Ultra-High-Speed Western Blot mit Immunoreaction Enhancing Technology

Zusammenfassung

Eine Ultra-High-Speed-Western-Blotting-Technik wird entwickelt, indem die Kinetik der Antigen-Antikörper-Bindung durch zyklische Entwässerungs- und Auffüllungstechnologie (CDR) in Verbindung mit einem Immunreaktions-Verbesserungsmittel verbessert wird.

Zusammenfassung

Ein Westlicher Blot (auch als Immunoblot bekannt) ist eine kanonische Methode für die biomedizinische Forschung. Es wird häufig verwendet, um die relative Größe und Fülle von spezifischen Proteinen sowie post-translationale Proteinmodifikationen zu bestimmen. Diese Technik hat eine reiche Geschichte und bleibt in weit verbreiteter Verwendung aufgrund seiner Einfachheit. Das westliche Blotting-Verfahren dauert jedoch bekanntlich Stunden, sogar Tage, mit einem kritischen Engpass, die langen Inkubationszeiten sind, die seinen Durchsatz begrenzen. Diese Inkubationsschritte sind aufgrund der langsamen Diffusion von Antikörpern aus der Bulk-Lösung zu den immobilisierten Antigenen auf der Membran erforderlich: Die Antikörperkonzentration in der Nähe der Membran ist viel niedriger als die Massenkonzentration. Hier präsentieren wir eine Innovation, die diese Inkubationsintervalle drastisch reduziert, indem die Antigenbindung durch zyklisches Ablassen und Auffüllen (CDR) der Antikörperlösung verbessert wird. Wir haben auch eine Immunreaktions-Verbesserungstechnologie verwendet, um die Empfindlichkeit des Assays zu erhalten. Eine Kombination der CDR-Methode mit einem kommerziellen Immunreaktionsmittel steigerte das Ausgangssignal und reduzierte die Inkubationszeit des Antikörpers erheblich. Der resultierende Ultra-High-Speed-Western-Blot kann in 20 Minuten ohne Verlust der Empfindlichkeit erreicht werden. Diese Methode kann auf westliche Flecken angewendet werden, indem sowohl chemilumineszierender als auch fluoreszierender Nachweis verwendet wird. Dieses einfache Protokoll ermöglicht es Forschern, die Analyse der Proteinexpression in vielen Proben besser zu untersuchen.

Einleitung

Ein western blot (auch bekannt als Immunoblot) ist eine leistungsstarke und grundlegende Technik in einer breiten Palette von wissenschaftlichen und klinischen Disziplinen. Diese Technik wird verwendet, um das Vorhandensein, die relative Häufigkeit, die relative Molekularmasse und posttranslationale Modifikationen von Proteinen¹zu untersuchen. In Kombination mit der digitalen Bildanalyse kann diese Methode zuverlässig die Fülle von Proteinen und Proteinmodifikationen analysieren². Obwohl Western Blot routinemäßig durchgeführt wird, ist es eine zeitaufwändige und arbeitsintensive Methode. Lange Inkubationen des Antikörpers mit Membranen sind erforderlich. Hier beschreiben wir eine Modifikation der Inkubationsmethode, die diese Einschränkung überwindet, ohne die Empfindlichkeit zu opfern.

Während der Inkubation der Membran schwimmen Antikörper in Lösung, während Antigene auf der Membran immobilisiert werden. Aufgrund ihrer hohen Affinität ist die Rate der Antikörperbindung an das Antigen schneller als die Diffusion von Antikörpern aus der Massenlösung zur Membran. Dadurch entsteht eine "Erschöpfungsschicht" mit geringer Konzentration (Abbildung 1). Es kann Stunden dauern, bis weiter entfernte Antikörper die Membran über passive Diffusion erreichen, was der Hauptfaktor für lange Inkubationszeiten in dieser Technik ist. Dieser Effekt wird als Massentransportbegrenzung (MTL)³bezeichnet. Es wurde vorgeschlagen, dass das wiederholte Entleeren und Auffüllen der antikörperhaltigen Lösung die Erschöpfungsschicht stören und MTL⁴überwinden kann. Hier haben wir eine einzigartige Technik entwickelt, die dieses cyclic Draining and Replenishing (CDR) Konzept implementiert, um die Wirkung von MTL in einem traditionellen westlichen Blotting-Protokoll zu verringern und die erforderliche Inkubationszeit zu verkürzen.

