Differenzierung benötigt werden, indem Sie die gewünschte Dichte zur Differenzierung (15.600 Zellen/cm2) mit der Oberfläche des Brunnens multiplizieren. Für eine 6-Well-Flachbodenplatte 15.600 Zellen/cm2 x 9,6 cm2 für insgesamt 149.760 Zellen/Well multiplizieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um durchzufahren, waschen Sie die Zellen mit Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS). Dann inkubieren Sie die Zellen mit nicht-enzymatischer Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (siehe Materialliste) für 5 Minuten bei 37 °C.<ol>
<li>Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen sanft zu entfernen. Sammeln Sie Zellen in frischem SCM.</li>
		<li>Plattenzellen auf Zellkulturplatten, die mit verdünntem SCM beschichtet sind, und halten Zellen, wie in Schritt 2.3 beschrieben, oder lagern sie bei 1,2 x 106 Zellen/ml in 1 ml SCM, 10 M Y-27632 und 10 % DMSO (v/v) in kryopservierten Durchstechflaschen in flüssigem Stickstoff bei einer Temperatur von -160 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Differenzierung von iPSCs zu BMECs
HINWEIS: Nicht-enzymatische EDTA trennt Zellen in Klumpen. Enzymatische EDTA (siehe Materialtabelle) trennt Zellen in einzellige Suspension. Retinsäure (RA) sollte vor Licht geschützt werden.
<ol><li>Waschen Sie iPSCs einmal mit Dulbeccophosphat Buffer Saline (DPBS). Mit enzymatischer EDTA (1 ml für 6-Well-Platte, 0,5 ml für 12-Well-Platte und 0,25 ml für 24-Well-Platte) ca. 5 Minuten bei 37 °C inkubieren, um eine Einzelzellsuspension zu ergeben.</li>
	<li>Sammeln Sie Zellen und Zentrifuge bei 300 x g (relative Zentrifugalkraft) für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Resuspend Zellpellets in SCM mit 10 M Y-27632.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Zelldichte mit Trypan Blue und einem automatisierten Zellzähler oder einem Hämozytometer. Plattenzellen mit einer Dichte von 15.600 Zellen/cm2 oder 149.760 Zellen/Well einer 6-Well-Flachbodenplatte (mit einer Oberfläche von 9,6 cm2/well) in SCM mit 10 'M Y-27632 für 24 Stunden.</li>
	<li>Initiieren Sie die Differenzierung nach 24 Stunden, indem Sie SCM in E6-Medium ändern. Ändern Sie E6 medium täglich für die nächsten 4 Tage.</li>
	<li>Ersetzen Sie am 4. Tag der Differenzierung E6 medium durch hESFM, ergänzt durch verdünnte (1:200) B27 Ergänzung, 20 ng/mL bFGF und 10 M RA. Ändern Sie dieses Medium nicht für die nächsten 48 Stunden.</li>
	<li>200 ml hESFM mit verdünntem (1:200) B27 vorbereiten, 1 ml 50x konzentrierte B27-Ergänzung zu 199 ml hESFM mischen.</li>
	<li>Bereiten Sie 20 ng/ml bFGF vor, indem Sie 50 g bFGF in 250 l Tris-Puffer (5 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl) rekonstituieren, um eine 200-g/ml-Stammlösung herzustellen. Bereiten Sie 200 ml hESFM mit 20 ng/mL bFGF vor, indem Sie 20 l von 200 g/ml bFGF mit 200 ml hESFM mischen.</li>
	<li>Bereiten Sie 10 M RA vor, indem Sie zuerst eine 40 mg/ml RA-Lagerlösung herstellen, indem Sie 2,5 ml DMSO auf 100 mg RA-Pulver hinzufügen. Verdünnen Sie diese Konzentration auf 3 mg/ml, um eine 10 mM Stofflösung herzustellen. Bereiten Sie 200 ml hESFM mit einer Menge von 10 M RA vor, indem Sie 200 l von 10 m RA in 200 ml hESFM mischen.</li>
</ol>4. Beschichtung Kollagen IV (COL4) und Fibronectin (FN) Matrix zur Reinigung von iPSC-Derived BMEC
<ol><li>Fügen Sie 2 ml steriles Wasser auf 2 mg FN hinzu, um 1 mg/ml FN-Stammlösung herzustellen. Fügen Sie 5 ml steriles Wasser auf 5 mg COL4 hinzu, um eine 1 mg/ml COL4-Stammlösung herzustellen.<ol>
<li>LASSEN Sie FN für mindestens 30 Minuten bei 37 °C auflösen und der COL4 bei Raumtemperatur auflösen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die FN-Stammlösung in sterilem Wasser auf eine Endkonzentration von 100 g/ml und COL4-Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von 400 g/ml verdünnt.</li>
	<li>Beschichten Sie die gewünschten Platten (6-Well-Platte = 1 ml COL4/FN-Lösung, 12-Well-Platte = 0,5 ml, 24-Well-Platte = 0,25 ml und 12-Transwell-gefilterte Platte = 0,25 ml) mit der Mischung aus 400 g/ml COL4 und 100 g/ml FN.</li>
	<li>Platten mindestens 2 Stunden oder über Nacht bei 37 °C inkubieren; für Transwell gefilterte Platten wird mindestens 4 Stunden empfohlen.</li>
</ol>5. Unterkultur und Reinigung von iPSC-abgeleiteten BMECs
HINWEIS: Die Inkubation mit enzymatischer EDTA kann je nach Konfluenz der Zellen am 6. Tag der Differenzierung länger als 15 Minuten dauern.
<ol><li>Am 6. Tag der Differenzierung, waschen Zellen zweimal mit DPBS. Mit 1 ml enzymatischer EDTA mindestens 15 Minuten bei 37 °C inkubieren, bis eine einzellige Suspension erhalten ist.</li>
	<li>Sammeln Sie Zellen über Zentrifugation bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Resuspend Zellpellets mit frischem hESFM mit verdünnten (1:200) B27 Ergänzung, 20 ng/mL bFGF, und 10 M RA.</li>
	<li>Samenzellen auf Platten, die mit einer Mischung aus 400 g/mL COL4 und 100 g/ml FN beschichtet sind. Samenzellen mit einem Verhältnis von 1 Brunnen einer 6-Well-Platte zu 3 Brunnen einer 12-Well-Platte, 3 Brunnen einer 12-Transwell-gefilterten Platte oder 6 Brunnen einer 24-Well-Platte.</li>
	<li>Saat undifferenzierte iPSCs aus der gleichen Zelllinie auf COL4/FN beschichtet12-Transwell gefilterte Platte als Negativkontrolle für die TEER-Analyse.</li>
