Method Article

Eine zweistufige Strategie, die epigenetische Modifikation und biomechanische Hinweise kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren zu erzeugen

DOI:

10.3791/61655

⸱

August 29th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomedical Embryology, Department of Health, Animal Science and Food Safety and Center for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano, 2Department of Veterinary Medicine, University of Sassari, 3Department of Agricultural and Environmental Sciences - Production, Landscape, Agroenergy and Center for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir stellen hier eine Methode vor, die die Verwendung von chemischer epigenetischer Auslöschung mit mechanosensing-bezogenen Hinweisen kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren effizient zu erzeugen, ohne dass Gentransfektion oder retrovirale Vektoren erforderlich sind. Diese Strategie ist daher vielversprechend für die translationale Medizin und stellt einen bemerkenswerten Fortschritt in der Stammzellorganoidtechnologie dar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Zellphänotyp kann mit verschiedenen Methoden umgekehrt oder modifiziert werden, mit Vorteilen und Einschränkungen, die für jede Technik spezifisch sind. Hier beschreiben wir eine neue Strategie, die die Verwendung von chemischer epigenetischer Auslöschung mit mechanosensing-bezogenen Hinweisen kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren zu erzeugen. Zwei Hauptschritte sind erforderlich. Im ersten Schritt werden adulte reife (terminally differentiierte) Zellen dem epigenetischen Radiergummi 5-aza-cytidin ausgesetzt, um sie in einen pluripotenten Zustand zu treiben. Dieser Teil des Protokolls wurde entwickelt, basierend auf dem zunehmenden Verständnis der epigenetischen Mechanismen, die das Schicksal und die Differenzierung von Zellen steuern, und beinhaltet die Verwendung des epigenetischen Modifikators, um den Zelldifferenzierungszustand zu löschen und dann in ein vorübergehendes Fenster mit hoher Plastizität zu fahren.

Im zweiten Schritt werden gelöschte Zellen in Mikrobioreaktoren aus Polytetrafluorethylen (PTFE), auch bekannt als Liquid Marbles, eingekapselt, um die Umlagerung von 3D-Zellen zu fördern und die erworbene hohe Plastizität stabil zu halten. PTFE ist eine nicht-reaktive hydrophobe synthetische Verbindung und ihre Verwendung ermöglicht die Schaffung einer zellulären Mikroumgebung, die in herkömmlichen 2D-Kultursystemen nicht erreicht werden kann. Dieses System fördert und fördert die Aufrechterhaltung der Pluripotenz durch bio-mechanosensing-bezogene Hinweise.

Die hier beschriebenen technischen Verfahren sind einfache Strategien, um die Induktion und Aufrechterhaltung eines hohen Plastizitätszustands in adulten Körperzellen zu ermöglichen. Das Protokoll erlaubte die Ableitung von Zellen mit hoher Plastizität bei allen getesteten Säugetierarten. Da es nicht die Verwendung von Gentransfektion beinhaltet und frei von viralen Vektoren ist, kann es einen bemerkenswerten technologischen Fortschritt für translationale medizinische Anwendungen darstellen. Darüber hinaus bietet das Mikrobioreaktorsystem einen bemerkenswerten Fortschritt in der Stammzell-Organoid-Technologie, indem es in vitro eine spezifische Mikroumgebung schafft, die die langfristige Kultur von Zellen mit hoher Plastizität ermöglicht, nämlich als ES-, iPS-, epigenetisch gelöschte Zellen und MSCs.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In den letzten Jahrzehnten wurde das weithin akzeptierte Konzept der unidirektionalen Progression in Richtung Zellbindung und -differenzierung vollständig überarbeitet. Es wurde gezeigt, dass die Zellspezifikation umgekehrt werden kann und eine terminaldifferenzierte Zelle mit verschiedenen Methoden in einen weniger engagierten und höheren permissiven Zustand gedrängt werden kann.