Um die Detektionsempfindlichkeit mit einer kurzen Inkubationszeit aufrechtzuerhalten, haben wir eine Immunreaktionsverbesserungstechnologie verwendet, die die Antigen-Antikörper-Reaktion beschleunigt und dadurch das Signal-Rausch-Verhältnis⁵verbessert. Viele kommerziell erhältliche Immunreaktions-Verbesserungsmittel (IRE) bestehen aus 2 Komponenten (Lösung 1 und 2, siehe Materialtabelle). Die proprietäre Zusammensetzung oder der Wirkmechanismus von IRE wurde nicht offenbart, aber wir haben zuvor festgestellt, dass IRE die Dissoziationskonstante zwischen Antigen und Antikörper in festen Phasenbindungstests verringerte, was darauf hindeutet, dass eine erhöhte Affinität zumindest teilweise für die verstärkende Wirkung von IRE⁶verantwortlich ist. Die Kombination von CDR und IRE ergibt ein ultrahochschnelles Western-Blotting-Protokoll, das die gesamte Prozesszeit reduziert, ohne die Empfindlichkeit zu opfern.

Protokoll

1. SDS-PAGE und Übertragung auf eine PVDF-Membran

1. Führen Sie SDS-PAGE aus, um Proteine basierend auf der relativen Größe zu trennen.
   HINWEIS: Jedes kommerzielle oder hausgemachte Gelsystem ist in Ordnung. Bitte folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
2. Übertragen Sie getrennte Proteine von einem Gel auf eine PVDF-Membran.
   HINWEIS: Häufige Übertragungsmethoden (halbtrockener oder nasser Transfer) sind geeignet. Bitte folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.

2. Blockierung von PVDF-Membranen

1. Inkubieren Sie die Membranen in geeigneten Blockierpuffern für 1 h mit Rührung bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Abhängig vom primären Antikörper und Detektionssystem sollte ein geeigneter Blockierpuffer ausgewählt werden. Die typischsten Blocker sind beispielsweise BSA, fettfreie Trockenmilch, Casein und kommerzielle synthetische Polymere. PBS und/oder TBS mit 0,1% Tween20 sind die am häufigsten verwendeten Puffer. Dieser Sperrschritt kann über Nacht bei 4 °C erfolgen.

3. Inkubation mit primärem Antikörper

1. Bereiten Sie 10% Immunreaktions-Verbesserungsmittel-1-Lösung (IRE-1) mit destilliertem Wasser vor. Wirbel gut.
2. Bereiten Sie den verdünnten Primärantikörper mit 10% IRE-1 vor. Mischen Sie es sanft und gründlich.
3. Bei Verwendung einer größeren Membran (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm) 8 ml der Antikörperlösung in 50 ml konische Zentrifugenrohre geben. Bei Verwendung einer kleineren Membran (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm) 3 ml der Antikörperlösung in 14 ml rundboden-Polypropylenrohr(Materialtabelle)geben.
4. Nehmen Sie die PVDF-Membran mit einer Pinzette auf und entleeren Sie die Blockierlösung kurz. Setzen Sie die PVDF-Membran mit gehandicapten Fingern in dieses Rohr ein und stellen Sie sicher, dass die gesamte Membran an der Rohrwand haftet. Wenn die PVDF-Membran in eine Röhre eingeführt wird, stellen Sie sich der "Proteinseite" der Membran, die ursprünglich mit dem Gel nach innen in Berührung kam. Schließen Sie die Kappe fest.
5. Legen Sie das 50 ml-Rohr für den Hybridisierungsofen in eine Glasflasche ein.
   HINWEIS: Wenn 14 ml Rohre für diese Inkubation verwendet werden, legen Sie ein 14 ml Rohr in das 50 ml Rohr ein, mit einem Paar Kunststoffringhalter, um das Innenrohr in der Mitte des 50 ml Rohres zu halten.
6. Schalten Sie den Hybridisierungsofen ein.
7. Inkubieren Sie die Membran mit 6 Rpm-Drehung für mindestens 5 min.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Membran jederzeit an der Wand haftet und dass das (innere) Rohr horizontal ist, um die Membran gleichmäßig mit der Antikörperlösung zu bedecken. Kalibrieren Sie die Verdünnung des Antikörpers und die Inkubationszeit vor dem eigentlichen Experiment.