	<li>Nach 24 Stunden Sub-Kultivierung, ändern Medium zu hESFM mit B27 Ergänzung nur. Nach diesem Schritt sind keine mittleren Änderungen erforderlich.</li>
</ol>6. Sprouting Assay
<ol><li>Sammeln Sie Day 8 iPSC-abgeleitete BMECs und säen Sie sie mit 100.000 Zellen/Well auf eine 24-Well-Flachbodenplatte, frisch beschichtet mit 200 l/cm2 Kellermembranmatrix.</li>
	<li>Behandeln Sie diese Zellen mit hESFM mit verdünntem (1:200) B27 und 40 ng/ml vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor A (VEGFA165).</li>
	<li>Beobachten Sie Zellen alle 24 Stunden und ändern Sie das Medium alle zwei Tage.</li>
</ol>7. Immunzytochemie (ICC)
HINWEIS: ICC wird auf 24-Well-Flachbodenplatten durchgeführt.
<ol><li>Nach 48 Stunden Subkultivierung (Tag 8) zweimal Zellen mit DPBS waschen. Fix Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 Minuten.</li>
	<li>Waschen Sie Zellen dreimal mit DPBS, 5 Minuten pro Wäsche. Vorblockzellen für 1 Stunde bei Raumtemperatur in DPBS mit 5% Eselserum und 0,3% Triton X-100 (v/v).</li>
	<li>Inkubat mit primären Antikörpern: Maus Anti-Human-PECAM1 (1:100, Lager 0,5 mg/ml), Kaninchen anti-human-TJP1 (1:200, Lager 0,53 mg/ml), Maus anti-human-CLDN5 (1:200, Lager 0,5 mg/ml), Maus-Anti-Human-OCLN (1:200, Lager 0,5 mg/ml) und Kaninchen Anti-Human-SLC2A1 (1:100, Lager 0,2 mg/ml) in DPBS mit 5% Eselserum über Nacht bei 4°C.<ol>
<li>Spülen Sie die Zellen einmal mit DPBS und waschen Sie dann fünfmal für 5 Minuten pro Wäsche mit DPBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie Zellen mit sekundären Antikörpern: Esel-Anti-Kaninchen Alexa Fluor 555 (1:200) und Esel-Anti-Maus 488 (1:200) in DPBS mit 5% Eselserum für 1 Stunde.</li>
	<li>Nach dieser Inkubation fügen Sie Hoechst 33342 Trihydrochlorid-Trihydrat verdünnt (1:1000) in DPBS für 10 Minuten hinzu.<ol>
<li>Entfernen Sie die Hoechst 33342 Lösung und spülen Sie sie einmal mit DPBS und waschen Sie sie viermal mit DPBS für 5 Minuten pro Wäsche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualisieren Sie Zellen auf Fluoreszenzmikroskopen, um nach Expression und Lokalisierung von Zellerstoren zu suchen.</li>
</ol>8. TEER Messung und Analyse
HINWEIS: Corning 12-Transwell gefilterte Platten sind mit Filtern ausgestattet, die aus 1,12 cm2 Polyethylenterephthalatmembranen und 0,4 Mikrometer Poren bestehen. TEER-Messungen werden in technischen (3 pro Brunnen) und biologischen Replikationen (3 Brunnen pro Zelllinie und/oder Zustand) durchgeführt.
<ol><li>Messen Sie TEER 24 Stunden nach der Subkultivierung (Tag 7) mit Essstäbchenelektroden und einem Voltohmmeter alle 24 Stunden. Spezifische Anweisungen zur Messung finden Sie im Voltohmmeter-Benutzerhandbuch.<ol>
<li>Um TEER zu messen, laden Sie das Voltohmmeter-Instrument am Vorabend auf. Wischen Sie das Instrument und die Essstäbchenelektroden mit 70% Ethanol leicht ab, bevor Sie sie in die Sicherheitshaube legen.</li>
		<li>Schalten Sie das Ohm-Messgerät ein und kalibrieren Sie es, wie vom Hersteller empfohlen.</li>
		<li>Stecken Sie die Essstäbchenelektroden ein und spülen Sie Elektroden mit 70% Ethanol gefolgt von DPBS.</li>
		<li>Legen Sie die kürzere Endelektrode in den Transbrunneneinsatz (die apikale Kammer) und das längere Ende in die basolaterale Kammer.</li>
		<li>Messen Sie zunächst einen Rohbrunnen, der nur mit COL4/FN beschichtet ist. Dann messen Sie die anderen Brunnen.</li>
		<li>Schnelles Spülen von Essstäbchenelektroden mit 70% Ethanol, gefolgt von DPBS bei der Messung verschiedener Bedingungen (d. h. Messung verschiedener Zelllinien).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nachdem alle Messungen (in Ω) aufgezeichnet wurden, spülen Sie Essstäbchenelektroden mit 70% Ethanol und dann sterilem Wasser aus. Elektrode vorsichtig abwischen und in der Sicherheitshaube die Luft trocknen lassen.</li>
	<li>Durchschnittliche Ausführung der teER-Werte (in Ω) aus dem leeren Brunnen, und subtrahieren Sie diesen Durchschnittswert von jedem Rohwert des TEER nach Bedingung.<ol>
<li>Durchschnittlich die subtrahierten Werte und multiplizieren Sie sie mit 1,12 cm2 (die Oberfläche des 12-Transwell-Einsatzes).</li>
		<li>Verwenden Sie transformierte Werte aus Schritt 6, um das Diagramm mit TEER-Wert und Standardfehlern für jeden Tag der TEER-Messung zu generieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Efflux Transporter Aktivität und Analyse
HINWEIS: Efflux Transporter Aktivität Assay wird auf einer 24-well-Flachbodenplatte durchgeführt. Zu den Voninteresse entoselnden Efflux-Transportern gehören ABCB1 und ABCC1. Es wird empfohlen, dass jede Bedingung in Dreifacharbeit mit Kontrollbrunnen (d. h. leerer Brunnen ohne die jeweiligen Inhibitoren) durchgeführt wird.
<ol><li>Nach 48 Stunden Subkultivierung (Tag 8) brüten Zellen mit 10 M Valspodar (ABCB1-Hemmer) oder 10 M MK571 (ABCC1-Hemmer) 1 Stunde bei 37 °C.<ol>
<li>Bereiten Sie 10 mM Valspodar-Bestand vor, indem Sie 5 mg Pulver (1214,64 g/mol) in 412 l DMSO auflösen und auf eine Arbeitskonzentration von 10 m verdünnen. Um z. B. 10 ml hESFM mit 10 m Valspodar herzustellen, mischen Sie 10 l von 10 ml Valspodar-Bestand mit 10 ml hESFM.</li>