Unter den verschiedenen vorgeschlagenen Methoden besteht eine der vielversprechendsten Methoden darin, chemische Verbindungen zu verwenden, um Zellen in eine sogenannte chemisch induzierte Pluripotenz zu induzieren. Die bei diesem Ansatz verwendeten kleinen Moleküle sind in der Lage, die epigenetische Signatur einer erwachsenen reifen Zelle zu interagieren und zu modifizieren, wodurch die Notwendigkeit eines transgenen und/oder viralen Vektorsvermieden wird 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Zahlreiche Studien haben kürzlich gezeigt, dass es möglich ist, Zellen von einem Phänotyp auf einen anderen umzuschalten, indem spezifische biochemische und biologische Reize bereitgestellt werden, die die Reaktivierung hypermethylierter Gene 11,12,13,14,15 induzieren. Diese Demethylierungsereignisse ermöglichen die Umwandlung von terminaldifferenzierten Zellen in einen primitiven Vorläufer, eine multipotente oder eine hochplastische/pluripotente Zelle 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.

Parallel dazu haben sich viele Studien in letzter Zeit auf das Verständnis von mechanosensing-bezogenen Hinweisen konzentriert und insbesondere auf die Möglichkeit, mechanische Kräfte zu nutzen, um die Zellplastizität und / oder Differenzierung direkt zu beeinflussen16,17,18,19. Tatsächlich wurde eindeutig nachgewiesen, dass die extrazelluläre Matrix (ECM) eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle des Zellschicksals spielt. Insbesondere die von ECM erzeugten biomechanischen und biophysikalischen Signale regulieren direkt molekulare Mechanismen und Signalwege und beeinflussen das Zellverhalten und die Zellfunktionen20,21. Diese jüngsten Daten haben den Weg für die Entwicklung neuartiger 3D-Kultursysteme geebnet, die die In-vivo-Zellmikroumgebung genauer nachahmen und mechanische und physikalische Reize replizieren, die das Zellverhalten antreiben.

Wir beschreiben hier ein zweistufiges Protokoll, das die Verwendung von chemischem epigenetischem Löschen mit mechanosensing-bezogenen Hinweisen kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren zu erzeugen. Im ersten Schritt werden Zellen mit dem Demethylierungsmolekül 5-Aza-Cytidin (5-aza-CR) inkubiert. Dieser Wirkstoff ist in der Lage, eine signifikante globale DNA-Demethylierung durch eine kombinierte Wirkung der direkten Ten-Eleven-Translokation 2 (TET2)-vermittelten Wirkung 8,10 und der indirekten Hemmung der DNA-Methyltransferasen (DNMT)22,23 zu induzieren. Dieser Schritt induziert die Entfernung der epigenetischen Blockaden mit einer anschließenden Reaktivierung der pluripotenzbedingten Genexpression und damit die Erzeugung von Zellen mit hoher Plastizität 1,2,3,8,10, im Folgenden als "epigenetisch gelöschte Zellen" bezeichnet. Im zweiten Schritt werden die Zellen in einem 3D-Kultursystem verkapselt. Zu diesem Zweck wird die nicht-reaktive hydrophobe synthetische Verbindung Polytetrafluorethylen (PTFE; mit einer Partikelgröße von 1 μm) als Mikrobioreaktor verwendet, der die Schaffung einer zellulären Mikroumgebung ermöglicht, die durch den Einsatz herkömmlicher 2D-Kultursystemenicht erreichbar ist 10. Die PTFE-Pulverpartikel haften an der Oberfläche des Flüssigkeitstropfens, in dem die Zellen wieder suspendiert werden, und isolieren den Flüssigkeitskern von der Stützoberfläche, während sie einen Gasaustausch zwischen der inneren Flüssigkeit und der Umgebung ermöglichen24. Der so erhaltene "PTFE-Mikrobioreaktor", auch bekannt als "Liquid Marble", ermutigt die Zellen, frei miteinander zu interagieren, fördert die 3D-Zellumlagerung25,26,27 und verlängert und hält den erworbenen Zustand mit hoher Plastizität durch bio-mechanosensing-bezogene Hinweise10 stabil aufrecht.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Studien wurden von der Ethikkommission der Universität Mailand überprüft und genehmigt. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, der von den US-amerikanischen National Institutes of Health (NIH) veröffentlicht wurde. Die Isolierung menschlicher Zellen von gesunden erwachsenen Individuen wurde von der Ethikkommission des Ospedale Maggiore Policlinico, Mailand, genehmigt. Alle Methoden in unserer Studie wurden in Übereinstimmung mit den genehmigten Richtlinien durchgeführt.

