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Isolierung von hochreinem Gewebe aus der Entwicklung von Gerstensaatgut

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DOI:

10.3791/61681

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26. Oktober 2020

 ,  , 
1Czech Acad Sci, Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research, Institute of Experimental Botany, 2The Polish Academy of Sciences, The Franciszek Górski Institute of Plant Physiology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für die hochreine manuelle Isolierung und Qualitätskontrolle von mütterlichem Embryo-, Endosperm- und Samengewebe während der gesamten Entwicklung des Gerstensamens vor.

Zusammenfassung

Das Verständnis der Mechanismen, die die Entwicklung von Getreidesaatgut regulieren, ist für die Pflanzenzüchtung und die Steigerung des Ertrags unerlässlich. Die Analyse von Getreidesamen ist jedoch aufgrund der winzigen Größe, des flüssigen Charakters einiger Gewebe und der engen Verbindungen zwischen den Geweben eine Herausforderung. Hier zeigen wir ein detailliertes Protokoll für die Dissektion des mütterlichen Gewebes des Embryos, des Endosperms und des Samens in frühen, mittleren und späten Stadien der Entwicklung der Gerstensamen. Das Protokoll basiert auf einer manuellen Gewebedissektion mit fein spitzen Werkzeugen und einem binokularen Mikroskop, gefolgt von einer auf Ploidieanalyse basierenden Reinheitskontrolle. Das mütterliche Samengewebe und die Embryonen sind diploid, während das Endosperm triploides Gewebe ist. Dies ermöglicht die Überwachung der Probenreinheit mittels Durchflusszytometrie. Zusätzliche Messungen zeigten die hohe Qualität der aus solchen Proben isolierten RNA und ihre Eignung für hochempfindliche Analysen. Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll, wie reine Gewebe aus sich entwickelnden Körnern von Kulturgerste und möglicherweise auch anderen Getreidesorten praktisch zerlegt werden können.

Einleitung

Samen sind komplexe Strukturen, die aus mehreren Geweben mütterlichen und kindlichen Ursprungs bestehen1. Getreidekörner stellen eine besondere Art von Saatgut dar, wobei der größte Teil aus Endosperm besteht, einem spezialisierten triploiden Gewebe, das den Embryo schützt und ernährt. Getreide liefert rund 60 % der weltweiten Nahrungsmittelressourcen und ist der wertvollste Ertrag aus der Pflanzenproduktion2. Die Kenntnis der molekularen Prozesse, die die Entwicklung von Getreidesamen steuern, ist aufgrund ihrer wirtschaftlichen Bedeutung und ihrer zentralen Rolle bei der Pflanzenfortpflanzung wichtig 1,3.

Kulturgerste (Hordeum vulgare subsp. vulgare; 2n = 2x = 14; 1C = 5,1 Gbp) ist die viertwichtigste Getreideart weltweit. Es wird für Tierfutter, Lebensmittel und Biotechnologieverwendet 4. Darüber hinaus handelt es sich auch um eine klassische Modellart für Getreidekulturen in der gemäßigten Zone von wachsender Bedeutung5. Zu den genomischen Ressourcen von Gerste gehören genetische Karten, Sammlungen von Kultivaren, Landrassen und Mutanten, hochwertige Genomassemblierungen und Annotationen sowie transkriptomische Daten der wichtigsten Entwicklungsstadien 5,6,7. Gerstengene werden auch zur genetischen Verbesserung anderer Getreidearten verwendet. Die Resistenz gegen abiotische Stressfaktoren wie Trockenheit und Salzgehalt, spezifische Krankheitserreger und ein hoher Gehalt an nützlichen Verbindungen (z. B. β-Glucan) machen Gerste zu einer wertvollen Quelle für die Weizenzüchtung8.