		<li>Bereiten Sie 10 mM MK571 Vorrat vor, indem Sie 5 mg Pulver (537,07 g/mol) in 931 l auflösen und auf eine Arbeitskonzentration von 10 m verdünnen. Um z. B. 10 ml hESFM mit 10 M MK571 herzustellen, mischen Sie 10 l von 10 mM MK571 Lager mit 10 ml hESFM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach 1 Stunde die Zellen mit 10 M Rhodam 123 (ABCB1-Substrat) oder 10 M 2',7'--Dichlorodihydrofluorescein-Diaacetat (H2DCFDA, ABCC1-Substrat) mit oder ohne ihre jeweiligen Inhibitoren 1 Stunde bei 37 °C inkubieren.<ol>
<li>Bereiten Sie 10 mM Rhodamin 123 vor, indem Sie 10 mg Pulver (380,82 g/mol) in 875 l DMSO auflösen und auf eine Arbeitskonzentration von 10 m verdünnen. Um z. B. 10 ml hESFM mit 10 M Rhodamine 123 herzustellen, mischen Sie 10 l von 10 mM Rhodamine 123 Mit 10 ml hESFM.</li>
		<li>Bereiten Sie 10 mM H2DCFDA vor, indem Sie 50 mg Pulver (487,29 g/mol) in 10,26 ml DMSO auflösen und auf eine Arbeitskonzentration von 10 m verdünnen. Um z. B. 10 ml hESFM mit 10 M Rhodamine 123 herzustellen, mischen Sie 10 l von 10 mM Rhodamine 123 Mit 10 ml hESFM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie Zellen zweimal mit 0,5 ml DPBS und Lyse mit DPBS, die 5% Triton-X (v/v) enthalten.</li>
	<li>Messen Sie die Fluoreszenz der lysierten Zellen mit einem Multi-Platten- oder Mikroplattenleser (siehe Materialliste).<ol>
<li>Stellen Sie das Fluoreszenzplattenleser-Instrument auf 485 Nanometer Anregung und 530 Nanometer-Emission ein und messen Sie die Fluoreszenz bei diesen Wellenlängen.</li>
		<li>Für Brunnen, die nicht im Transportertest verwendet werden, waschen Sie Zellen zweimal mit DPBS, bevor Sie sie mit 4% PFA für die Zellkernquantifizierung fixieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie Zellen mit Hoechst 33342 Trihydrochlorid-Trihydrat verdünnt (1:1000) in DPBS für 10 Minuten. Bild mehrere visuelle Felder in jedem Brunnen, um die durchschnittliche Anzahl von Zellkernen mit Fluoreszenzmikroskopen zu berechnen.</li>
	<li>Zählen Sie Kerne mit Fidschi und normalisieren Sie Fluoreszenzwerte pro Zelle auf diese Zählungen.<ol>
<li>Berechnen Sie die durchschnittliche Fluoreszenzakkumulation, indem Sie den Rohfluoreszenzakkumulationswert für jede Bedingung von ihrem jeweiligen Rohwert subtrahieren.</li>
		<li>Durchschnittliche subtrahierte Werte für jede Bedingung.</li>
		<li>Teilen Sie Durchschnittswerte aus Schritt 9.6.1 durch die durchschnittliche Zellenanzahl. Verwenden Sie diese Werte, um Fluoreszenzwerte pro Zelle zu normalisieren.</li>
		<li>Verwenden Sie normalisierte Werte, um eine grafische Darstellung für jede Inhibitorbedingung zu generieren und alle erforderlichen statistischen Analysen durchzuführen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. Passieren, Erweitern und Kryokonservierung von BMECs
<ol><li>Tag 8 BMEC-Kulturen mit frischem hESFM auffüllen, ergänzt durch verdünntes (1:200) B27 und lassen Die Zellen auf der COL4/FN-Matrix noch zwei Tage expandieren.</li>
	<li>Beschichten Sie eine neue 12-Transwell-gefilterte Platte und eine 24-Well-Flachbodenplatte mit 400 g/mL COL4 und 100 g/mL FN und brüten 4 Stunden lang.</li>
	<li>Am 10. Tag die Zellen mit DPBS waschen und mit 1 ml enzymatischer EDTA mindestens 15 Minuten bei 37 °C inkubieren, bis eine Einzelzellsuspension erhalten ist.</li>
	<li>Sammeln Sie Zellen über Zentrifugation bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.<ol>
<li>Um diese Zellen kryokonservieren, setzen Sie Zellpellets mit frischem hESFM mit 30% Fetal Bovine Serum (FBS) und 10% DMSO wieder auf.</li>
		<li>IPSC-abgeleitete BMECs in kryokonservierten Fläschchen in einem Isopropanol-Behälter für die ersten 24 Stunden bei -80 °C lagern und dann in flüssigen Stickstoff zur Langzeitlagerung bei -160 °C geben.</li>
		<li>Um diese Zellen zu durchleben, setzen Sie Zellpellets mit frischem hESFM, ergänzt durch verdünntes (1:200) B27, wieder auf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Samenzellen auf beschichteten Platten, die in Schritt 10.2 hergestellt werden. Samenzellen mit einem Verhältnis von 1 Brunnen einer 6-Well-Platte zu 3 Brunnen einer 12-Transwell-gefilterten Platte und zu 6 Brunnen einer 24-Well-Platte. Lassen Sie Zellen 24 Stunden lang wachsen und erweitern.</li>
	<li>Messen Sie TEER am 11. Tag anhand der in Schritt 8 aufgeführten Schritte.</li>
	<li>Führen Sie am 12. Tag ICC aus, indem Sie die in Schritt 9 aufgeführten Schritte ausführen.</li>
	<li>Um kryokonservierte BMECs aufzutauen, legen Sie die kryokonservierten Fläschchen in ein warmes Wasser oder Perlenbad bei 37oC. Dann übertragen Sie die aufgetauten BMECs auf 5 ml hESFM, ergänzt durch verdünntes (1:200) B27.<ol>
<li>Sammeln Sie Zellen über Zentrifugation bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Setzen Sie die Zellen in hESFM, ergänzt durch verdünnte (1:200) B27, 10 M RA und 10 M Y-27632.</li>
		<li>Nach 24 Stunden schalten Sie Medium auf hESFM, ergänzt durch verdünnte (1:200) B27 und 10 'M Y-27632 ohne RA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Änderungen und Fehlerbehebung
In diesem Protokoll haben wir einige Änderungen bei der Verwendung einer häufig verwendeten extrazellulären Matrix und Zellkulturmedien während der iPSC-Kultivierung für die Ableitung von BMECs vorgenommen (Abbildung 1). Diese Änderungen hatten keinen Einfluss auf die Fähigkeit, BMECS aus menschlichen iPSCs abzuleiten, wie im Lippmann-Protokoll1beschrieben. Eine iPSC-Leitung eines anderen gesun...