1. Isolierung von Hautfibroblasten

HINWEIS: Alle unten beschriebenen Verfahren können auf Fibroblasten angewendet werden, die von verschiedenen Säugetierarten, einschließlich Maus, Schwein und Mensch, isoliert wurden. Murinzellen wurden aus 7 Wochen alten männlichen Mäusen isoliert und Schweinehautgewebe wurde im örtlichen Schlachthof gesammelt. Menschliche Zellen wurden nach schriftlicher Einwilligung nach Aufklärung von erwachsenen Patienten isoliert.

  1. Bereiten Sie 0,1% ige Schweinegelatinelösung vor.
    1. Wiegen Sie 0,1 g Schweinegelatine und lösen Sie sie in 100 ml Wasser auf. Sterilisieren Sie die Gelatinelösung vor dem Gebrauch durch Autoklavieren.
    2. 35 mm Petrischale mit 0,1% Schweinegelatine beschichten, indem man 1,5 ml der vorbereiteten Lösung hinzufügt. Inkubiere für 2 h bei Raumtemperatur.
  2. Schneiden Sie Hautbiopsien von Säugetieren (Maus, Schwein und Mensch) von etwa 2-5 cm Länge ab und legen Sie sie in Dulbeccos Phosphat Buffered Saline (PBS), die eine 2% ige antimykotische antimykotische Lösung enthält. Bis zum Gebrauch bei + 4 °C lagern.
    HINWEIS: Biopsiesammlungen müssen in Absprache und nach Genehmigung der Ethikkommission in Übereinstimmung mit den festgelegten Richtlinien durchgeführt werden.
  3. Waschen Sie die gesammelten Biopsien dreimal ausgiebig in frischem sterilem PBS, das 2% ige antimykotische antimykotische Lösung enthält.
  4. Sammeln Sie Biopsien aus der letzten Wäsche und geben Sie sie in eine sterile 100 mm Petrischale. Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um sie in Stücke von ca. 2 mm3 Größe zu schneiden.
  5. Am Ende der 2-stündigen Inkubation wird der Überschuss an Gelatinelösung aus der 35-mm-Petrischale (beschrieben in Schritt 1.1.2) entfernt und mit einer sterilen chirurgischen Pinzette sofort 5-6 Hautfragmente in jede vorbeschichtete Kulturschale gegeben.
  6. Befeuchten Sie die Fragmente, indem Sie 100 μL-Tröpfchen Fibroblasten-Isolationsmedium (Tabelle 1) über jedes von ihnen geben. Kultur bei 37 °C im 5% CO2 Inkubator.
    HINWEIS: Um zu verhindern, dass das Medium verdunstet, legen Sie die 35-mm-Petrischale in eine 100 mm oder größere Petrischale, die steriles Wasser enthält. Achten Sie darauf, beide Petrischalen zu verschließen.
  7. Überprüfen Sie nach 24 h Kultur die Menge des Mediums in der 35 mm Kultur-Petrischale. Bei Bedarf 500 μL Fibroblasten-Isolationsmedium hinzufügen, um die Fragmente nass zu halten.
  8. Entfernen Sie das Medium vorsichtig und erfrischen Sie es mindestens alle 2 Tage Kultur mit einer Pipette.
  9. Wenn Fibroblasten beginnen, aus den Hautfragmenten zu wachsen, die in der 35-mm-Petrischale (beschrieben in Schritt 1.5.) platziert sind, beginnen und beginnen, eine Zellmonoschicht zu bilden (normalerweise 6 Tage). Entfernen Sie Hautstücke mit einer sterilen chirurgischen Pinzette und Kultur in 2 ml Fibroblasten-Isolationsmedium.
  10. Die Zellmonoschicht wird bei 37 °C im 5%-CO2-Inkubator bis zu 80 % Konfluenz und Auffrischungsmedium jeden zweiten Tag weiter kultiviert.