Die Samenentwicklung wird durch die Befruchtung am Tag der Bestäubung (DOP) eingeleitet. DOP wird durch die Bewertung der Morphologie von Stigma und Staubbeuteln nach der Waddington-Skala (W10.0)9 definiert. Die Ähren mit unbestäubten Blüten zeichneten sich durch kompakte (unverzweigte) Narben und grüne Staubbeutel aus, während bestäubte Ähren ausgedehnte Ähren, ausgedehnte und weit verzweigte Narben, geschwollene Eizellen, geöffnete Staubbeutel und freien Pollen enthielten. Die Blüten bei DOP stellten einen intermediären Phänotyp dar. Die Staubbeutel hatten eine gelbe Farbe, lösten sich leicht auf und setzten dann Pollen frei. Das Stigma hatte weit verbreitete sigmatische Äste des Stempels (Abbildung 1C).

Die Entwicklung des Gerstensaatguts umfasst drei sich teilweise überlappende Stadien 1,10. Das Stadium I (0 – 6 Tage nach der Bestäubung; DAP) wird durch Doppelbefruchtung eingeleitet, die durch Zellproliferation und das Fehlen von Stärkesynthese gekennzeichnet ist; Stufe II (7 – 20 DAP) umfasst die Differenzierung und den großen Biomassegewinn, begleitet von der Produktion von Stärke und Proteinspeichermolekülen; Das Stadium III (nach 21 DAP) entspricht der Samenreifung, der Gewichtsreduktion durch Austrocknung und dem Beginn der Ruhephase. Alternativ werden die Phasen als früh, mittel und spät bzw.11 bezeichnet.

Das Gerstenkorn ist von Schalen bedeckt, die aus dem Lemma, der Palea und den Hüllspelzenbestehen 12. Bei den meisten Gerstengenotypen umhüllen die Schalen die trockenen Samen fest. Der Samen selbst wird aus dem Embryo, dem Endosperm und dem mütterlichen Gewebe des Samens gebildet (Abbildung 1A). Der diploide Embryo entsteht aus der Befruchtung der Eizelle durch einen Samenzellkern. Im voll entwickelten Samen besteht der Embryo aus der embryonalen Achse, wobei die Coleorhiza den Keimwurzel umgibt, dem Coleoptil, das das Sprossmeristem und die Hauptblätter umschließt, und dem Scutellum (Keimblatt)1,10,13,14. Das triploide Endosperm ist das Ergebnis der Befruchtung der diploiden Zentralzelle durch den zweiten Samenzellkern. Die Proliferation des Endosperms beginnt mit dem Synzytialstadium (Zönozytenstadium), in dem die sich teilenden Kerne durch die zentrale Vakuole an die Peripherie gedrückt werden. Am Ende der Synzytialphase bilden Mikrotubuli ein radiales Netzwerk um die Zellkerne und zeigen die Bildung von antiklinalen Zellwänden und den Beginn der Endosperm-Zellularisierung an. Die Differenzierung des Endosperms erfolgt gleichzeitig mit der Zellularisierung und führt zu fünf Hauptgeweben: dem stärkehaltigen Endosperm, den Transferzellen, den Aleuron- und Subaleuronschichten und der umgebenden Region des Embryos. Samenmaternalgewebe sind eine mehrschichtige diploide Struktur mütterlichen Ursprungs, die Perikarp und Samenschalen enthält10,12. Zu den mütterlichen Geweben der Samen gehört eine nuzellare Projektion auf der dorsalen Seite des Korns, die eine transportbezogene Funktion hat und in späteren Stadien der Samenentwicklung in das Endosperm eingebettet wird15.

