Methodenartikel

Isolierung proximaler Flüssigkeiten zur Untersuchung der Tumormikroumgebung des Pankreas-Adenokarzinoms

DOI:

10.3791/61687

⸱

5. November 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Section of Pancreatic Surgery, Humanitas Clinical and Research Center-IRCCS, 2Department of Immunology and Inflammation, Humanitas Clinical and Research Center-IRCCS, 3Department of Biomedical Sciences, Humanitas University, 4Giotto Biotech S.R.L., 5Section of Bioanalytical Chemistry, Division of Systems Medicine, Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Imperial College London, 6National Phenome Centre, Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Faculty of Medicine, Imperial College London, 7Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, University of Milan

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pankreassaft ist eine wertvolle Quelle von Biomarkern für menschlichen Bauchspeicheldrüsenkrebs. Wir beschreiben hier eine Methode für das intraoperative Sammelverfahren. Um die Herausforderung zu meistern, dieses Verfahren in Mausmodellen anzuwenden, schlagen wir eine alternative Probe, die interstitielle Tumorflüssigkeit, vor und beschreiben hier zwei Protokolle für ihre Isolierung.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) ist die vierthäufigste krebsbedingte Todesursache und wird bald die zweithäufigste werden. Es besteht ein dringender Bedarf an Variablen, die mit spezifischen Pankreaspathologien verbunden sind, um die präoperative Differentialdiagnose und die Patientenprofilierung zu unterstützen. Pankreassaft ist eine relativ unerforschte Körperflüssigkeit, die aufgrund ihrer Nähe zur Tumorstelle Veränderungen im umgebenden Gewebe widerspiegelt. Hier beschreiben wir ausführlich das intraoperative Sammelverfahren. Leider ist die Übersetzung der Pankreassaftsammlung in murine PDAC-Modelle, um mechanistische Studien durchzuführen, technisch sehr anspruchsvoll. Tumorinterstitielle Flüssigkeit (TIF) ist die extrazelluläre Flüssigkeit außerhalb von Blut und Plasma, die Tumor- und Stromazellen badet. Ähnlich wie Pankreassaft kann TIF aufgrund seiner Eigenschaft, Moleküle, die im Plasma verdünnt gefunden werden, zu sammeln und zu konzentrieren, als Indikator für mikroökologische Veränderungen und als wertvolle Quelle für krankheitsassoziierte Biomarker genutzt werden. Da TIF nicht leicht zugänglich ist, wurden verschiedene Techniken für seine Isolierung vorgeschlagen. Wir beschreiben hier zwei einfache und technisch anspruchslose Methoden zur Isolierung: Gewebezentrifugation und Gewebeelution.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) ist einer der aggressivsten Tumoren und wird bald die zweithäufigste Todesursachesein 1,2,3. Es ist bekannt für seine immunsuppressive Mikroumgebung und für seine Nichtreaktion auf Immuntherapieprotokolle4. Derzeit ist die chirurgische Resektion immer noch die einzige kurative Option für PDAC, aber es gibt eine hohe Häufigkeit von frühen Rückfällen und postoperativen Komplikationen. Das Fehlen spezifischer Symptome bis zu einem fortgeschrittenen Stadium ermöglicht keine frühzeitige Diagnose, was zur Pünktlichkeit der Krankheit beiträgt. Darüber hinaus kann die Überlappung der Symptome zwischen PDAC und anderen gutartigen Pankreaspathologien das Erreichen einer schnellen und zuverlässigen Diagnose mit den aktuellen Diagnosestrategien behindern. Die Identifizierung von Variablen, die mit spezifischen Pankreaspathologien assoziiert sind, könnte den chirurgischen Entscheidungsprozess erleichtern und die Erstellung von Patientenprofilen verbessern.