2. Fibroblasten-Primärzelllinienkultur

  1. Wenn Fibroblasten einen Zusammenfluss von 80% erreichen, entfernen Sie vorsichtig das Fibroblasten-Isolationsmedium und waschen Sie die Zellen dreimal mit 3 ml PBS, die 1% antimykotische Lösung enthalten.
  2. Zur Zellablösung 600 μL 0,25%ige Trypsin-EDTA-Lösung in die Kulturschale geben und bei 37 °C für 3-5 min inkubieren.
  3. Fügen Sie 5,4 ml Fibroblastenkulturmedium hinzu, um Trypsin zu neutralisieren, wenn sich die Zellen von der Kulturschale lösen (Tabelle 1).
  4. Lösen Sie Zellen durch wiederholtes und sanftes Pipettieren. Plattenzellen in neuen Kulturschalen (ohne Gelatine), wobei das Durchgangsverhältnis zwischen 1:2 und 1:4 (abhängig von der Wachstumsrate) gehalten wird.
    HINWEIS: Eine Zentrifugation ist nicht erforderlich.
  5. Halten Sie die Zellen in Kultur und wechseln Sie das Medium alle 2 Tage, bis sie 80% Konfluenz erreicht haben und sie passieren.
    HINWEIS: Vermehren Sie Fibroblasten zweimal pro Woche, um ein kräftiges Wachstum aufrechtzuerhalten.

3. Fibroblasten-Exposition bei 5-aza-CR

  1. Bereiten Sie eine frische 1 mM 5-aza-CR-Lagerlösung vor.
    1. Wiegen Sie 2,44 mg 5-aza-CR und lösen Sie es in 10 ml DMEM-hoher Glukose auf. Suspendieren Sie das Pulver durch Wirbeln. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22-μm-Filter.
      HINWEIS: Die 5-aza-CR-Stammlösung muss unmittelbar vor der Verwendung vorbereitet werden.
    2. Es wird eine 5-aza-CR-Arbeitslösung hergestellt, indem 1 μL 5-aza-CR-Stammlösung (3.1.1.) in 1 ml Fibroblastenkulturmedium verdünnt wird.
      HINWEIS: Die Konzentration der 5-aza-CR-Arbeitslösung beträgt 1 μM 1,2,3,8,9.
  2. Trypsinisieren Sie Zellen wie zuvor beschrieben (2.1.-2.3.) und entfernen Sie Zellen durch wiederholtes und sanftes Pipettieren.
  3. Sammeln Sie die Zellsuspension und übertragen Sie sie in eine konische Röhre.
  4. Zählen Sie Zellen mit einer Zählkammer unter einem optischen Mikroskop bei Raumtemperatur. Berechnen Sie das Volumen des Mediums, das benötigt wird, um die Zellen wieder zu suspendieren, um4 x 10 4 Zellen in 30 μL Fibroblastenkulturmedium, ergänzt mit 1 μM 5-aza-CR, zu erhalten (siehe Schritt 3.1.2.).
    HINWEIS: Die zu verwendende Formel hängt vom spezifischen Kammertyp ab.
    figure-protocol-1
  5. Zellsuspension bei 150 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit dem Fibroblastenkulturmedium, ergänzt mit 1 μM 5-aza-CR (siehe Schritt 3.1.2.). Zum Volumen des zu verwendenden Fibroblastenkulturmediums siehe Schritt 3.4.
    HINWEIS: Als Negativkontrolle resuspendieren Sie Zellen mit der gleichen Konzentration in Fibroblastenkulturmedium ohne 5-aza-CR und fahren Sie mit der Zellverkapselung in PTFE-Pulver fort (Schritt 4.1.-4.13.).