Blut-Hirn-Barriere-Funktion Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) bildet eine Grenze, die die Bewegung von Substanzen aus dem Blut zum Gehirn einschränkt. Die BBB besteht aus mikrovaskulären Endothelzellen (BMECs) des Gehirns, die eine Monoschicht bilden, die die Vaskulatur auskundaufzen. BMECs bilden zusammen mit Astrozyten, Neuronen, Pericyten, Mikroglia und extrazellulärer Matrix die neurovaskuläre Einheit. BMECs haben eine streng regulierte parazelluläre Struktur, die es dem BBB ermöglicht, einen hohen transendotheliaalen elektrischen Widerstand (TEER) aufrechtzuerhalten, der die passive Diffusion begrenzt und als Indikator für die Barriereintegrität1,2dient. BMECs haben auch Proteine, die bei der transzellulären Bewegung wie Endozytose, Transzytose und Transmigration sowie Extravasation von Leukozyten während einer Immunantwort unterstützen3. BMECs sind auf Zustrom- und Efflux-Transporter für die Ernährung und Entfernung von Abfallprodukten angewiesen, um ein heimelatisativer Gleichgewicht im Gehirn zu halten3. So ist beispielsweise die Solute Carrier Family 2 Member 1 (SLC2A1) ein Zustromtransporter, der für die Bewegung von Glukose über die BBB4verantwortlich ist, während Efflux-Transporter wie die ATP-Bindungskassette Unterfamilie B Member 1 (ABCB1) und die ATP-Bindungskassette Unterfamilie C Member 1 (ABCC1) für die Rückführung von Substraten in den Blutkreislauf verantwortlich sind3,5,6,7. ABCB1-Substrate sind Morphin, Verapamil4und Antipsychotika wie Olanzapin und Risperidon8, während der ABCC1-Transporter eine Vielzahl von Substraten hat, einschließlich Sulfatkonjugate, Vincrinin und Glucuronid-Konjugate4.
Anwendung von BBB-Modellen bei psychiatrischen Störungen BBB Dysfunktion wurde in eine Reihe von neurologischen und psychiatrischen Störungen verwickelt, einschließlich Schizophrenie und bipolare Störung9,10. Kürzlich werden iPSC-abgeleitete ex vivo-Zellmodelle verwendet, um die zellulären und molekularen Grundlagen psychiatrischer Störungen zu hinterfragt, aber diese Modelle berücksichtigen derzeit nicht die potenzielle Rolle, die die Neurovaskulatur11,12,13spielt. Es wird vermutet, dass periphere entzündliche Zytokine, die im Blut zirkulieren, die BBB14,15,16,17, aber es gibt auch Beweise für parazelluläre18,19,20,21,22, transzellulär23,24,25,26,27,28,29und extrazelluläre Matrix20,29,30,31,32 Anomalien, die zur BBB Dysfunktion beitragen. Eine Störung des BBB kann dazu führen, dass der Inhalt des Blutes in das Blut parenchyma eintritt und aktivierte Astrozyten und/oder Mikroglia, um proinflammatorische Zytokine freizusetzen, die wiederum eine Entzündungsreaktioninitiieren 33, die schädliche Auswirkungen auf das Gehirn haben kann34. BMECs sind die primäre Komponente der BBB und die Untersuchung der Struktur und Funktion dieser Zellen kann das Verständnis der BBB Dysfunktion bei neurologischen und psychiatrischen Störungen verbessern.
Alternative BMEC-Modelle Vor der Entwicklung effizienter Protokolle zur Ableitung von BMECs aus iPSCs1,6,35,36hatten Forscher verewigte BMECs37 eingesetzt, um die BBB-Funktion zu untersuchen. Viele dieser Modelle erreichten jedoch keine wünschenswerten BBB-Phänotypen, wie einen physiologischen Bereich von TEER-Werten38,39. Die Verwendung von iPSCs hat den Vorteil, dass der genetische Hintergrund des Individuums, aus dem die Zellen abgeleitet sind, erhalten bleibt. Wissenschaftler arbeiten aktiv an der Entwicklung von iPSC-abgeleiteten ex-vivo-Mikroumweltmodellen, die die Struktur und Funktion des menschlichen Gehirns rekapitulieren. Die Forscher haben Methoden entwickelt, um BMECs abzuleiten, die strukturell und physiologisch ähnlich wie BMECs sind,die in vivo gefunden werden. Methoden zur Gewinnung gereinigter Populationen von iPSC-abgeleiteten BMECs erfordern eine Reihe verschiedener Schritte, wobei Protokolle in den letzten Jahren optimiert wurden1,6,35,36. Im Allgemeinen werden iPSC-abgeleitete BMECs in Essential 6 (E6) Medium für 4 Tage kultiviert, gefolgt von 2 Tagen in humanen endothelialen Serum-freien Medium (hESFM) ergänzt mit grundlegenden Fibroblast wachstumsfaktor (bFGF), Retinsäure (RA), und B27 Ergänzung. Die Zellen werden dann auf einer Kollagen-IV-Matrix (COL4) und Fibronectin (FN) kultiviert, um >90% homogene BMECs1zu erhalten.
Die Identität von BMECs wird durch Immunfluoreszenz bestätigt, die die Koexpression von BMEC-Proteinen einschließlich Thrombozyten-Endothel-Zelladhäsionsmolekül-1 (PECAM1), SLC2A1 und engen Knotenproteinen wie engem Knotenprotein 1 (TJP1), Occludin (OCLN) und Claudin-5 (CLDN5)6zeigt. Sprouting-Assays wurden verwendet, um das angiogene Potenzial von iPSC-abgeleiteten BMECs zu bestätigen. 6 Die BBB-Integrität von BMECs wird durch das Vorhandensein physiologischer in vitro TEER-Werte (2000 x cm2)37 und messbare Aktivität für Efflux-Transporter wie ABCB1 und ABCC11,6,36. Jüngste methodische Fortschritte der Lippmann-Gruppe haben zu iPSC-abgeleiteten BMEC-Protokollen mit reduzierter experimenteller Variabilität und verbesserter Reproduzierbarkeit1geführt. Es ist jedoch nicht bekannt, ob sie über die Unterkultivierungsstufe hinaus erweitert und durchdrungen werden können. Unser modifiziertes Protokoll zielt darauf ab, dieses Problem zu lösen, indem iPSC-abgeleitete BMECs über Tag 8 hinaus übergeben und bewertet werden, ob sie weiter ausgebaut werden können, um BBB-Eigenschaften nach der Kryokonservierung beizubehalten. Obwohl keine Studien die Passage von iPSC-abgeleiteten BMECs beschrieben haben, existiert ein Protokoll für die BMEC-Kryokonservierung, das physiologische BBB-Eigenschaften behält, nachdem sie einen Frost-Tau-Zyklus40durchlaufen haben. Es ist jedoch nicht bekannt, dass BMECs nach der Kryokonservierung durchundlassen und BBB-Eigenschaften behalten können.