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Abbildung 1: Entwicklung von Gerstensamen. (A) Die schematische Zeichnung des Getreidekorns auf dem sagittalen Plan mit angedeuteten Samengeweben (SMTs, grün), Endosperm (END, gelb), Embryo (EMB, orange) und Schalen (H, grau). (B) Morphologie der Gerstenähre in der Nähe der Anthese. Maßstabsbalken = 1 cm. (C) Morphologie der Narbe und Staubbeutel in den Stadien vor, während und nach der Bestäubung. Der Einschub zeigt einen Ausschnitt der Narbe mit Pollenkörnern (Pfeilspitzen). Maßstabsbalken = 5 mm, eingesetzter Balken = 200 μm. (D) Sagittal- und Querschnitte von 4, 8, 16 und 24 DAP-Samen. (NP, nuzellare Projektion) Maßstabsleiste = 5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Jüngste Fortschritte in der Hochdurchsatzgenomik liefern die Werkzeuge für die Untersuchung der Entwicklung des individuellen Samengewebes. Das größte Hindernis dabei ist jedoch die kompakte Struktur und die dichte Haftung des Samengewebes1. Wir haben ein Protokoll für die hochreine Dissektion von Saatgutgewebe entwickelt, von der Entwicklung von Gerstensaatgut mit der Möglichkeit zur anschließenden Verwendung für hochempfindliche Analysen, wie z.B. RNA-Sequenzierung. Darüber hinaus kann das vorgestellte Protokoll leicht an andere Getreidesorten angepasst werden.

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Protokoll

1. Pflanzen anbauen

HINWEIS: Wenn man bedenkt, dass eine einzelne Gerstenpflanze in der Regel 5 bis 6 Bestockungen hat und nur die mittleren 5 bis 6 Ährchen jeder Ähre zum Sezieren verwendet werden sollten, beträgt der maximale Ertrag pro Pflanze 72 Samen für zweireihige und 216 Samen für sechsreihige Sorten.

  1. Um Gerstensamen zum Keimen zu bringen, bereiten Sie eine Petrischale vor, die mit drei Lagen Zellulosepapier gepolstert und mit einer Schicht Filterpapier bedeckt ist. Befeuchten Sie es mit destilliertem Wasser, damit kein überschüssiges Wasser entsteht, legen Sie die Samen auf die Oberfläche und schließen Sie die Petrischale. Filterpapier vermeidet das Wachstum der Wurzeln durch das Zellulosegewebe. Keime die Samen 3 Tage lang bei 25 °C im Dunkeln.
    HINWEIS: Alternativ können Sie die Samen keimen lassen, indem Sie sie direkt in eine feuchte Erdmischung legen (siehe Schritt 1.2).
  2. Übertragen Sie gekeimte Samen mit sichtbarem Keimwurzel und Trieb von ca. 5 cm Länge in 5 cm x 5 cm große Torftöpfe mit einer Mischung aus Erde und Sand (3:1, v/v). Gießen Sie regelmäßig. Nach 10 Tagen füllst du die Pflanzen in 12 cm x 12 cm große Töpfe um, die mit der gleichen Erdmischung gefüllt sind.
  3. Bauen Sie die Pflanzen in einer Klimakammer unter kontrolliertem Langzeitregime an (16 h Tag 20 °C, 8 h Nacht 16 °C; Lichtintensität 200 μmol m-2 s-1; Luftfeuchtigkeit 60%).
    HINWEIS: Sommergerste benötigt von der Aussaat bis zum Beginn der Anthese ca. 8-10 Wochen, ohne dass eine Vernalisation erforderlich ist. Wintergerste benötigt 7-8 Wochen Vernalisation (Kurztagbedingungen, 8 h Tag 4 °C, 16 h Nacht 4 °C; Lichtintensität 200 μmol m-2 s-1; Luftfeuchtigkeit 85%), um die Blüte einzuleiten.

2. Bestimmung der Bestäubung

HINWEIS: Eine genaue Bestimmung der Bestäubung ist erforderlich, um den Entwicklungsfortschritt richtig abschätzen zu können. Gerste ist eine selbstbestäubende Art. Um den Tag der Bestäubung (DOP) zu definieren, haben wir den Tag der Selbstbestäubung überwacht. Dieses Merkmal ist sortenspezifisch, aber das beginnende Hervorstehen der Grannen aus der Blattscheide ist ein guter Indikator für die Annäherung an DOP (Abbildung 1B).