Vielversprechende Ergebnisse bei der Entdeckung von Biomarkern wurden mit leicht zugänglichen Körperflüssigkeiten wie Blut 5,6,7, Urin8, Speichel 9 und Pankreassaft10,11,12 erzielt. Viele Studien haben umfassende "Omics"-Ansätze wie genomische, proteomische und metabolomische Techniken genutzt, um Kandidatenmoleküle oder Signaturen zu identifizieren, die zwischen PDAC und anderen gutartigen Pankreaserkrankungen unterscheiden könnten. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Pankreassaft, eine relativ unerforschte Körperflüssigkeit, verwendet werden kann, um metabolische Signaturen von Patienten mit unterschiedlichen klinischen Profilen zu identifizieren12. Pankreassaft ist eine proteinreiche Flüssigkeit, die das Sekretom der Pankreasduktalzellen ansammelt und zum Hauptgang der Bauchspeicheldrüse und dann zum Hauptgallengang fließt. Aufgrund seiner Nähe zur Bauchspeicheldrüse könnte es stark von mikroumweltbedingten Störungen beeinflusst werden, die durch die Tumormasse induziert werden (Abbildung 1) und daher aussagekräftiger sind als Blut oder Urin oder gewebebasiertes Profiling. Mehrere Studien haben das Potenzial von Pankreassaft zur Identifizierung neuer Biomarker von Krankheiten mit verschiedenen Ansätzen untersucht, einschließlich zytologischer Analyse 13, proteomischer Analyse durch Massenspektrometrie 14,15, Bewertung genetischer und epigenetischer Marker wie K-ras- und p53-Mutationen 16,17, Veränderungen der DNA-Methylierung 18 und miRNAs 19 . Technisch gesehen kann Pankreassaft intraoperativ oder mit minimalinvasiven Verfahren wie endoskopischem Ultraschall, retrograder Cholangio-Pankreatographie oder durch endoskopische Entnahme von Zwölffingerdarmsaftsekretion20 gewonnen werden. Es ist noch nicht klar, inwieweit die Pankreassaftzusammensetzung durch die verwendete Sammeltechnik beeinflusst wird. Wir beschreiben hier das intraoperative Sammelverfahren und zeigen, dass Pankreassaft eine wertvolle Quelle für PDAC-Biomarker darstellen kann.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung der Pankreassaftsammlung. (A) Schematische Darstellung der Sekretion von Pankreassaft in den Pankreasgang und seiner Sammlung während der Operation. Der Einschub zeigt eine Nahaufnahme der Tumormikroumgebung: Pankreassaft sammelt Moleküle, die von Tumor- und Stromazellen in den Pankreasgängen freigesetzt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Sammlung von Pankreassaft in genetischen und orthotopen Mausmodellen von PDAC wäre in der Perspektive zu begrüßen, dieses Biofluid in präklinischen mechanistischen Studien zu nutzen; Dieses Verfahren kann jedoch technisch sehr anspruchsvoll sein und ist für einfachere Modelle wie subkutane Tumoren nicht realisierbar. Aus diesem Grund identifizierten wir Tumor-Interstitialflüssigkeit (TIF) als alternative Quelle zu Pankreassaft, da sie als Indikator für umgebende Störungen fungiert. Interstitielle Flüssigkeit (IF) ist die extrazelluläre Flüssigkeit, die sich außerhalb von Blut- und Lymphgefäßen befindet und Gewebezellen badet21. Die IF-Zusammensetzung wird sowohl durch die Durchblutung des Organs als auch durch die lokale Sekretion beeinflusst; Tatsächlich produzieren und sezernieren umgebende Zellen aktiv Proteine im IF21. Das Interstitium spiegelt mikroökologische Veränderungen des umgebenden Gewebes wider und könnte daher eine wertvolle Quelle für die Entdeckung von Biomarkern in verschiedenen pathologischen Kontexten wie Tumoren darstellen. Die hohe Konzentration lokal sezernierter Proteine in TIF kann verwendet werden, um Kandidatenmoleküle zu identifizieren, die als prognostische oder diagnostische Biomarker im Plasma22,23,24 getestet werden sollen. Mehrere Studien haben gezeigt, dass TIF eine geeignete Probe für proteomische Hochdurchsatzansätze ist, wie z. B. Massenspektrometrietechniken 23,24,25, sowie Multiplex-ELISA-Ansätze 26 und microRNA-Profiling 27.

Es wurden mehrere Ansätze für die Isolierung von IF in Tumoren vorgeschlagen, die grob kategorisiert werden können als in vivo (Kapillarultrafiltration 28,29,30,31 und Mikrodialyse 32,33,34,35) und ex vivo Methoden (Gewebezentrifugation 22,36,37,38 und Gewebeelution 39,40,41,42). Diese Techniken wurden ausführlich überprüft43,44. Bei der Wahl der geeigneten Methode sollten Aspekte wie die nachgelagerten Analysen und Anwendungen sowie das zurückgewonnene Volumen berücksichtigt werden. Wir haben diesen Ansatz kürzlich als Proof of Principle verwendet, um die unterschiedliche metabolische Aktivität von Tumoren aus zwei murinen Pankreas-Adenokarzinom-Zelllinienzu demonstrieren 12. Basierend auf Literatur 24,38 haben wir uns für die Verwendung der Low-Speed-Zentrifugationsmethode entschieden, um Zellbruch und Verdünnung durch intrazelluläre Inhalte zu vermeiden. Sowohl die Menge an Glukose als auch Laktat in TIF spiegelten die unterschiedlichen glykolytischen Eigenschaften der beiden verschiedenen Zelllinien wider. Hier beschreiben wir detailliert das Protokoll für die beiden am häufigsten verwendeten Methoden zur Isolierung von TIF: Gewebezentrifugation und Gewebeelution (Abbildung 2).