BMECs, die von iPSCs mit dem Lippmann-Protokoll abgeleitet wurden, wurden verwendet, um BBB-Störungen bei neurologischen Erkrankungen wie der Huntington-Krankheit zu modellieren7. Solche iPSC-abgeleiteten BMECs wurden auch verwendet, um die Auswirkungen von bakteriellen Infektionen wie Neisseria meningitidis oder Gruppe B Streptococcus auf Störung der Blut-CSF-Barriere und BBB bzw.41,42zu untersuchen. Auch mit iPSC-abgeleiteten BMECs von 22q-Deletion-Syndrom-Patienten mit Schizophrenie, Forscher beobachteten eine Zunahme der interzellulären AdhäsionMolekül-1 (ICAM-1), ein wichtiges Adhäsionsmolekül in BMECs, die bei der Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten in das Gehirn43helfen. Zusammengenommen zeigen diese Studien den Nutzen von iPSC-abgeleiteten BMECs für die Untersuchung von BBB-Störungen bei komplexen neuropsychiatrischen Störungen.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-Dichlordidifluoresceindiacetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6964-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Esel Anti-Maus IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Esel Anti-Kaninchen IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>B27 Ergänzung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1) (89C2) Maus-mAb-Zellsignalisierung</td><td></td><td>3528S</td><td></td></tr><tr><td>CLDN5 (Claudin-5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35-2500</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen IV aus menschlicher Plazenta</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5533-5mg</td><td></td></tr><tr><td>Corning 2 ml Kryo-Fläschchen aus Polypropylen mit Innengewinde</td><td>Corning</td><td>&nbsp; 8670</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Costar Zellkulturplatten mit flachem Boden (6 Vertiefungen)</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Falcon Zellkulturplatten mit flachem Boden (24 Wells)</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell Multi-Well-Platte mit permeablen Polyester-Membraneinsätzen (12 Wells)</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Countess Objektträger</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (ohne Phenolrot)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td> </td><td></td>A1413202</tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2438-50mL</td><td></td></tr><tr><td>Eselsserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663-10ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (+/+)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>14040-117</td><td></td></tr><tr><td>Epithel Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2</td><td>World Precision Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 Medium (Thermo Fisher)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>A1516401</tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2006-2mg</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basal Membrane Matrix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balance Salzlösung mit Calcium und Magnesium&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydrochlorid, Trihydrat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Humanes endotheliales serumfreies Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11111044</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 6000</td><td>General Electric</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Countess Automated Cell Counter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MK-571</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7571-5MG</td><td></td></tr><tr><td>NutriStem</td><td>Stemgent</td><td>01-0005</td><td></td></tr><tr><td>Occludin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16%</td><td>Elektronenmikroskopie Dienstleistungen</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Envision 2103 Multi-Plate Reader</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Human VEGF 165</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Retinsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamin 123</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83702-10MG</td><td></td></tr><tr><td>SLC2A1 (GLUT-1)</td><td>ThermoFisher</td><td>PA1-21041</td><td></td></tr><tr><td>SOX17</td><td>Zellsignalisierung</td><td>81778S</td><td></td></tr><tr><td>TJP-1 (ZO-1)</td><td>ThermoFisher</td><td>PA5-28869</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauer Farbstoff (0,4%) zur Verwendung mit dem Countess Automated Cell Counter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Valspodar (Sigma) (Cyclosporin A)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML0572-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Versene Lösung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochlorid (ROCK-Inhibitor)</td><td>Tocris/ Thermo Fisher Scientific</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