4. Membranwäsche

1. Beenden Sie die Drehung.
2. Entfernen Sie die PVDF-Membran vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Rohr und legen Sie die Membran in einen Behälter mit 50 ml PBS-T.
3. Spülen Sie die Membran kurz mit PBS-T.
4. Spülen Sie die Membran im Behälter mit destilliertem Wasser, bis keine Blasen auftreten. Dadurch wird der Großteil des Antikörpers entfernt.
5. Übertragen Sie die PVDF-Membran aus dem Behälter auf den Salatspinner, der 250 ml PBS-T enthält.
6. Legen Sie den Siebkorb in den Spinner. Stellen Sie sicher, dass der Deckel sicher aufgesetzt wurde.
7. Aktivieren Sie den Spinner und führen Sie ihn für ca. 20-30 s aus.
8. Entsorgen Sie die Lösung und spülen Sie das Innere des Spinners kurz mit destilliertem Wasser ab.
9. Fügen Sie 250 ml PBS-T wieder in den Spinner ein.
10. Wiederholen Sie die Schritte 4.6 und 4.7.

5. Inkubation mit dem sekundären Antikörper

1. Bereiten Sie 10% Immunreaktionsverbesserungsmittel-2-Lösung (IRE-2) mit destilliertem Wasser vor. Wirbel gut.
2. Bereiten Sie den verdünnten Sekundärantikörper mit 10% IRE-2 vor. Mischen Sie es sanft und gründlich.
3. Wählen Sie das Volumen der Antikörperlösung und des Rohres gemäß Schritt 3.3 aus.
4. Nehmen Sie die PVDF-Membran mit einer Pinzette auf und lassen Sie die Lösung kurz abtropfen. Setzen Sie die PVDF-Membran gemäß Schritt 3.4 in das Rohr ein.
5. Legen Sie das 50 ml-Rohr für den Hybridisierungsofen in eine Glasflasche ein.
6. Schalten Sie den Hybridisierungsofen ein.
7. Inkubieren Sie die Membran mit 6 Rpm-Drehung für mindestens 5 min. Stellen Sie sicher, dass die Membran jederzeit an der Wand haftet und dass das (innere) Rohr horizontal ist, um die Membran gleichmäßig mit der Antikörperlösung zu bedecken.
   HINWEIS: Kalibrieren Sie die Inkubationszeit vor dem eigentlichen Experiment. Wenn der sekundäre Antikörper fluoreszierend konjugiert ist, führen Sie die Inkubation im Dunkeln durch.

6. Membranwäsche

1. Folgen Sie den Schritten 4.1 bis 4.10.

7. Bildaufnahme

1. Chemilumineszenz-Erkennung
   1. Legen Sie ein Stück halbtransplantierender flexibler Folie (10 cm x 15 cm) auf eine flache Oberfläche.
   2. Mischen Sie 2 Komponenten des chemilumineszierenden Substrats in einem 5 ml Rohr.
   3. 1,5 ml des Mischsubstrats sofort auf die halbtransplantierbare flexible Folie übertragen und die PVDF-Membran darauf legen. Dann übertragen Sie den Rest der Substratlösung auf die Membran.
   4. Inkubieren Sie die PVDF-Membran mit dem gemischten Substrat auf einer halbtransparenten flexiblen Folie für 1 min.
   5. Nehmen Sie die PVDF-Membran mit einer Pinzette auf und entleeren Sie die Substratlösung kurz.
   6. Sandwich die Membran zwischen einem Paar Von-Transparenz-Filme.
   7. Erfassen Sie das Bild im chemilumineszierenden Modus.
2. Fluoreszierende Detektion
   1. Nehmen Sie die PVDF-Membran mit einer Pinzette auf und lassen Sie die Lösung kurz abtropfen.
   2. Sandwich die Membran zwischen einem Paar Von-Transparenz-Filme.
   3. Erfassen Sie das Bild im Fluoreszenzmodus.
      HINWEIS: Die Schritte 7.1 und 7.2 sollten in unmittelbarer Nähe zur Bildverarbeitungsmaschine durchgeführt werden, um eine maximale Empfindlichkeit zu gewährleisten.
   4. Wenn das Hintergrundsignal hoch ist, führen Sie einen Waschschritt in einem Behälter mit 80-100 ml PBS-T durch: 10 min Spülen 3 mal für den primären Antikörper und 5 min Spülung 6 mal für den sekundären Antikörper.
      HINWEIS: Sowohl primäre als auch sekundäre Antikörper, die mit 10% IRE-Lösungen verdünnt werden, können bis zu 8-10-mal ohne Verlust der^{Empfindlichkeit}6 verwendet werden. Die Lösung sollte bis zu einem Monat bei 4 °C aufbewahrt werden.