  1. Öffne die Blattscheide, die die Ähre bedeckt. Verwende eine feine Pinzette, um die Staubbeutel und den Fruchtknoten innerhalb der Ährchen im mittleren Teil der Ährchen zu überprüfen. Ährchen mit gelben Staubbeuteln und "flauschigen" Narben bestäuben innerhalb weniger Stunden16 und gelten als DOP (Abbildung 1B).
  2. Schneiden Sie den Spieß in der Nähe der Spitze des letzten Ährchens ab und entfernen Sie das Fahnenblatt und den oberen Teil der Grannen. Schneiden Sie dann das obere 1/3 der Rümpfe in jedem Ährchen ab. Dies trocknet die Staubbeutel aus und führt zu einer synchronisierteren Öffnung und Freisetzung von Pollen.
  3. Decken Sie die Ähre mit einem Pergaminbeutel ab, in dem die Ähren-ID, die Pflanzennummer und das definierte DOP-Datum angegeben sind. Dies verhindert auch eine gegenseitige Befruchtung, die bestimmte Experimente beeinträchtigen kann.
  4. Notieren Sie die Informationen in einem tabellarischen Editor. Verwenden Sie die folgende Formel, um den Tag nach der Bestäubung (DAP) zu berechnen, an dem eine Gewebeisolierung stattfinden sollte.
    xDAP = DOP + x
    x = erwarteter DAP
    HINWEIS: Die Werte sollten das Format "Daten" haben.
  5. Für die Dissektion des Samengewebes sammeln Sie die Ähren am DAP gemäß dem vorbereiteten Tabellenkalender.

3. Dissektion des Samengewebes

HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten mit einem Stereomikroskop durchgeführt werden. Entfernen Sie die Schalen vor dem Sezieren mit einer Pinzette. Beachten Sie, dass die Rümpfe ab etwa 16 DAP trockener und haftender werden. Um die physiologischen Bedingungen zu erhalten und ein Austrocknen des Pflanzenmaterials während der Dissektion zu vermeiden, befeuchten Sie die Proben, indem Sie sie in einen Tropfen von 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH = 7,4) geben. Verwenden Sie einen neuen Samen für die Sektion jedes Gewebes, um einen DNA-, RNA- oder Proteinabbau aufgrund der verlängerten Probenentnahmezeit zu vermeiden. Verwenden Sie für die RNA-Isolierung aus präpariertem Material nur RNase-freie Materialien und Chemikalien. Überschreiten Sie nicht die Gesamtdissektionszeit von 15 Minuten für eine Probe, die typischerweise aus Geweben besteht, die aus 5-10 Seeds präpariert wurden, um den RNA-Abbau zu minimieren.