ableitung, expansion, kryokonservierung und charakterisierung von mikrovaskulären endothelzellen des gehirns aus humaninduzierten pluripotenten stammzellen

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Mikrovaskuläre Endothelzellen (BMECs) im Gehirn können von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unterschieden werden, um ex vivo-Zellmodelle zur Untersuchung der Funktion der Blut-Hirn-Schranke (BBB) zu entwickeln. Dieses modifizierte Protokoll enthält detaillierte Schritte zum Ableiten, Erweitern und Kryokonservieren von BMECs von menschlichen iPSCs, die einen anderen Spender und Reagenzien verwenden als in früheren Protokollen. iPSCs werden mit essentiellen 6 Medium für 4 Tage behandelt, gefolgt von 2 Tagen menschlichen endothelialen Serum-freien Kulturmedium mit grundlegenden Fibroblast wachstumsfaktor, Retinsäure, und B27 Ergänzung ergänzt. An Tag 6 werden die Zellen 2 Tage lang auf eine Kollagen-Fibronectin-Matrix subkultiviert. Die Immunzytochemie wird an Tag 8 für die BMEC-Markeranalyse mit CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 und SLC2A1 durchgeführt. Western Blotting wird durchgeführt, um den BMEC-Markerausdruck und das Fehlen von SOX17, einem endodermalen Marker, zu bestätigen. Angiogenic Potenzial wird mit einem keimenden Assay demonstriert. Der transendotheliale elektrische Widerstand (TEER) wird ab Tag 7 mit Essstäbchenelektroden und Voltohmmeter gemessen. Die Efflux-Transporteraktivität für die ATP-Bindungskassette Unterfamilie B-Mitglied 1 und die ATP-Bindungskassette Unterfamilie C-Mitglied 1 wird an Tag 8 mit einem Mehrplattenleser gemessen. Die erfolgreiche Ableitung von BMECs wird durch das Vorhandensein relevanter Zellmarker, niedrige SOX17-Spiegel, angiogenes Potenzial, Transportaktivität und TEER-Werte Ω x cm2bestätigt. BMECs werden bis zum 10. Tag erweitert, bevor sie auf frisch beschichtete Kollagen-/Fibronectinplatten oder Kryopreservede übergeben werden. Dieses Protokoll zeigt, dass iPSC-abgeleitete BMECs mindestens einmal erweitert und durchlaufen werden können. Nach der Kryokonservierung wurden jedoch niedrigere TEER-Werte und eine schlechtere Lokalisierung von BMEC-Markern beobachtet. BMECs können in Co-Kultur-Experimenten mit anderen Zelltypen (Neuronen, Glia, Pericyten), in dreidimensionalen Gehirnmodellen (Organ-Chip und Hydrogel), zur Vaskularisierung von Hirnorganoiden und zur Untersuchung von BBB-Dysfunktion bei neuropsychiatrischen Störungen eingesetzt werden.