4. Fibroblastenverkapselung in PTFE-Mikrobioreaktoren

  1. Füllen Sie eine 35-mm-Petrischale mit Polytetrafluorethylen (PTFE)-Pulver, um ein Bett herzustellen (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Verwenden Sie 35 mm bakteriologische Petrischale, um eine Anhaftung von flüssigem Marmor zu vermeiden. Um eine dünne hydrophobe und poröse Schale zu erhalten, verwenden Sie ein PTFE-Pulver mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von 1 μm, das mit einem maximalen Mahlgrad von 2,0 NPIRI hergestellt wird. Dies ermöglicht die Herstellung von gasdurchlässigen flüssigen Murmeln. Darüber hinaus erleichtert die transluzente Beschichtung die Beobachtung von Zellaggregationsprozessen in Echtzeit Größere Partikelgrößen führen zu einer hohen Polydispersität, die zu erhöhter Verdampfung, Deformität und Verlust der Kugelform sowie zur vorzeitigen Auflösung der Mikrobioreaktoren führen kann.
  2. 30 μL Einzeltropfen mit 4 x 10 4 Zellen (siehe Schritte 3.4.- 3.5.) werden auf das Pulverbett abgegeben (Abbildung 1B).
  3. Drehen Sie die 35-mm-Petrischale vorsichtig in einer kreisförmigen Bewegung, um sicherzustellen, dass PFTE-Pulver die Oberfläche des flüssigen Tropfens vollständig bedeckt, um einen Mikrobioreaktor aus flüssigem Marmor zu bilden (Abbildung 1C).
  4. Nehmen Sie den Mikrobioreaktor für flüssigen Marmor mit einer 1.000-μL-Pipettenspitze auf, die am Rand geschnitten wird, um den Durchmesser des Marmors aufzunehmen (Abbildung 1D, E). Den Mikrobioreaktor aus flüssigem Marmor auf eine saubere bakteriologische Petrischale legen, um ihn zu stabilisieren (Abbildung 1F).
    HINWEIS: Um eine Reibung zu erzeugen, um den Marmor in der Spitze zu greifen, schneiden Sie die Pipettenspitzen mit einem Durchmesser, der ungefähr etwas kleiner ist als der Durchmesser des flüssigen Marmors.
  5. Übertragen Sie den Mikrobioreaktor für flüssigen Marmor aus der Petrischale in eine 96-Well-Platte (eine Murmel / Well) (Abbildung 1G).
  6. Fügen Sie langsam 100 μL Medien vom Rand des Bohrlochs hinzu. Der Mikrobioreaktor beginnt auf dem Medium zu schweben (Abbildung 1H).
    HINWEIS: Der Mikrobioreaktor bricht im direkten Flüssigkeitskontakt aufgrund der Störung der PTFE-Hydrophobie. Als alternativer Ansatz können die Mikrobioreaktoren aus flüssigem Marmor einzeln in einer 35 mm großen bakteriologischen Kulturschale platziert werden. In diesem Fall muss die 35-mm-Petrischale mit dem Mikrobioreaktor in eine 100-mm-Petrischale eingeführt werden, die zuvor mit sterilem Wasser alizitiert wurde, um die Verdunstung von flüssigem Marmor zu verhindern.
  7. Inkubator des Mikrobioreaktors aus flüssigem Marmor für 18 h bei 37 °C im 5%-CO 2-Inkubator 1,2,3,8,9.
    HINWEIS: Die PTFE-Partikelgröße von 1 μm kann einen optimalen Gasaustausch zwischen der inneren Flüssigkeit und der Umgebung gewährleisten.
  8. Nach der 5-aza-CR-Inkubation für 18 h wird der Mikrobioreaktor aus flüssigem Marmor mit einer 1.000 μL Pipettenspitze am Rand aufgefangen (siehe Schritt 4.5).
  9. Setzen Sie den Mikrobioreaktor in eine neue 35-mm-Bakteriologie-Petrischale (Abbildung 1D-F).
  10. Verwenden Sie eine Nadel, um den flüssigen Marmor zu durchstechen und zu brechen.
  11. Gebildete Sphäroide werden mit einer 200-μL-Pipettenspitze, die am Rand geschnitten wird, unter einem Stereomikroskop wiederhergestellt (Abbildung 1I,J).
    HINWEIS: Epigenetisch gelöschte Zellen, die in PTFE eingekapselt sind, bilden eine sphärische 3D-Struktur (ein Aggregat in jeder flüssigen Murmel).
  12. Um den Erwerb eines pluripotenten Zustands als Reaktion auf 5-aza-CR zu beurteilen, überprüfen Sie den Beginn der pluripotenzbedingten Genexpression OCT4, NANOG, REX1 und SOX2 durch qualitative PCR (Tabelle 2).
  13. Fahren Sie mit dem zweiten Schritt des Protokolls wie unten beschrieben fort.

