Hier präsentieren wir eine einfache und effiziente Methode, um lebende meiotische und postmeiotische Keimzellen von erwachsenen Maushoden zu isolieren. Mit einem zytotoxischen, violett-erregten DNA-Bindungsfarbstoff und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung kann man hoch angereicherte spermatogene Zellpopulationen für viele nachgelagerte Anwendungen isolieren.
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Methodenartikel
Isolierung von murinen Spermatogenic Cells mit einem violett-erregten Zellpermeable DNA Binding Dye
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Isolierung meiotischer Spermatozyten ist wichtig, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, die der Meiose und Spermatogenese zugrunde liegen. Obwohl es etablierte Zellisolationsprotokolle mit Hoechst 33342 Färbung in Kombination mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung gibt, sind Zellsortierer mit einem ultravioletten Laser erforderlich. Hier beschreiben wir ein Zellisolationsprotokoll mit dem DyeCycle Violet (DCV) Fleck, einem DNA-Bindungsfarbstoff mit geringer Zytotoxizität, der Hoechst 33342 strukturell ähnelt. DCV kann sowohl von ultravioletten als auch von violetten Lasern angeregt werden, was die Flexibilität der Geräteauswahl verbessert, einschließlich eines Zellsortierers, der nicht mit einem ultravioletten Laser ausgestattet ist. Mit diesem Protokoll kann man drei lebende Zellsubpopulationen in der meiotischen Prophase I isolieren, einschließlich Leptotene/Zygoten, Pachyten und Diploten-Spermatozyten sowie postmetiotische runde Spermatien. Wir beschreiben auch ein Protokoll zur Vorbereitung der einzelzelligen Suspension von Maushoden. Insgesamt benötigt das Verfahren eine kurze Zeit (4-5 Stunden abhängig von der Anzahl der benötigten Zellen), was viele nachgelagerte Anwendungen erleichtert.
Einleitung
Spermatogenese ist ein komplexer Prozess, bei dem eine kleine Population von SpermatogonialStammzellen die kontinuierliche Produktion einer großen Anzahl von Spermien während des Erwachsenenlebens1,2aufrechterhält. Während der Spermatogenese findet die dynamische Chromatin-Remodellierung statt, wenn spermatogene Zellen einer Meiose unterzogen werden, um haploide Spermaatiden3,4,5zu produzieren. Die Isolierung meiotischer Spermatozyten ist für die molekulare Untersuchung von wesentlicher Bedeutung, und es wurden versch....
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Protokoll
Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung (Protokoll Nr. IACUC2018-0040) im Cincinnati Children es Hospital Medical Center.
1. Ausrüstungs- und Reagenzaufbau zur Herstellung der Hodenzellsuspension
- Bereiten Sie jeden Enzymbestand in 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) vor und lagern Sie bei -20 °C . (Tabelle1).
HINWEIS: Bereiten Sie jederzeit vor dem Experiment vor. - Einen Tag vor dem Experiment: Mantelsammelrohre (1,5 ml Röhren) mit Fetal rinderserum (FBS) bei 4 °C über Nacht.
- Am Tag des Experiments: Stellen Sie das Wasserbad auf ....
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Ergebnisse
Ein repräsentatives Ergebnis dieses Sortierprotokolls ist in Abbildung 3dargestellt. Die Gesamtsortierzeit von zwei Hoden (eine Maus) beträgt in der Regel etwa 3 Stunden, was von der Konzentration der Zellsuspension und der Sortiergeschwindigkeit abhängt. Nach der Sortierung wird die Reinheit der Spermatozyten durch Immunfärbung von SYCP3 und H2AX bestätigt (Abbildung 3A). Die repräsentative Reinheit der sortierten L/Z-, P-, D-Spermatozytenfraktionen beträgt etw.......
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Diskussion
Hier stellen wir ein praktisches und einfaches Protokoll vor, um Subpopulationen von Spermatozyten und Spermatoren aus einer einzigen erwachsenen männlichen Maus zu isolieren. Um die Reproduzierbarkeit dieses Protokolls zu gewährleisten, gibt es einige wichtige Schritte, die Aufmerksamkeit erfordern. Vor der Enzymverdauung, Waschschritt zielt darauf ab, interstitielle Zellen zu entfernen; nach der Verdauung hilft dieser Schritt, Spermatozoen und Schmutz zu entfernen. Waschen/Zentrieren ist wichtig. In unserem Dissoziatio.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.
Danksagungen
Wir danken den Mitgliedern der Laboratorien Namekawa, Yoshida und Maezawa für ihre Hilfe; Katie Gerhardt für die Bearbeitung des Manuskripts; Mary Ann Händel für die gemeinsame Nutzung des H1T-Antikörpers, des Cincinnati Children es Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometry Core für die gemeinsame Nutzung der FACS-Ausrüstung, die von NIH S10OD023410 unterstützt wird; Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI; 17K07424) an T.N.; Lalor Foundation Postdoktorandenstipendium an A.S.; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) nach S.Y.; das Forschungsprojekt Grant von der Azabu University Research Services Division, Ministry of Education, Culture, Sports, Science an....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,5 ml Röhrchen | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm | Petrischale Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Zentrifugenröhrchen | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml Polystyrolröhrchen mit Schnappkappe des Zellsiebs (35 &; Mikro; m Nylongewebe) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Zentrifugenröhrchen | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petrischale | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µ m Nylon Mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Zellsortierer | Sony | SH800S | |
| Zentrifuge | |||
| Kollagenase, rekombinant, tierisch frei | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Kollagenase, Typ 1 | Worthington | LS004196 | |
| Deckglas | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid) | Fisher | D1306 | Arbeitskonzentration: 0,1 μ g/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Eselsserum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histon H1t Antikörper | Geschenk von Mary Ann Handel | 1/2000 verdünnter | |
| Hank' s ausgewogene Salzlösung (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase aus Rinderhoden | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettenhalter | |||
| ProLong Gold Antifade Eindeckmittel | Fisher | P36930 | |
| rH2AX Antikörper | Millipore | 05-635 | Arbeitsschwerpunkt: 2 μ g/mL |
| Spermienbefruchtungsprotein 56 (Sp56) Antikörper | QED Bioscience | 55101 | Arbeitskonzentration: 0,5 μ g/mL |
| Sterilisierte Pinzette und Schere | |||
| Superfrost /Plus Objektträger | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 Antikörper | Abcam | ab205846 | Arbeitskonzentration: 5 μ g/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbat 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violetter Farbstoff (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Wasserbad |
Referenzen
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
