Wir stellen eine gentechnisch veränderte (GV-freie) Methode vor, um Zellen mit einem neuronalen Phänotyp aus reprogrammierten peripheren Blutzellen zu gewinnen. Die Aktivierung eines Signalwegs, der mit einem neuartigen menschlichen GPI-verknüpften Protein verbunden ist, zeigt eine effiziente GENV-freie Methode zur Gewinnung menschlicher pluripotenter Stammzellen.
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Methodenartikel
GEN-freie Erzeugung von blutabgeleiteten neuronalen Zellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Viele neurologische Erkrankungen des Menschen werden durch die Degeneration von Neuronen und Gliazellen im Gehirn verursacht. Aufgrund von Einschränkungen in pharmakologischen und anderen therapeutischen Strategien gibt es derzeit keine Heilung für das verletzte oder erkrankte Gehirn. Zellersatz erscheint als vielversprechende therapeutische Strategie für neurodegenerative Erkrankungen. Bis heute werden neuronale Stammzellen (NSCs) erfolgreich aus fetalem Gewebe, menschlichen embryonalen Zellen (ES) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) erzeugt. Ein Prozess der Dedifferenzierung wurde durch die Aktivierung des neuartigen menschlichen GPI-verknüpften Glykoproteins eingeleitet, das zur Erzeugung pluripotenter Stammzellen führt. Diese aus dem Blut gewonnenen pluripotenten Stammzellen (BD-PSCs) differenzieren sich in vitro zu Zellen mit einem neuronalen Phänotyp, wie die Hellfeld- und Immunfluoreszenzmikroskopie zeigt. Die ultrastrukturelle Analyse dieser Zellen mittels Elektronenmikroskopie bestätigt ihre primitive Struktur sowie neuronale Morphologie und subzelluläre Eigenschaften.
Einleitung
Die Entwicklung grundlegender und präklinischer Stammzellforschungsmethoden fördert die klinische Anwendung stammzellbasierter Therapien bei neurologischen Erkrankungen. Eine solche mögliche Therapie hängt entscheidend von der Methode zur Erzeugung menschlicher Nervenzellen ab, die zur funktionellen Erholung führen1.
Neuronale Stammzellen (NSCs) erneuern sich selbst und differenzieren sich im Laufe des Lebens in einem Prozess, der als adulte Neurogenese bezeichnet wird. Nur sehr eingeschränkte Hirnareel beherbergen NSCs, die in der Lage sind, neugeborene Neuronen im Erwachsenenalter zu erzeugen. Solche NSCs können re....
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Protokoll
Bei der Durchführung der Experimente wurden ethische Genehmigungen eingeholt.
1. Isolierung von mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes (PBMNCs)
- Stellen Sie sicher, dass alle Spender eine Einwilligung nach Aufklärung unterzeichnet haben, bevor sie die Blutentzugskonformität in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchführen.
- Nehmen Sie 30 ml Blut von gesunden Spendern durch geschultes medizinisches Personal gemäß dem Standardprotokoll.
- Isolieren Sie PBMNCs durch Dichtegradientenmedien. Verwenden Sie 10 ml Medium mit 25 ml 1:1 Blut, verdünnt mit Phosphatpuffersalzlösung (PBS), un....
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Ergebnisse
Die Ergebnisse liefern Hinweise darauf, dass diese neuartige gentechnikfreie Methode in der Lage ist, Blutvorläuferzellen in ihren primitivsten Zustand zurückzusetzen, ohne direkt auf das menschliche Genom einzuwirken.
Wir haben bereits gezeigt, dass die GPI-verknüpfte proteinspezifische Antikörpervernetzung über PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN eine Hochregulierung hochkonservierender entwicklungsrelevanter Gene wie WNT, NOTCH und C-Kit initiiert und damit einen Prozess der Dedifferenzierung .......
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Diskussion
Die in dieser Arbeit beschriebene Nicht-GM-Methode zur Reprogrammierung menschlicher Zellen basiert auf der Membran-zu-Kern-Aktivierung der Signalmaschinerie hinter dem GPI-verknüpften menschlichen Membranglykoprotein, das den Prozess der Dedifferenzierung einleitet, der zur Ex-vivo-Erzeugung und -Expansion von sich selbst erneuernden PSCs führt, die aus nicht manipuliertem menschlichem peripherem Blut gewonnen werden. Diese Zellen sind, wenn sie in geeigneten Medien kultiviert werden, in Zellen umzudifferenzier.......
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Offenlegungen
Die korrespondierende Autorin erklärt, dass sie Patentinhaberin im Zusammenhang mit Novel Human GPI-linked Protein ist und für ACA CELL Biotech mitbegründet und arbeitet. Die anderen Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.
Danksagungen
Dem Andenken an Dr. Rainer Saffrich gewidmet.
Die Autoren danken insbesondere José Manuel García-Verdugo und Vicente Herranz-Pérez für die Durchführung von EM-Experimenten und -Analysen am Labor für Vergleichende Neurobiologie, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, University of Valencia, CIBERNED, Valencia, Spanien, die durch Forschungsmittel aus dem Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075 unterstützt wurden. Der Rest dieser Arbeit wurde von der ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Deutschland, unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Albuminfraktion V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3-Konjugat | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen 560381 | ||
| AO/PI Cell Viability Kit | Biozym | 872045 | Biozym werden nicht mehr hergestellt. Das Produkt wird von Logos Biosystems hergestellt. |
| Ascorbinsäure 2-phosphat sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum frei 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basische FGF-Lösung | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | Dichtegradientenmedium |
| BSA Frac V 7,5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | magnetische Kügelchen in Nanogröße |
| Objektträger zur Zellzählung Luna | Biozym | 872010 | Biozym wird nicht mehr hergestellt. Das Produkt wird von Logos Biosystems hergestellt. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher | Scientific 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | Epoxidharz |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Abgekündigt. Erhältlich unter: TMS-013-B |
| GDNF rekombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-Glutamin |
| Glutaraldehyd Qualität | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin-Natriumzelle | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin-Maus | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Bleicitrat | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automatisierter Zellzähler | Biozym | 872040 | Biozym wird nicht mehr hergestellt. Das Produkt wird von Logos Biosystems hergestellt. |
| MACS Puffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsä | ulen Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada Digitalkamera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 Wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS steril | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-Ornithin | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranylacetat C | EMS | 22400 |
Referenzen
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32(2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neur....
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Nachdrucke und Genehmigungen
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