5. Kultur in PTFE-Mikrobioreaktoren epigenetisch gelöschter Zellen

  1. Frisches ESC-Kulturmedium zubereiten (Tabelle 1).
  2. Organoide in eine Petrischale mit ESC-Medium zum Waschen von 5-aza-CR-Rückständen übertragen (siehe Schritte 5.1.-5.2.).
  3. Bereiten Sie eine neue 35-mm-Bakteriologie-Petrischale mit PTFE-Pulverbett vor (siehe auch Schritt 4.1.).
  4. Ein einzelnes Organoid wird in einem Tröpfchen von 30 μL ESC-Kulturmedium mit einer 200 μL Pipettenspitze, die am Rand geschnitten wird, auf das Pulverbett dosiert (siehe Schritte 4.9.; 5.3.).
  5. Die 35-mm-Petrischale wird vorsichtig in einer kreisförmigen Bewegung gedreht, um einen neuen Mikrobioreaktor aus flüssigem Marmor zu bilden, ihn mit einer 1.000-μL-Pipettenspitze aufzunehmen, am Rand zu schneiden und den neu gebildeten Mikrobioreaktor in eine Vertiefung aus 96-Well-Platte (eine Murmel / Well) zu legen (siehe Schritte 4.3.-4.6.).
  6. Um die Mikrobioreaktoren schwimmen zu lassen, werden 100 μL Medien vom Rand des Bohrlochs hinzugefügt, um den Marmor langsam zu baden (siehe Anmerkung 4.7.).
  7. Flüssigmarmor-Mikrobioreaktoren bei 37 °C im 5% CO 2-Inkubator so lange wie nötig zu kultivieren. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag nach dem in 5.3.-5.7 beschriebenen Verfahren.
    HINWEIS: Im vorliegenden Manuskript werden Ergebnisse angegeben, die mit Organoidkulturen für 28 Tage erhalten wurden. Bei Bedarf kann jedoch eine längere Kulturperiode durchgeführt werden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das vorliegende Protokoll beschreibt alle Schritte, die durchgeführt werden müssen, um pluripotente Säugetierzellen aus adulten somatischen Zellen zu erzeugen und stabil zu erhalten. Diese Methode war erfolgreich mit Fibroblasten, die von verschiedenen Säugetierarten, nämlich Maus, Schwein und Mensch, isoliert wurden. Die hier berichteten repräsentativen Ergebnisse stammen aus allen Zelllinien, unabhängig von der Herkunftsart.

