Hier stellen wir ein Protokoll für die hochreine manuelle Isolierung und Qualitätskontrolle von mütterlichem Embryo-, Endosperm- und Samengewebe während der gesamten Entwicklung des Gerstensamens vor.
Methodenartikel
Isolierung von hochreinem Gewebe aus der Entwicklung von Gerstensaatgut
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Verständnis der Mechanismen, die die Entwicklung von Getreidesaatgut regulieren, ist für die Pflanzenzüchtung und die Steigerung des Ertrags unerlässlich. Die Analyse von Getreidesamen ist jedoch aufgrund der winzigen Größe, des flüssigen Charakters einiger Gewebe und der engen Verbindungen zwischen den Geweben eine Herausforderung. Hier zeigen wir ein detailliertes Protokoll für die Dissektion des mütterlichen Gewebes des Embryos, des Endosperms und des Samens in frühen, mittleren und späten Stadien der Entwicklung der Gerstensamen. Das Protokoll basiert auf einer manuellen Gewebedissektion mit fein spitzen Werkzeugen und einem binokularen Mikroskop, gefolgt von einer auf Ploidieanalyse basierenden Reinheitskontrolle. Das mütterliche Samengewebe und die Embryonen sind diploid, während das Endosperm triploides Gewebe ist. Dies ermöglicht die Überwachung der Probenreinheit mittels Durchflusszytometrie. Zusätzliche Messungen zeigten die hohe Qualität der aus solchen Proben isolierten RNA und ihre Eignung für hochempfindliche Analysen. Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll, wie reine Gewebe aus sich entwickelnden Körnern von Kulturgerste und möglicherweise auch anderen Getreidesorten praktisch zerlegt werden können.
Einleitung
Samen sind komplexe Strukturen, die aus mehreren Geweben mütterlichen und kindlichen Ursprungs bestehen1. Getreidekörner stellen eine besondere Art von Saatgut dar, wobei der größte Teil aus Endosperm besteht, einem spezialisierten triploiden Gewebe, das den Embryo schützt und ernährt. Getreide liefert rund 60 % der weltweiten Nahrungsmittelressourcen und ist der wertvollste Ertrag aus der Pflanzenproduktion2. Die Kenntnis der molekularen Prozesse, die die Entwicklung von Getreidesamen steuern, ist aufgrund ihrer wirtschaftlichen Bedeutung und ihrer zentralen Rolle bei der Pflanzenfortpflanzung wichtig<....
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Protokoll
1. Pflanzen anbauen
HINWEIS: Wenn man bedenkt, dass eine einzelne Gerstenpflanze in der Regel 5 bis 6 Bestockungen hat und nur die mittleren 5 bis 6 Ährchen jeder Ähre zum Sezieren verwendet werden sollten, beträgt der maximale Ertrag pro Pflanze 72 Samen für zweireihige und 216 Samen für sechsreihige Sorten.
- Um Gerstensamen zum Keimen zu bringen, bereiten Sie eine Petrischale vor, die mit drei Lagen Zellulosepapier gepolstert und mit einer Schicht Filterpapier bedeckt ist. Befeuchten Sie es mit destilliertem Wasser, damit kein überschüssiges Wasser entsteht, legen Sie die Samen auf die Oberfläc....
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Ergebnisse
Um eine gewebespezifische transkriptomische Analyse der Entwicklung von Gerstensamen durchzuführen, haben wir ein Protokoll für die Isolierung von hochreinem Gewebe erstellt. Das Protokoll basiert auf der manuellen Dissektion von mütterlichem Embryo-, Endosperm- und Samengewebe aus geschälten (nach manueller Entnahme der Schale) Körnern (Abbildung 1A). Das Protokoll wurde erfolgreich für die Isolierung von Material aus mehreren zwei- und sechszeiligen Sommergerstensorten verwendet, und die S.......
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Diskussion
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das eine hochreine Isolierung von Gerstensamengewebe ermöglicht. Obwohl es für Gerste entwickelt und getestet wurde, kann es leicht auf andere Mitglieder des Triticeae-Stammes wie Weizen, Hafer, Roggen oder Triticale übertragen werden27. Der anfängliche Teil des Protokolls, der sich auf die Dissektion von Samengewebe konzentriert, erfordert keine ungewöhnliche oder teure Ausrüstung und sollte daher für viele Wissenschaf.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken Dr. Jan Vrána und Dr. Mahmoud Said für die Wartung der Durchflusszytometer, Eva Jahnová für die Vorbereitung der Puffer, Marie Seifertová für die Materialliste und Zdenka Bursová für die Pflanzenpflege. Diese Arbeit wurde hauptsächlich aus dem Stipendium 18-12197S der Tschechischen Wissenschaftsstiftung unterstützt. A.P. wurde außerdem durch das J. E. Purkyně-Stipendium der Tschechischen Akademie der Wissenschaften und das EFRE-Projekt "Pflanzen als Werkzeug für eine nachhaltige globale Entwicklung" (Nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,22 μm Filter | Merck | SLGSV255F | |
| 1,5 ml Eppendorf Tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 4',6-diamididno-2-phenylindol | Invitrogen | D21490 | |
| 50 um Nylon | Mesh Silk a Progrers | uhelon 120 T | |
| Agilent 2100 Bioanalysator | Agilent | G2939BA | |
| Bulb Assembly | Drummond Scientific Company | 1-000-9000 | |
| Kalibrierkugeln | Invitrogen | A16502 | |
| Zellulose-Seidenpapier | |||
| Zitronensäure-Monohydrat | Penta | 13830-31000 | |
| Klimakammer | Weiss Gallenkamp | ||
| DNase I | Sigma Aldrich | DNASE70 | |
| Filter Papier | Fagron | ||
| Feinspitze Pinzette | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Durchflusszytometer | Sysmex-Partec | ||
| Durchflusszytometrie-Röhrchen | Sarstedt | 55.484 | |
| Gefrierschrank | |||
| Pergaminbeutel | |||
| KCl | Lachner | 30076-AP0 | |
| KH2PO4 | Litolab | 100109 | |
| Flüssigstickstoff | Linde | ||
| Mikrokapillarpipette | Fivephoton Biochemicals | MGM 1C-20-30 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Na2HPO4 | Lachema | ||
| Na2HPO4.12H2O | Lachner | 30061-AP0 | |
| NaCl | Lachner | 30093-AP0 | |
| Torftöpfe | Jiffy | 5x5 cm | |
| Petrischale | |||
| Nadelhalter | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Kunststoffstößel | p-Lab | A199001 | |
| Töpfe | 12x12 cm | ||
| Rasierklinge | Gillette | ||
| RNAse zap | Invitrogen | AM9780 | |
| Sand | |||
| Scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Soil | |||
| Spectrum Plant Total RNA Kit | Sigma Aldrich | STRN50 | |
| Stereomikroskop | Olympus | ||
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287 | |
| TRIzol Reagenz | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 |
Referenzen
- Sreenivasulu, N., et al. Barley grain development: Toward an integrative view. International Review of Cell and Molecular Biology. 281, 49-89 (2010).
- FAO. Cereal supply and demand brief. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: http://www.fao.org (2019).
- Baik, B. K., Ullrich, S. E.
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