Hier wird eine Operationstechnik zur Transplantation von aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) gewonnenem Netzhautgewebe in den subretinalen Raum eines Großtiermodells vorgestellt.
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Methodenartikel
Subretinale Transplantation von menschlichem embryonalem Stammzellgewebe in einem katzenartigen Großtiermodell
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Degenerative (RD) Netzhauterkrankungen, die mit dem Verlust von Photorezeptoren einhergehen, wie z. B. altersbedingte Makuladegeneration (AMD), Retinitis pigmentosa (RP) und Leber-kongenitale Amaurose (LCA), verursachen einen fortschreitenden und schwächenden Sehverlust. Es besteht ein ungedeckter Bedarf an Therapien, die das Sehvermögen wiederherstellen können, wenn die Photorezeptoren verloren gegangen sind. Die Transplantation von aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) gewonnenem Netzhautgewebe (Organoiden) in den subretinalen Raum eines Auges mit fortgeschrittener RD bringt Netzhautgewebeblätter mit Tausenden von gesunden, mutationsfreien Photorezeptoren und hat das Potenzial, die meisten/alle Erblindungskrankheiten, die mit Photorezeptordegeneration verbunden sind, mit einem zugelassenen Protokoll zu behandeln. Die Transplantation von fetalem Netzhautgewebe in den subretinalen Raum von Tiermodellen und Menschen mit fortgeschrittener RD wurde erfolgreich entwickelt, kann aber aufgrund ethischer Bedenken und begrenzter Gewebeversorgung nicht als Routinetherapie eingesetzt werden. Tiermodelle für große, am Auge vererbte Netzhautdegeneration (IRD) sind wertvoll für die Entwicklung von Therapien zur Wiederherstellung des Sehvermögens, bei denen fortschrittliche chirurgische Ansätze zur Transplantation von Netzhautzellen/-gewebe in den subretinalen Raum verwendet werden. Die Ähnlichkeiten in der Größe des Bulbus und der Verteilung der Photorezeptoren (z. B. das Vorhandensein einer Makula-ähnlichen Region Area centralis) und die Verfügbarkeit von IRD-Modellen, die die menschliche IRD genau rekapitulieren, würden eine schnelle Translation einer vielversprechenden Therapie in die Klinik erleichtern. Hier wird eine chirurgische Technik zur Transplantation von hPSC-abgeleitetem Netzhautgewebe in den subretinalen Raum eines Großtiermodells vorgestellt, die es ermöglicht, diesen vielversprechenden Ansatz in Tiermodellen zu bewerten.
Einleitung
Millionen von Menschen auf der ganzen Welt sind von Netzhautdegeneration (RD) betroffen, was zu einer Sehbehinderung oder Blindheit führt, die mit dem Verlust der lichtempfindlichen Photorezeptoren (PRs) einhergeht. Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine der Hauptursachen für Erblindung, die auf eine Kombination aus genetischen Risikofaktoren und Umwelt-/Lebensstilfaktoren zurückzuführen ist. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass über 200 Gene und Loci vererbte RD (IRD) verursachen1. Retinitis pigmentosa (RP), die häufigste IRD, ist genetisch heterogen mit mehr als 3.000 genetischen Mutationen in etwa 70 Genen, die berichtet wur....
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Protokoll
Die Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung durchgeführt. Sie wurden auch vom Institutional Animal Care and Use Committee der Michigan State University genehmigt. In dieser Studie wurden Wildtyp- und CrxRdy/+ -Katzen aus einer Katzenkolonie verwendet, die an der Michigan State University gehalten wurde. Die Tiere wurden unter 12 h : 12 h Hell-Dunkel-Zyklen untergebracht und mit einer handelsüblichen Alleinfutter für Katzen gefüttert.
1. Präimplantationsverfahren und chirurgisch....
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Ergebnisse
Dieses Verfahren ermöglicht die erfolgreiche und reproduzierbare Implantation von hPSC-abgeleiteten Netzhautorganoiden in den subretinalen Raum eines Tiermodells mit großen Augen (hier demonstriert anhand von 2 Beispielen: Wildtyp-Katzen mit gesunden Photorezeptoren (PRs) und CrxRdy/+ -Katzen mit degenerierenden PRs und Netzhaut). Bereiten Sie die aus hPSC gewonnenen Netzhautorganoide mit den in Abbildung 1 angegebenen Schritten vor und laden Sie sie in die Boros.......