  1. Entfernen Sie den Rest der Schalen mit einer feinen Pinzette, bevor Sie das Gewebe dissektionieren. Die Feuchtigkeitspflege mit 1× PBS für 1 Minute hilft, trockene Rückstände des Ährchens zu entfernen.
  2. Legen Sie den geschälten Samen mit einem Tropfen 1× PBS auf eine Petrischale und präparieren Sie die einzelnen Teile mit einer feinen Pinzette, einer Feinnadel und einer Mikrokapillarpipette. Eine etwas andere Strategie wird für die Dissektion einzelner Gewebe angewendet: des mütterlichen Samengewebes (Schritt 3.3), des Embryos (Schritt 3.4) und des Endosperms (Schritt 3.5).
  3. Dissektion von mütterlichem Samengewebe
    1. Sezieren von Samen bis zu 8 DAP
      1. Legen Sie einen Samen auf die dorsale Seite und schneiden Sie den Samen vorsichtig entlang einer Längsachse ab und schälen Sie das mütterliche Samengewebe mit Ausnahme der letzten Schicht, die das Endosperm vom apikalen zum basalen Teil begrenzt, mit einer Pinzette ab.
      2. Sammeln Sie Samengewebe von 5 bis 10 Samen in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 50 μl 1× PBS, entsorgen Sie den Puffer mit einer Pipette, spülen Sie das Gewebe zweimal mit 100 μl PBS aus, entfernen Sie überschüssigen Puffer durch Pipettieren und schließen Sie das Röhrchen und frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein oder verwenden Sie es direkt für die durchflusszytometrische Ploidiemessung. Die Materialmenge ist ausreichend für typischerweise eine Downstream-Anwendung (z. B. RNA-Isolierung oder durchflusszytometrische Ploidiemessung).
    2. Sektion von Samen nach 8 DAP
      1. Legen Sie einen Samen auf die dorsale Seite, schneiden Sie vorsichtig in der Mitte der ventralen Seite des mütterlichen Samengewebes ab und schälen Sie allmählich das Gewebe um den ganzen Samen herum ab, einschließlich der nuzellaren Projektion. Für jede nachgelagerte Anwendung ist das Gewebe von 5 bis 10 Samen zu sammeln und zu waschen, wie in Schritt 3.3.1 beschrieben.
  4. Dissektion des Embryos
    1. Sezieren von Samen im Alter von 8 DAP und jünger
      1. Legen Sie einen Samen auf die dorsale Seite und schneiden Sie basal 1/3 des Samens ab. Teilen Sie den abgetrennten Teil vorsichtig in zwei Hälften und lassen Sie den Embryo frei. Für jede nachgelagerte Anwendung werden die Embryonen von 10 bis 20 Samen gemäß Nummer 3.3.1 entnommen und gewaschen.
    2. Sektion von Samen nach 8 DAP
      1. Legen Sie einen Samen auf die dorsale Seite und entfernen Sie das mütterliche Gewebe des Samens aus dem basalen Teil der ventralen Seite. Stören Sie vorsichtig die dünne Schicht des Endosperms um den Umfang des Embryos mit einer feinnadeligen oder feinen Pinzette und schälen Sie den Embryo heraus. Für jede nachgelagerte Anwendung werden Embryonen von bis zu 5 Samen gemäß Abschnitt 3.3.1 entnommen und gewaschen.
  5. Dissektion des Endosperms
    1. Dissektion des synzytialen Endosperms aus 4 DAP-Samen.
      1. Platzieren Sie einen Samen auf der dorsalen Seite und entfernen Sie das mütterliche Samengewebe mit Ausnahme der letzten Zellschicht, die das Endosperm begrenzt. Stechen Sie die Schicht in der Mitte der ventralen Seite vorsichtig mit einer dünnen Nadel ein und saugen Sie das synzytiale Endosperm durch Kapillarwirkung mit einer Mikrokapillarpipette ab.
      2. Für jede Downstream-Anwendung sammeln Sie flüssige Endospermen von 10 bis 15 Seeds in ein neues 1,5-ml-Röhrchen mit Puffer, der für die geplante Downstream-Analyse geeignet ist (d. h. 1x PBS, RNA-Isolationspuffer, Durchflusszytometrie-Puffer). Das Puffervolumen sollte dem Protokoll für die geplante nachgeschaltete Anwendung entsprechen. In flüssigem Stickstoff einfrieren.
    2. Dissektion von zellullarisierendem Endosperm von 5 bis 8 DAP-Samen
      1. Platzieren Sie einen Samen auf der dorsalen Seite und entfernen Sie alle Samen, das mütterliche Gewebe und den Embryo. Für jede nachgelagerte Anwendung wird das Endosperm von 10 bis 15 Samen gesammelt, in ein neues 1,5-ml-Röhrchen mit 1x PBS gewaschen und in flüssigem Stickstoff eingefroren.
    3. Dissektion von zellullarisiertem Endosperm aus dem Samen nach 8 DAP
      1. Legen Sie einen Samen auf die dorsale Seite, entfernen Sie das gesamte mütterliche Samengewebe und den Embryo. Für jede nachgelagerte Anwendung ist das Endosperm von einem einzigen Samen pro Röhrchen zu sammeln und zu waschen, wie in Schritt 3.3.1 beschrieben.
  6. Lagern Sie die Röhrchen mit isoliertem Material bis zur Verwendung bei – 80 °C.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.

