Ultra-High-Speed Western Blot mit Immunoreaction Enhancing Technology

Zusammenfassung

Eine Ultra-High-Speed-Western-Blotting-Technik wird entwickelt, indem die Kinetik der Antigen-Antikörper-Bindung durch zyklische Entwässerungs- und Auffüllungstechnologie (CDR) in Verbindung mit einem Immunreaktions-Verbesserungsmittel verbessert wird.

Zusammenfassung

Ein Westlicher Blot (auch als Immunoblot bekannt) ist eine kanonische Methode für die biomedizinische Forschung. Es wird häufig verwendet, um die relative Größe und Fülle von spezifischen Proteinen sowie post-translationale Proteinmodifikationen zu bestimmen. Diese Technik hat eine reiche Geschichte und bleibt in weit verbreiteter Verwendung aufgrund seiner Einfachheit. Das westliche Blotting-Verfahren dauert jedoch bekanntlich Stunden, sogar Tage, mit einem kritischen Engpass, die langen Inkubationszeiten sind, die seinen Durchsatz begrenzen. Diese Inkubationsschritte sind aufgrund der langsamen Diffusion von Antikörpern aus der Bulk-Lösung zu den immobilisierten Antigenen auf der Membran erforderlich: Die Antikörperkonzentration in der Nähe der Membran ist viel niedriger als die Massenkonzentration. Hier präsentieren wir eine Innovation, die diese Inkubationsintervalle drastisch reduziert, indem die Antigenbindung durch zyklisches Ablassen und Auffüllen (CDR) der Antikörperlösung verbessert wird. Wir haben auch eine Immunreaktions-Verbesserungstechnologie verwendet, um die Empfindlichkeit des Assays zu erhalten. Eine Kombination der CDR-Methode mit einem kommerziellen Immunreaktionsmittel steigerte das Ausgangssignal und reduzierte die Inkubationszeit des Antikörpers erheblich. Der resultierende Ultra-High-Speed-Western-Blot kann in 20 Minuten ohne Verlust der Empfindlichkeit erreicht werden. Diese Methode kann auf westliche Flecken angewendet werden, indem sowohl chemilumineszierender als auch fluoreszierender Nachweis verwendet wird. Dieses einfache Protokoll ermöglicht es Forschern, die Analyse der Proteinexpression in vielen Proben besser zu untersuchen.

Einleitung

Ein western blot (auch bekannt als Immunoblot) ist eine leistungsstarke und grundlegende Technik in einer breiten Palette von wissenschaftlichen und klinischen Disziplinen. Diese Technik wird verwendet, um das Vorhandensein, die relative Häufigkeit, die relative Molekularmasse und posttranslationale Modifikationen von Proteinen¹zu untersuchen. In Kombination mit der digitalen Bildanalyse kann diese Methode zuverlässig die Fülle von Proteinen und Proteinmodifikationen analysieren². Obwohl Western Blot routinemäßig durchgeführt wird, ist es eine zeitaufwändige und arbeitsintensive Methode. Lange Inkubationen des Antikörper....

Protokoll

1. SDS-PAGE und Übertragung auf eine PVDF-Membran

1. Führen Sie SDS-PAGE aus, um Proteine basierend auf der relativen Größe zu trennen.
   HINWEIS: Jedes kommerzielle oder hausgemachte Gelsystem ist in Ordnung. Bitte folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
2. Übertragen Sie getrennte Proteine von einem Gel auf eine PVDF-Membran.
   HINWEIS: Häufige Übertragungsmethoden (halbtrockener oder nasser Transfer) sind geeignet. Bitte folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.

2. Blockierung von PVDF-Membranen

1. Inkubieren Sie die Membranen in geeigneten Blockierpuffern für 1 h mit Rührung bei Raumtemperatur.
   HINWEIS:....

Ergebnisse

Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirksamkeit der CDR-Methode zusammen mit der immunverstärkenden Technologie auf Western Blot. Die statische Inkubation erfolgte auf einem halbtransparenten flexiblen Film, bei dem PVDF-Membranen mit der Antikörperlösung inkubiert wurden, während die CDR-Inkubation in einem Hybridisierungsofen durch rotierende Rohre erfolgte, die die Membranen und die Antikörperlösung enthielten (Movie). Abbildung 2 zeigte Mengen an Antigen und Antikörpern, die für den chem.......

Diskussion

Western Blot ist eine weit verbreitete analytische Technik zum Nachweis spezifischer Proteine, die vor 40 Jahren entwickelt wurde^7,8. Seitdem hat sich die Technik weiterentwickelt, mit nachfolgenden Innovationen zur Verbesserung der Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Quantifizierung der Technik^{2,9,10,11,12.......}

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
14 mL PP-Reagenzglas mit rundem Boden und hoher Klarheit, graduiert, mit Schnappkappe	Falcon	352059
Apollo Transparentfolie für Laserdrucker	N/A	N/A	Alle Arten von Laserdrucker-Transparentfolien sind in Ordnung.
Azure Imaging System 600	Azure Biosystems	Azure 600	Jede Art von Image Capturing System eignet sich hervorragend für die Chemilumineszenz- und/oder Fluoreszenzerkennung.
Kann Signalimmunreaktionsverstärker Lösung	erhalten TOYOBO	NKB-101
NELKE Instant Fettfreie Trockenmilch	Nelke	N/A
ECL Anti-Maus IgG, Meerrettichperoxidase gebunden F(ab')2 Fragmente von Schafen	GE Healthcare	NA9310V
ECL Anti-Kaninchen-IgG, Meerrettichperoxidase gekoppelt F(ab')2 Fragmente von Esel	GE Healthcare	NA9340V
HYBAID Micro-4	N/A	N/A	Jeder Hybridisierungsofen ist in Ordnung, solange die Schläuche gleichmäßig in horizontaler Position gedreht werden.
Immobilon-P PVDF-Membran, 0,45 &Mikro; m Porengröße	Millipore Sigma	IPVH304F0
IRDye 680RD Ziege Anti-Maus IgG Sekundärer Antikörper	LICOR	926-68070
IRDye 800CW Ziege Anti-Kaninchen IgG Sekundärer Antikörper	LICOR	926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemilumineszenz Substrat	Seracare	5430-0049
Maus Anti-ß Aktin Antikörper	Millipore Sigma	A5316
Odyssey Blocking Buffer (PBS)	LICOR	927-40100	Blocking Buffer für die Fluoreszenzdetektion
OXO Salad Bowler	OXO	32480V2B	Jede Salatschleuder ist in Ordnung, solange die PVDF-Membranen kräftig gespült werden, ohne zu reißen.
Parafilm Siegelfolie	Bemis	Parafilm M PM996	halbtransparente flexible Folie
Polyethylen Flat-Top Schraubverschlüsse für 50 mL Zentrifugenröhrchen mit konischem Boden	Falcon	352070
Ringe zum Halten von 14 ml Röhrchen in der Mitte des 50 ml Röhrchens	N/A	N/A Hergestellt	in einer Maschinenwerkstatt
Kaninchen Anti-6X Sein Tag Antikörper	Abcam	ab9108
Tween20	Millipore Sigma	P2287