BMEC-Differenzierung Einige kritische Schritte in diesem Protokoll sollten genau befolgt werden (Abbildung 1). E6 mittlere Nutzung an Tag 1 ist wichtig, da es oft für die Ableitung von Neuroektoderm Linie von iPSCs innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums, die reproduzierbare Ergebnisse über mehrere Zelllinien36. Ein weiterer wichtiger Schritt ist der 4. Tag der Differenzierung, bei dem E6-Medium auf hESFM mit verdünnten (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF ...

Dieses Protokoll beschreibt eine angepasste Methode zur Ableitung, Erweiterung und Kryokonservierung mikrovaskulärer Endothelzellen des Gehirns, die durch Differenzierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, und zur Untersuchung der Eigenschaften der Bluthirnschranke in einem Ex-vivo-Modell.

Ableitung, Expansion, Kryokonservierung und Charakterisierung von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns aus humaninduzierten Pluripotenten Stammzellen

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

BMECs, die aus iPS-Zellen generiert werden, liefern neue experimentelle Modelle zur Untersuchung der Funktion und Dysfunktion der Blut-Hirn-Schranke. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um zu untersuchen, ob BMECs ihre Barriereeigenschaften nach Expansion und Kryokonservierung beibehalten. Diese Technik ermöglicht die Generierung von krankheitsspezifischen BMECs von Patienten mit Erkrankungen, bei denen eine Störung der Blut-Hirn-Schranke eine Rolle in der Pathophysiologie der Krankheit spielt.Um die BMEC-Differenzierung von humanen iPSCs zu induzieren, waschen Sie die konfluente iPSC-Kultur einmal mit DPBS, bevor Sie die Zellen etwa fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit dem entsprechenden Volumen enzymatischer EDTA inkubieren. Wenn eine Einzelzellsuspension erhalten wurde, entnehmen Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in einem geeigneten Volumen Stammzellmedium, das mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren zur Zählung versetzt wird. Verdünnen Sie die Zellen auf 1,56 mal 10 bis 10 Zellen pro Kubikzentimeter und säen Sie zwei Milliliter Zellen in einzelne Vertiefungen mit einem flachen Boden von sechs Vertiefungen.Nach 24 Stunden im Zellkultur-Inkubator ersetzen Sie den Überstand in jeder Vertiefung durch E6-Medium und stellen Sie die Platte für weitere vier Tage in den Inkubator zurück. Um die iPSC-abgeleiteten BMECs zu reinigen, beschichten Sie die Subkulturplatten mit dem entsprechenden Volumen einer frisch zubereiteten Kollagen-IV- und Fibronektinlösung pro Vertiefung und inkubieren Sie die Platten mindestens zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Am sechsten Tag der Differenzierung werden die Zellen durch Zentrifugation entnommen und die Pellets in der entsprechenden Menge an frischem humanem endothelialem serumfreiem Medium, das mit B27, basischen Fibroblasten, Wachstumsfaktor und Retinsäure ergänzt wird, resuspendiert.Für die TEER-Analyse werden die differenzierten Zellen in jede Vertiefung einer mit Kollagen und Fibronektin beschichteten 12-Transwell-gefilterten Platte plättiert. Für die Analyse der Effluxtransporteraktivität werden die Zellen in jede Vertiefung einer mit Kollagen und Fibronektin beschichteten 24-Well-Platte mit flachem Boden plädiert. Ersetzen Sie nach 24 Stunden Subkultur den Überstand in jeder Vertiefung durch frisches humanes endotheliales serumfreies Medium, das nur mit B27-Präparat ergänzt wird.Um die Blut-Hirn-Schranken-Eigenschaften der BMECs mit TEER zu messen, laden Sie das TEER-Instrument über Nacht auf und wischen Sie das Instrument und die Essstäbchenelektroden leicht mit 70 % Ethanol ab, bevor Sie sie in die Sicherheitshaube legen. Schalten Sie das Gerät ein und kalibrieren Sie das Ohmmeter nach Herstellerangaben. Stecken Sie die Elektroden ein und spülen Sie sie einmal mit 70% Ethanol und einmal mit DPBS aus.Das kürzere Ende der Elektrode wird in die atypische Kammer des Einsatzes und das längere Ende in die basolaterale Kammer einer Blindvertiefung eingeführt. Spülen Sie nach der Messung des negativen Kontrollverhaltens die Elektroden schnell wie gezeigt und messen Sie die erste experimentelle Vertiefung. Nachdem alle Messungen aufgezeichnet wurden, spülen Sie die Essstäbchenelektroden erneut aus, wischen Sie die Elektroden vorsichtig ab und lassen Sie sie in der Schutzhaube an der Luft trocknen.Um die Effluxtransporteraktivität der Zellen zu beurteilen, wird am achten Tag der Kultivierung die entsprechende Anzahl von Vertiefungen mit einer 10-mikromolaren Effluxtransporter-Inhibitorlösung behandelt und für eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator gestellt. Behandeln Sie die Zellen am Ende der Inkubation eine Stunde lang im Inkubator mit einer 10 mikromolaren Efflux-Transporter-Substratlösung. Waschen Sie am Ende der Inkubation jede Vertiefung zweimal mit 500 Mikrolitern DPBS pro Vertiefung, bevor Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern DPBS, ergänzt mit 5 % Triton-X pro Vertiefung, lysieren.Nach fünf Minuten messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die Fluoreszenz der lysierten Zellen bei einer Anregung von 485 Nanometern und einer Emission von 530 Nanometern. Bei Vertiefungen, die nicht im Transporter-Assay verwendet werden, waschen Sie die Zellen zweimal mit DPBS, bevor Sie sie mit 4 % Paraformaldehyd pro Zellkernquantifizierung fixieren. Nach einem Tag Kultivierung im E6-Medium ist die Zellmorphologie ähnlich wie bei iPSCs.Am vierten Tag unterscheiden sich die Zellen sichtbar von iPS-Zellen und bedecken den größten Teil der Vertiefung. Eine zweitägige Kultivierung in humanem endothelialem serumfreiem Medium führt zu einem länglichen und kopfsteingepflasterten Aussehen in den Zellen. Am achten Tag bilden einzelne Zellen ein meist großes Kopfsteinpflastermuster.Ein Keimungsassay kann durchgeführt werden, um das angiogene Potenzial von iPSC-abgeleiteten BMECs zu demonstrieren. Dies führt nach dreitägiger Behandlung mit Wachstumsfaktoren zur Entwicklung röhrenartiger Strukturen. Die iPSC-abgeleiteten BMECs, die mit diesem Protokoll erzeugt wurden, koexprimierten Tight-Junction-Proteine, die in Endothelzellen im Gehirn, in der Lunge, in der Leber und in der Niere exprimiert werden, sowie vaskuläre endotheliale Marker, die an der Blut-Hirn-Schranke exprimiert werden.Wie beobachtet, zeigen iPSC-abgeleitete BMECs 48 Stunden nach Subkultur und Mediumwechsel TEER-Werte innerhalb des beschriebenen Bereichs für iPSC-abgeleitete BMECs, die mit primären Astrozyten der Ratte kokultiviert wurden. In diesem Stadium wurde auch eine Aktivität des Efflux-Transporters beobachtet. Nach der Kryokonservierung sind die TEER-Messungen im Vergleich zu frisch gewonnenen BMECs niedriger.Die Western-Blot-Analyse zeigt reduzierte Konzentrationen von Tight-Junction-Markern wie Occludin, während die Immunzytochemie sommersprossige und/oder ausgefranste Muster von Tight-Junction-Proteinen zeigt. Eine zu hohe oder zu niedrige iPS-Dichte beeinträchtigt die Differenzierungseffizienz und die Entwicklung geeigneter Eigenschaften der Blut-Hirn-Schranke. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Barriereeigenschaften, der zellulären Signalübertragung und der Transporteraktivität unter Verwendung individualisierter BMECs, um die Physiologie und Pathophysiologie der Blut-Hirn-Schrankenfunktion zu modellieren.