4. Kontrolle der Gewebereinheit mittels Durchflusszytometrie

HINWEIS: Die Reinheit der Probe kann vor der RNA-Isolierung mittels Durchflusszytometrie überprüft werden. Die richtige Kalibrierung des Instruments ist für die Analyse biologischer Proben von entscheidender Bedeutung. Die Optik des Durchflusszytometers/Ploidieanalysators sollte mit Hilfe von Kalibrierperlen (fluoreszenzgefärbte Polystyrol-Mikrosphären, die in Bezug auf ihre Größe und Fluoreszenzintensität sehr gleichmäßig sind) bis zur maximalen Spitzenschärfe eingestellt werden, die typischerweise den Variationskoeffizienten (CV) < 2 % erreicht. Getreidesamengewebe enthalten hauptsächlich Populationen von G1, G2 und endoreduplizierten Kernen; Daher wird die Verwendung einer logarithmischen Skala empfohlen. Beginnen Sie mit einem Blattgewebe, das hauptsächlich G1-Kerne enthält und als basale Ploidiekontrolle dient.

  1. Verwenden Sie frisch vorbereitete Proben, die auf Eis (siehe Schritt 3.3.1) oder gefrorenem Gewebe aufbewahrt werden, wie beschrieben17.
    HINWEIS: Da die gesamte < 8 DAP-Probe für die Durchflusszytometrie verwendet wird, stellt dies nur eine indirekte Kontrolle dar. Wir empfehlen Forschern, mehrere Isolierungen und Messungen durchzuführen, bis ein hoher Anteil an reinen Proben (>90%) erreicht ist, bevor sie mit der RNA-Isolierung mit < 8 DAP-Proben fortfahren.
  2. Die Zellkerne aus den 4 und 8 DAP-Embryoproben werden freigesetzt (für andere Proben siehe Schritt 4.4), indem das Gewebe durch 5 bis 10 Umdrehungen des Kunststoffstößels in einem 1,5-ml-Röhrchen mit 300 μl Otto I-Puffer (0,1 M Zitronensäuremonohydrat, 0,5 % (v/v) Tween 20, filtriert durch einen 0,22 μm-Filter) homogenisiert wird)18.
  3. Die Rohsuspension wird durch ein 50 μm Nylonnetz in ein Durchflusszytometrie-Analyseröhrchen filtriert und 600 μl Otto II-Puffer (0,4 M Na2HPO 4,12H2O) mit 2 μg mL-1 DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol)18 zur DNA-Färbung hinzugefügt.
  4. Alle anderen Gewebe (einschließlich 16 DAP oder älterer Embryonen) werden auf eine Petrischale gelegt, die 500 μl Otto I-Puffer enthält, und durch Zerkleinern mit einer Rasierklinge homogenisiert. Die Suspension wird wie in Schritt 4.3 filtriert und mit 1 ml Otto-II-Puffer, der DAPI enthält, gefärbt.
    HINWEIS: Die Manipulation mit einer scharfen doppelschneidigen Rasierklinge erfordert besondere Aufmerksamkeit. Um das Verletzungsrisiko zu verringern, stehen einschneidige Rasierklingen oder spezielle Klingenhalter zur Verfügung.
  5. Schätzen Sie den Kern-DNA-Gehalt der Probe mit einem Durchflusszytometer. Für die Analyse der Probenreinheit sind mindestens 2000 Partikel pro Probe erforderlich.

5. RNA-Isolierung und Qualitätsmessung

  1. Verwenden Sie gefrorenes Gewebe, um den RNA-Abbau durch endogene Ribonukleasen zu verhindern. Aus Samengewebe, mütterlichen Geweben und Embryonenproben wird RNA mit kommerziell erhältlichen Kits oder TRIzol-Reagenz19 isoliert. Aufgrund eines hohen Stärkegehalts in Endospermgeweben ist die Gesamt-RNA aus allen Proben unter Verwendung kommerzieller On-Column-RNA-Extraktionsprotokolle für problematische Gewebe (z. B. Spectrum Plant Total RNA Kit) mit einer On-Column-DNase I-Behandlung20 zu isolieren.
  2. Messen Sie die RNA-Konzentration und -Integrität mit einem speziellen Protokoll für die RNA-Gelelektrophorese oder dem Agilent 2100 Bioanalyzer.
    HINWEIS: Intakte Gesamt-RNA hat klare 18S- und 25S-rRNA-Banden/Peaks mit einer Größe von etwa 1,9 bzw. 3,7 kb. Die 25S rRNA-Bande sollte etwa doppelt so intensiv sein wie die 18S rRNA-Bande.