figure-introduction-2
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Methoden zur Isolierung der interstitiellen Tumorflüssigkeit. Schematische Darstellung der im Protokoll ausführlich beschriebenen Techniken, nämlich Gewebezentrifugation (A) und Gewebeelution (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Protokoll

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Für alle eingeschlossenen Patienten wurden peripheres Blut und Pankreassaft zum Zeitpunkt der Operation gemäß den vom Ethikausschuss der Institution genehmigten Protokollen entnommen. Alle Patienten wurden nach unterzeichneter Einverständniserklärung in die Studie aufgenommen, einschließlich der Sammlung biologischer Proben und klinischer Daten. Die Studie wurde von der Ethikkommission der Institution genehmigt (Protokollnummer ICH-595, Genehmigung erteilt im Mai 2009). Die Verfahren mit Mäusen und ihre Pflege entsprachen den EU- und institutionellen Richtlinien (Protokoll-ID 121/2016-PR).

1. Isolierung von Pankreassaft

HINWEIS: Der Entzug von Pankreassaft wird im Rahmen eines offenen Verfahrens der Pankreasresektion (z. B. Pankreatikoduodenektomie, totale Pankreatektomie, distale Pankreatektomie) von einer Equipe von erfahrenen Pankreaschirurgen durchgeführt.

  1. Patientenauswahl
    1. Betrachten Sie für das Verfahren jeden Patienten, der für eine offene Pankreasresektion geplant ist.
    2. Bestätigen Sie den Einschluss, wenn die Größe des Hauptpankreasgangs als ausreichend erachtet wird, um die Entnahme von Pankreassaft zu ermöglichen. Die minimale Grenze im Durchmesser des Hauptpankreasgangs beträgt 2 mm bei kontrastmittelverstärkter CT-Bildgebung.
  2. Präoperative Untersuchung des Pankreasgangs bei kontrastverstärkter CT-Bildgebung zur Unterstützung der Planung der Pankreassaftgewinnung
    1. Dreidimensionale Lokalisierung des Hauptpankreasgangs innerhalb der Drüse auf Höhe des Pankreashalses: Messen Sie den Abstand des Hauptpankreasgangs vom vorderen, oberen und unteren Pankreasrand auf Querschnittsobjektträgern und koronalen und sagittalen Renderings. Sobald Sie im Operationssaal sind, verwenden Sie diese Messungen, um den richtigen Ort anzunähern, an dem die Bauchspeicheldrüse punktiert werden muss, um den Wirsung-Gang zu kanülieren und Pankreassaft zu entnehmen.
  3. Vorbereitung des Materials
    1. Steriles Material: Öffnen Sie den sterilen Umschlag einer 25-G-Nadel und einer 3-ml-Spritze und positionieren Sie sie in Zusammenarbeit mit der Peeling-Schwester im sterilen Feld.
    2. Unsteriles Material: Halten Sie im Operationssaal ein 3 mL K2EDTA-Vakuumreagenzglas zur Aufbewahrung der Flüssigkeit bereit.
  4. Vorbereitung des Patienten
    1. Positionieren Sie den Patienten auf dem Operationssaalbett. Induzieren Sie eine gemischte Vollnarkose mit Remifentanil, Sevorane und Rocuronium, intubieren Sie dann und beginnen Sie mit der Beatmung des Patienten. Positionieren Sie den Patienten in Rückenlage, wobei der rechte Arm am Körper befestigt ist und der linke Arm auf einem Armbrett um 90° Grad abgeführt wird.
    2. Desinfizieren Sie die Haut des Bauches an der Stelle des Einschnitts. Erstellen und pflegen Sie ein steriles Feld auf dem Bauch, das den Patienten drapiert.
  5. Chirurgischer Eingriff
    1. Führen Sie einen Subkostalschnitt durch und erhalten Sie Zugang zur Bauchhöhle. Positionieren Sie eine Rochard Bauchretraktion für Organexposition.
    2. Freilegen und mobilisieren Sie die Bauchspeicheldrüse durch Kocher-Manöver, Öffnung des gastrokolischen Bandes, Inzision des retroperitonealen Gewebes entlang der oberen und unteren Grenze der Bauchspeicheldrüse, wodurch eine Dissektionsebene zwischen Pankreashals und Vena mesenterica superior nach hinten entsteht.
    3. Sobald die Bauchspeicheldrüse mobilisiert und freigelegt ist, fahren Sie mit dem Pankreassaftentzug fort, bevor Sie den Pankreashals schneiden.
  6. Identifizierung und Lokalisation des Pankreasgangs
    1. Schätzen Sie die Position des Pankreasgangs anhand der Messung, die bei der Bildgebung durchgeführt wurde, und tasten Sie dann die vordere Oberfläche der Bauchspeicheldrüse ab, um ihre genaue Position zu identifizieren.
  7. Sammlung von Pankreassaft
    1. Halten Sie den Pankreaskopf und den Zwölffingerdarm von unten und heben Sie ihn mit der linken Hand an, wobei Sie die Position des Pankreasgangs mit der ersten Ziffer markieren.
    2. Greifen Sie mit der rechten Hand der 3-ml-Spritze mit aufgesetzter 25-G-Nadel.
    3. Verwenden Sie die rechte Hand, um die Nadel in die Bauchspeicheldrüse einzuführen, die nur distal zum linken Daumen führt. Bestimmen Sie die Eindringtiefe und den Grad der Neigung der Nadel basierend auf präoperativen Messungen und der Wahrnehmung, in die Kanalwand eingedrungen zu sein.
    4. Ziehen Sie den Saft mit der Spritze heraus. Wenn es nicht möglich ist, den Saft zu erhalten, verschieben Sie die Nadel in die vier Richtungen, um den Pankreasgang zu kanülieren.
    5. Sobald der Pankreassaft entnommen ist, bewegen Sie ihn außerhalb des sterilen Feldes und übertragen Sie ihn in das 3 ml K2EDTA-Vakuumreagenzglas. Bei 4 °C aufbewahren, bis die Probe ins Labor überführt wird, und so früh wie möglich mit der weiteren Verarbeitung fortfahren.
      HINWEIS: Das Volumen des Pankreassaftes, der mit diesem Verfahren gewonnen werden kann, variiert stark und reicht unserer Erfahrung nach etwa von 0,2 ml bis 3 ml. Die gewonnene Saftmenge hängt stark vom Patienten ab: der Dimension des Wirsung-Kanals und dem Funktionsstatus der Bauchspeicheldrüse (Funktion versus atrophische Drüse). Nach unserer Erfahrung gibt es kein Hilfsmittel, das verwendet werden kann, um die Menge an Pankreassaft zu erhöhen.