Ergebnisse

Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirksamkeit der CDR-Methode zusammen mit der immunverstärkenden Technologie auf Western Blot. Die statische Inkubation erfolgte auf einem halbtransparenten flexiblen Film, bei dem PVDF-Membranen mit der Antikörperlösung inkubiert wurden, während die CDR-Inkubation in einem Hybridisierungsofen durch rotierende Rohre erfolgte, die die Membranen und die Antikörperlösung enthielten (Movie). Abbildung 2 zeigte Mengen an Antigen und Antikörpern, die für den chem...

Diskussion

Western Blot ist eine weit verbreitete analytische Technik zum Nachweis spezifischer Proteine, die vor 40 Jahren entwickelt wurde^7,8. Seitdem hat sich die Technik weiterentwickelt, mit nachfolgenden Innovationen zur Verbesserung der Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Quantifizierung der Technik^{2,9,10,11,12...}

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
14 mL PP-Reagenzglas mit rundem Boden und hoher Klarheit, graduiert, mit Schnappkappe	Falcon	352059
Apollo Transparentfolie für Laserdrucker	N/A	N/A	Alle Arten von Laserdrucker-Transparentfolien sind in Ordnung.
Azure Imaging System 600	Azure Biosystems	Azure 600	Jede Art von Image Capturing System eignet sich hervorragend für die Chemilumineszenz- und/oder Fluoreszenzerkennung.
Kann Signalimmunreaktionsverstärker Lösung	erhalten TOYOBO	NKB-101
NELKE Instant Fettfreie Trockenmilch	Nelke	N/A
ECL Anti-Maus IgG, Meerrettichperoxidase gebunden F(ab')2 Fragmente von Schafen	GE Healthcare	NA9310V
ECL Anti-Kaninchen-IgG, Meerrettichperoxidase gekoppelt F(ab')2 Fragmente von Esel	GE Healthcare	NA9340V
HYBAID Micro-4	N/A	N/A	Jeder Hybridisierungsofen ist in Ordnung, solange die Schläuche gleichmäßig in horizontaler Position gedreht werden.
Immobilon-P PVDF-Membran, 0,45 &Mikro; m Porengröße	Millipore Sigma	IPVH304F0
IRDye 680RD Ziege Anti-Maus IgG Sekundärer Antikörper	LICOR	926-68070
IRDye 800CW Ziege Anti-Kaninchen IgG Sekundärer Antikörper	LICOR	926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemilumineszenz Substrat	Seracare	5430-0049
Maus Anti-ß Aktin Antikörper	Millipore Sigma	A5316
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	LICOR	927-40100	Blocking Buffer für die Fluoreszenzdetektion
OXO Salad Bowler	OXO	32480V2B	Jede Salatschleuder ist in Ordnung, solange die PVDF-Membranen kräftig gespült werden, ohne zu reißen.
Parafilm Siegelfolie	Bemis	Parafilm M PM996	halbtransparente flexible Folie
Polyethylen Flat-Top Schraubverschlüsse für 50 mL Zentrifugenröhrchen mit konischem Boden	Falcon	352070
Ringe zum Halten von 14 ml Röhrchen in der Mitte des 50 ml Röhrchens	N/A	N/A Hergestellt	in einer Maschinenwerkstatt
Kaninchen Anti-6X Sein Tag Antikörper	Abcam	ab9108
Tween20	Millipore Sigma	P2287