derivation-expansion-cryopreservation-characterization-brain

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Kardioblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen kardialen Vorläuferzellen und funktionelle Kardiomyozyten für Herz-Kreislauf-Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Dieses Video zeigt ein Protokoll zur Induktion der Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Gehirn-Endothelzellen.

Generierung von Endothelzellen des Gehirns aus induzierten pluripotenten Stammzellen

Dieses Video zeigt einen mehrstufigen Prozess zur Differenzierung von humanen iPSCs in mikrovaskuläre Endothelzellen des Gehirns. Die daraus resultierenden differenzierten Zellen ahmen die mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns nach, die sich durch Tight Junctions auszeichnen, was sie ideal für die Erforschung von Hirnerkrankungen macht.

Differenzierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen in mikrovaskuläre Endothelzellen des Gehirns

Dieses Video zeigt eine einfache und zuverlässige Strategie zur Herstellung von Reinkulturen von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn innerhalb von 10-12 Tagen und wird nützlich für die Forschung über viele Aspekte der Gehirn Angiogenese konzentriert sein.

Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn

Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ist eine multizelluläre neurovaskuläre Einheit, die die Homöostase des Gehirns streng reguliert. Durch die Kombination menschlicher iPSCs und Organ-on-Chip-Technologien haben wir einen personalisierten BBB-Chip entwickelt, der für die Krankheitsmodellierung und Diedurchlässigkeitsvorhersagen von CNS-Medikamenten geeignet ist. Für die Erzeugung und den Betrieb des BBB-Chips wird ein detailliertes Protokoll beschrieben.

Generierung eines humanen iPSC-basierten Blut-Hirn-Barriere-Chips

Das hier beschriebene Protokoll zeigt die wichtigsten Schritte bei der Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus gehirnähnlichen Endothelzellen, der Vorbereitung von Neisseria meningitidis auf eine Infektion und der Probenentnahme für andere molekulare Analysen.

Neisseria meningitidis Infektion von induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Gehirnendothelzellen

Hier wird ein einfaches Protokoll für die gezielte Differenzierung von hämogenen Endothelzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen in ca. 1 Woche vorgestellt.

Gerichtete Differenzierung hämogener Endothelzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, die erweiterte Endothelzellkulturmethode (EECM), die die Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu mikrovaskulären Endothelzellen (BMEC)-ähnlichen Zellen des Gehirns ermöglicht. Diese Zellen zeigen die Expression von Endothelzelladhäsionsmolekülen und sind somit ein humanes Blut-Hirn-Schrankenmodell, das geeignet ist, Immunzellinteraktionen in vitro zu untersuchen.

Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen zu mikrovaskulären Endothelzellzellen des Gehirns mit einem reifen Immunphänotyp

Hier wird ein einfacher Arbeitsablauf zur Unterscheidung von Endothelzellen von humanen pluripotenten Stammzellen beschrieben, gefolgt von einem detaillierten Protokoll für ihre mechanische Stimulation. Dies ermöglicht die Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie von Endothelzellen. Dieser Ansatz ist kompatibel mit nachgeschalteten Assays von lebenden Zellen, die nach mechanischer Stimulation aus dem Kulturchip entnommen wurden.

In vitro On-Chip-Modell eines fötalen menschlichen Gefäßes zur Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie

Dieses Protokoll stellt ein Verfahren zur Erzeugung von Gefäßorganoiden unter Verwendung menschlicher pluripotenter Stammzellen vor.

Generierung von Gefäßorganoiden aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

Wir stellen ein Protokoll zur Generierung eines menschlichen Gehirnorganoids mit residenten Mikroglia vor, indem von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitete hämatopoetische Vorläuferzellen (HPCs) in die Organoidentwicklung integriert werden.

Ableitung eines Organoids des menschlichen Gehirns mit Mikroglia-Entwicklung

Erfahren Sie die Differenzierung, Expansion und Kryokonservierung von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns aus humanen iPSCs. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Blut-Hirn-Schranken-Funktionen.

Ableitung, Expansion, Kryokonservierung und Charakterisierung von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns aus humaninduzierten Pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal

Ableitung, Expansion, Kryokonservierung und Charakterisierung von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns aus humaninduzierten Pluripotenten Stammzellen

Weitere Videos entdecken