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Diskussion
Die Implantation von hPSC-abgeleitetem Netzhautgewebe (Netzhautorganoide) in den subretinalen Raum ist ein vielversprechender experimenteller Ansatz zur Wiederherstellung des Sehvermögens bei degenerativen Netzhauterkrankungen im Spätstadium, die durch den Tod von PR-Zellen (hochgradige oder terminale Blindheit) verursacht werden. Der vorgestellte Ansatz baut auf einer zuvor entwickelten und erfolgreich getesteten experimentellen Therapie auf, die auf der subretinalen Transplantation eines Stücks menschlichen fetalen Net.......
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Offenlegungen
Ratnesh K. Singh, Ph.D., François Binette, Ph.D., und Igor O. Nasonkin Ph.D. sind Mitarbeiter von Lineage Cell Therapeutics, Inc. Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde finanziert durch NEI Fast-Track SBIR Grant R44-EY027654-01A1 und SBIR Grant 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Dr. Petersen-Jones ist Co-PI). Die Autoren danken Frau Janice Querubin (MSU RATTS) für ihre Hilfe bei der Anästhesie und der allgemeinen Pflege der in dieser Studie eingeschlossenen Tiere sowie bei der chirurgischen Einstellung und der Vorbereitung/Sterilisation von Instrumenten. Die Autoren bedanken sich bei Dr. Paige Winkler für die Hilfe bei der Entgegennahme der Organoide und deren Platzierung in Medien am Tag vor der Implantation und für die Hilfe am Tag der Implantation. D....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,22 &Mikro; m porenförmiger Spritzenvorsatzfilter mit PES-Membran | Cameo | NA | ist bei verschiedenen Anbietern erhältlich |
| 23G subretinaler Injektor mit ausziehbarer 41 G Kanüle | DORC | 1270.EXT | |
| 250 µ L Hamilton gasdichte Luer-Lock-Spritze | Hamilton | NA | kann über verschiedene Lieferanten gefunden |
| werden 6-0 Seidennaht | Ethicon | 707G | |
| 6-0/7-0 Polyglactin | Naht Ethicon | J570G | |
| Acepromazinmaleat 500mg/5mL (Aceproject) | Henry Schein Animal Health | NA | kann über verschiedene Lieferanten gefunden werden |
| Buprenorphin 0,3 mg/mL | Par Pharmaceutical | NA | finden Sie über verschiedene Lieferanten: |
| cSLO + SD-OCT, | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+ OCT, | |
| Cyclosporin | Novartis | NA | finden Sie bei verschiedenen Lieferanten, |
| Dexamethason 2mg/mL (Azium) | Vetone | NA | finden Sie über verschiedene Lieferanten, |
| Doxycylin 25mg/5mL, | Cipla | NA | Erhältlich bei verschiedenen Anbietern |
| Fatal Plus Lösung (Pentobarbitallösung) | Vortech | NA | bei verschiedenen Anbietern |
| Gentamicin 20mg/2mL | Hospira | NA | bei verschiedenen Anbietern erhältlich |
| Glaskapillare (Dünnwandiger Einzylinder Standard Borosilikatglas (Schott Duran) Glasröhren | World Precision Instruments | TW150-4 | |
| Methylprednisolon Actetate 40 mg/mL | Pfizer | NA | finden Sie bei verschiedenen Anbietern |
| : Mikroskop | Zeiss | NA | |
| OCT Medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound) | Sakura | 4583 | |
| Olympic Vac-Pac Size 23 | Natus | NA | finden Sie bei verschiedenen Anbietern |
| Paraformaldehyd 16% Lösung | , EMS | 15719 | |
| Phenylephrinhydrochlorid 10% Ophthalmic Solution | Akorn | NA | kann über verschiedene Lieferanten gefunden |
| , Prednisolon 15mg/5mL, | Akorn | NA | kann über verschiedene Lieferanten gefunden |
| werden Propofol 500mg/50mL (10 mg/ml) (PropoFlo28) | Zoetis | NA | kann über verschiedene Lieferanten gefunden |
| RetCam II Videofunduskamera | Clarity Medical Systems | NA | erhalten Sie bei verschiedenen Lieferanten |
| Triamcinolon 400mg/10 mL (Kenalog-40) | Bristol -Myers Squibb Company | NA | bei verschiedenen Anbietern |
| Tropicamide 1% ophthalmologische Lösung | Akorn | NA | bei verschiedenen Anbietern |
| erhältlich Vitrektomie 23G Port | Alcon | Accurus Systeme | |
| Vitrektomiegerät | Alcon | Accurus Systeme | |
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Referenzen
- Veleri, S., et al. Biology and therapy of inherited retinal degenerative disease: insights from mouse models. Disease Models and Mechanisms. 8 (2), 109-129 (2015).
- Dias, M. F., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
