Ableitung, Expansion, Kryokonservierung und Charakterisierung von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns aus humaninduzierten Pluripotenten Stammzellen

BMECs, die aus iPS-Zellen generiert werden, liefern neue experimentelle Modelle zur Untersuchung der Funktion und Dysfunktion der Blut-Hirn-Schranke. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um zu untersuchen, ob BMECs ihre Barriereeigenschaften nach Expansion und Kryokonservierung beibehalten. Diese Technik ermöglicht die Generierung von krankheitsspezifischen BMECs von Patienten mit Erkrankungen, bei denen eine Störung der Blut-Hirn-Schranke eine Rolle in der Pathophysiologie der Krankheit spielt.

Um die BMEC-Differenzierung von humanen iPSCs zu induzieren, waschen Sie die konfluente iPSC-Kultur einmal mit DPBS, bevor Sie die Zellen etwa fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit dem entsprechenden Volumen enzymatischer EDTA inkubieren. Wenn eine Einzelzellsuspension erhalten wurde, entnehmen Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in einem geeigneten Volumen Stammzellmedium, das mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren zur Zählung versetzt wird. Verdünnen Sie die Zellen auf 1,56 mal 10 bis 10 Zellen pro Kubikzentimeter und säen Sie zwei Milliliter Zellen in einzelne Vertiefungen mit einem flachen Boden von sechs Vertiefungen.

Nach 24 Stunden im Zellkultur-Inkubator ersetzen Sie den Überstand in jeder Vertiefung durch E6-Medium und stellen Sie die Platte für weitere vier Tage in den Inkubator zurück. Um die iPSC-abgeleiteten BMECs zu reinigen, beschichten Sie die Subkulturplatten mit dem entsprechenden Volumen einer frisch zubereiteten Kollagen-IV- und Fibronektinlösung pro Vertiefung und inkubieren Sie die Platten mindestens zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Am sechsten Tag der Differenzierung werden die Zellen durch Zentrifugation entnommen und die Pellets in der entsprechenden Menge an frischem humanem endothelialem serumfreiem Medium, das mit B27, basischen Fibroblasten, Wachstumsfaktor und Retinsäure ergänzt wird, resuspendiert.

Für die TEER-Analyse werden die differenzierten Zellen in jede Vertiefung einer mit Kollagen und Fibronektin beschichteten 12-Transwell-gefilterten Platte plättiert. Für die Analyse der Effluxtransporteraktivität werden die Zellen in jede Vertiefung einer mit Kollagen und Fibronektin beschichteten 24-Well-Platte mit flachem Boden plädiert. Ersetzen Sie nach 24 Stunden Subkultur den Überstand in jeder Vertiefung durch frisches humanes endotheliales serumfreies Medium, das nur mit B27-Präparat ergänzt wird.

Um die Blut-Hirn-Schranken-Eigenschaften der BMECs mit TEER zu messen, laden Sie das TEER-Instrument über Nacht auf und wischen Sie das Instrument und die Essstäbchenelektroden leicht mit 70 % Ethanol ab, bevor Sie sie in die Sicherheitshaube legen. Schalten Sie das Gerät ein und kalibrieren Sie das Ohmmeter nach Herstellerangaben. Stecken Sie die Elektroden ein und spülen Sie sie einmal mit 70% Ethanol und einmal mit DPBS aus.

Das kürzere Ende der Elektrode wird in die atypische Kammer des Einsatzes und das längere Ende in die basolaterale Kammer einer Blindvertiefung eingeführt. Spülen Sie nach der Messung des negativen Kontrollverhaltens die Elektroden schnell wie gezeigt und messen Sie die erste experimentelle Vertiefung. Nachdem alle Messungen aufgezeichnet wurden, spülen Sie die Essstäbchenelektroden erneut aus, wischen Sie die Elektroden vorsichtig ab und lassen Sie sie in der Schutzhaube an der Luft trocknen.

Um die Effluxtransporteraktivität der Zellen zu beurteilen, wird am achten Tag der Kultivierung die entsprechende Anzahl von Vertiefungen mit einer 10-mikromolaren Effluxtransporter-Inhibitorlösung behandelt und für eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator gestellt. Behandeln Sie die Zellen am Ende der Inkubation eine Stunde lang im Inkubator mit einer 10 mikromolaren Efflux-Transporter-Substratlösung. Waschen Sie am Ende der Inkubation jede Vertiefung zweimal mit 500 Mikrolitern DPBS pro Vertiefung, bevor Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern DPBS, ergänzt mit 5 % Triton-X pro Vertiefung, lysieren.

Nach fünf Minuten messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die Fluoreszenz der lysierten Zellen bei einer Anregung von 485 Nanometern und einer Emission von 530 Nanometern. Bei Vertiefungen, die nicht im Transporter-Assay verwendet werden, waschen Sie die Zellen zweimal mit DPBS, bevor Sie sie mit 4 % Paraformaldehyd pro Zellkernquantifizierung fixieren. Nach einem Tag Kultivierung im E6-Medium ist die Zellmorphologie ähnlich wie bei iPSCs.

Am vierten Tag unterscheiden sich die Zellen sichtbar von iPS-Zellen und bedecken den größten Teil der Vertiefung. Eine zweitägige Kultivierung in humanem endothelialem serumfreiem Medium führt zu einem länglichen und kopfsteingepflasterten Aussehen in den Zellen. Am achten Tag bilden einzelne Zellen ein meist großes Kopfsteinpflastermuster.

Ein Keimungsassay kann durchgeführt werden, um das angiogene Potenzial von iPSC-abgeleiteten BMECs zu demonstrieren. Dies führt nach dreitägiger Behandlung mit Wachstumsfaktoren zur Entwicklung röhrenartiger Strukturen. Die iPSC-abgeleiteten BMECs, die mit diesem Protokoll erzeugt wurden, koexprimierten Tight-Junction-Proteine, die in Endothelzellen im Gehirn, in der Lunge, in der Leber und in der Niere exprimiert werden, sowie vaskuläre endotheliale Marker, die an der Blut-Hirn-Schranke exprimiert werden.

Wie beobachtet, zeigen iPSC-abgeleitete BMECs 48 Stunden nach Subkultur und Mediumwechsel TEER-Werte innerhalb des beschriebenen Bereichs für iPSC-abgeleitete BMECs, die mit primären Astrozyten der Ratte kokultiviert wurden. In diesem Stadium wurde auch eine Aktivität des Efflux-Transporters beobachtet. Nach der Kryokonservierung sind die TEER-Messungen im Vergleich zu frisch gewonnenen BMECs niedriger.

Die Western-Blot-Analyse zeigt reduzierte Konzentrationen von Tight-Junction-Markern wie Occludin, während die Immunzytochemie sommersprossige und/oder ausgefranste Muster von Tight-Junction-Proteinen zeigt. Eine zu hohe oder zu niedrige iPS-Dichte beeinträchtigt die Differenzierungseffizienz und die Entwicklung geeigneter Eigenschaften der Blut-Hirn-Schranke. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Barriereeigenschaften, der zellulären Signalübertragung und der Transporteraktivität unter Verwendung individualisierter BMECs, um die Physiologie und Pathophysiologie der Blut-Hirn-Schrankenfunktion zu modellieren.