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Ergebnisse

Um eine gewebespezifische transkriptomische Analyse der Entwicklung von Gerstensamen durchzuführen, haben wir ein Protokoll für die Isolierung von hochreinem Gewebe erstellt. Das Protokoll basiert auf der manuellen Dissektion von mütterlichem Embryo-, Endosperm- und Samengewebe aus geschälten (nach manueller Entnahme der Schale) Körnern (Abbildung 1A). Das Protokoll wurde erfolgreich für die Isolierung von Material aus mehreren zwei- und sechszeiligen Sommergerstensorten verwendet, und die S...

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Diskussion

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das eine hochreine Isolierung von Gerstensamengewebe ermöglicht. Obwohl es für Gerste entwickelt und getestet wurde, kann es leicht auf andere Mitglieder des Triticeae-Stammes wie Weizen, Hafer, Roggen oder Triticale übertragen werden27. Der anfängliche Teil des Protokolls, der sich auf die Dissektion von Samengewebe konzentriert, erfordert keine ungewöhnliche oder teure Ausrüstung und sollte daher für viele Wissenschaf...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Dr. Jan Vrána und Dr. Mahmoud Said für die Wartung der Durchflusszytometer, Eva Jahnová für die Vorbereitung der Puffer, Marie Seifertová für die Materialliste und Zdenka Bursová für die Pflanzenpflege. Diese Arbeit wurde hauptsächlich aus dem Stipendium 18-12197S der Tschechischen Wissenschaftsstiftung unterstützt. A.P. wurde außerdem durch das J. E. Purkyně-Stipendium der Tschechischen Akademie der Wissenschaften und das EFRE-Projekt "Pflanzen als Werkzeug für eine nachhaltige globale Entwicklung" (Nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,22 μm FilterMerckSLGSV255F
1,5 ml Eppendorf TubeSarstedt72.690.001
4',6-diamididno-2-phenylindolInvitrogenD21490
50 um NylonMesh Silk a Progrersuhelon 120 T
Agilent 2100 BioanalysatorAgilentG2939BA
Bulb AssemblyDrummond Scientific Company1-000-9000
KalibrierkugelnInvitrogenA16502
Zellulose-Seidenpapier
Zitronensäure-MonohydratPenta13830-31000
KlimakammerWeiss Gallenkamp
DNase ISigma AldrichDNASE70
Filter PapierFagron
Feinspitze PinzetteFine Science Tools11254-20
DurchflusszytometerSysmex-Partec
Durchflusszytometrie-RöhrchenSarstedt55.484
Gefrierschrank
Pergaminbeutel
KClLachner30076-AP0
KH2PO4Litolab100109
FlüssigstickstoffLinde
MikrokapillarpipetteFivephoton BiochemicalsMGM 1C-20-30
Minutien PinsFine Science Tools26002-20
Na2HPO4Lachema
Na2HPO4.12H2OLachner30061-AP0
NaClLachner30093-AP0
TorftöpfeJiffy5x5 cm
Petrischale
NadelhalterFine Science Tools26016-12
Kunststoffstößelp-LabA199001
Töpfe12x12 cm
RasierklingeGillette
RNAse zapInvitrogenAM9780
Sand
ScissorsFine Science Tools14060-11
Soil
Spectrum Plant Total RNA KitSigma AldrichSTRN50
StereomikroskopOlympus
Tween 20Sigma AldrichP2287
TRIzol ReagenzInvitrogen15596026
RNA 6000 Pico KitAgilent5067-1513

Referenzen

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