Morphologische Analysen zeigen, dass nach 18-stündiger Inkubation m...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In den letzten Jahrzehnten konzentrierten sich mehrere Studien auf die Entwicklung von Strategien, um eine terminale differenzierte Zelle in einen weniger engagierten und höheren freizügigen Zustand zurückzuversetzen. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Erzeugung und langfristige Aufrechterhaltung pluripotenter Zellen, ausgehend von adulten reifen terminaldifferenzierten Zellen. Die Methode kombiniert zwei unabhängige Schritte, die die Induktion eines hohen permissiven Zustands beinhalten, der durch chemisches...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der Carraresi Foundation und MiND FoodS Hub ID: 1176436 finanziert. Alle Autoren sind Mitglieder der COST Action CA16119 In vitro 3-D Total Cell Guidance and Fitness (CellFit).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM7522Bestandteil des ESC-Mediums
5-AzacytidinSigma-AldrichA23855-aza-CR, zur epigenetischen Löschung von Fibroblasten
AdenosinSigma-AldrichA4036Bestandteil der Nukleosidmischung für ESC-Medium
Antibiotische Antimykotische Lösung (100&fach;)Sigma-AldrichA5955Bestandteil von Fibroblasten und ESC-Medien
CFX96 Real-Time PCRBio-Rad LaboratoriesNAThermocycler für quantitative PCR
CytidinSigma-AldrichC4654Bestandteil eines Nukleosid-Mixes für ESC-Medium
DMEM, hohe Glukose, PyruvatThermo Fisher Scientific41966052Für die Isolierung von Fibroblasten und Kulturmedium
DMEM, niedriger Glukosegehalt, PyruvatThermo Fisher Scientific31885023für ESC medium
Dulbecco' s Phosphatgepufferte KochsalzlösungSigma-AldrichD5652PBS; für Biopsie und Zellwäsche sowie für die Lösungsvorbereitung
Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification KitThermo Fisher Scientific61021mRNA-Estzug
ESGRO Rekombinante Maus LIF ProteinSigma-AldrichESG1106Bestandteil des ESC-Mediums
Fötales Rinderserum, qualifiziert, hitzeinaktiviertThermo Fisher Scientific10500064Bestandteil von Fibroblasten und ESC-Medien
FGF-Basic (AA10-155) Rekombinantes humanes ProteinThermo Fisher ScientificPHG0024Bestandteil von ESC-Medium
Gelatine aus SchweinehautSigma-AldrichG1890Für die Schalenbeschichtung
GeneAmp PCR System 2700Applied BiosystemsNAThermocycler für qualitative PCR
Global DNA Methylation ELISA KitCELL BIOLABSSTA-380Methylierungsstudie
GoTaq G2 Flexi DNA-PolymerasePromegaM7801Qualitative PCR
GuanosinSigma-AldrichG6264Bestandteil der Nukleosidmischung für ESC-Medium
Schinkens F-10 NährstoffmischungThermo Fisher Scientific31550031für ESC-Medium
KnockOut-SerumersatzThermo Fisher Wissenschaftliche10828028Bestandteil des ESC-Mediums
KOVA Glasobjektträger 10 mit GitternHycor Biomedical87144Für die Zellzählung
Leica MZ APO StereomikroskopLeicaNAFür die Organoid-Beobachtung
L-Glutamin-LösungSigma-AldrichG7513Bestandteil von Fibroblasten und ESC-Medien
MEM Nicht-essentielle Aminosäuren Lösung (100X)Thermo Fisher Scientific11140035Komponente aus Regler Medium
Millex-GS 0,22 & Mikro; m PorenfilterMilliporeSLGS033SBFür die Lösungssterilisation
M-MLV Reverse Transkriptase, RNase H Minus, PunktmutantePromegaM3681mRNA reverse Transkription
Multiskan FC Mikrotiterplatten-PhotometerThermo Fisher Scientific51119000Für das Lesen von ELISA-Platten
Nikon Eclipse TE300 Inverses PhasenkontrastmikroskopNikonNAFür Zellen Beobachtung
Perkin Elmer Thermocycler 480Perkin ElmerNAThermocycler für reverse Transkription
Poly(tetrafluorethylen) 1 μ m PartikelgrößeSigma-Aldrich430935Zur Erzeugung von Mikrobioreaktoren
PureLink Genomic DNA Mini KitThermo Fisher ScientificK182001Genomic DNA
Estraction TaqMan Gene Expression Cells-to-CT KitThermo FisherScientific AM1728Quantitative PCR
ThymidinSigma-AldrichT1895Bestandteil einer Nukleosidmischung für ESC-Medium
Gewebekulturschale 100X20 mm, StandardSarstedt833902Für die Isolierung von Fibroblasten
Gewebekulturschale 35X10 mm, StandardSarstedt833900Für die Isolierung von Fibroblasten
Gewebekulturschale 35X10 mm, SuspensionSarstedt833900500Bakteriologie Petrischale für Flüssigmarmorkultur
Gewebekulturplatte 96 Well, Standard, FSarstedt833924005Für die Flüssigmarmorkultur
Trypsin-EDTA-LösungSigma-AldrichT3924Für die Dissoziation von Fibroblasten
Röhrchen 15ml, 120x17mm, PSSarstedt62553041Für die Zellsuspensionszentrifugation
UridinSigma-AldrichU3003Bestandteil der Nukleosidmischung für ESC-Medium

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
  2. Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
  3. Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
  4. Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
  5. Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333(2015).
  6. Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
  7. Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
  8. Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017(2016).
  9. Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
  10. Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
  11. Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
  12. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  13. Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
  14. Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
  15. Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
  16. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728(2017).
  17. Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
  18. Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41(2012).
  19. Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), Cambridge, England. 4261-4270 (2017).
  20. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
  21. Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
  22. Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
  23. Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
  24. Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
  25. Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083(2015).
  26. Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388(2017).
  27. Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31(2017).
  28. Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
  29. Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
  30. Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epigenetic ModificationBiomechanical CuesPluripotent Cells5 Aza CytidinePTFE Micro BioreactorsLiquid MarblesCell RearrangementPluripotency MaintenanceDNA Methylation AnalysisMorphological Analysis

Related Articles