2. Verarbeitung von Pankreassaft

  1. Pankreassaft bei 400 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren, um Zellen oder Ablagerungen zu entfernen.
    HINWEIS: Pankreassaft sollte vor der Zentrifugation klar und transparent sein. Blutkontamination während der Operation kann manchmal auftreten, wodurch die Probe trüber und röter erscheint. Erwägen Sie, solche Proben von weiteren Analysen auszuschließen.
  2. Überstand zurückgewinnen, aliquot und bis zur weiteren Analyse bei -80 °C lagern.

3. Induktion subkutaner Tumoren

HINWEIS: Die murinen Zelllinien Panc02 und DT6606 wurden von Prof. Lorenzo Piemonti (San Raffaele Diabetes Institute, Mailand, Italien) bzw. Prof. Francesco Novelli (Center for Experimental Research and Medical Studies, Turin, Italien) erhalten, wie zuvor beschrieben12.

  1. Wachstum von Tumorzellen
    1. Kultur Panc02 und DT6606 Zellen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 2mM L-Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin-Antibiotikum.
    2. Tauen Sie gefrorene Zellen 1-2 Wochen vor der Tumorinjektion entsprechend der Wachstumsrate der Zelllinie auf.
    3. Zellen bei 37 °C mit 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit unter sterilen Bedingungen züchten.
    4. Zellen mit 0,025% Trypsin/EDTA-Lösung für 5 min bei 37 °C ablösen, wenn sie 80% Konfluenz erreichen und Trypsin durch Zentrifugation eliminieren.
      HINWEIS: DT6606 sind primäre, nicht immortalisierte Zellen, die von der LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre-Maus abgeleitet sind und nicht mehr als 3 Mal vor der Injektion in vivo durchlaufen werden sollten, um ihre ursprünglichen Eigenschaften zu erhalten. Es wird empfohlen, DT6606-Zellen 7-10 Tage vor der Injektion aufzutauen.
  2. Injektion von Tumorzellen in vivo
    1. Trypsinisieren Sie die Zellen (siehe Schritt 3.1.4) und waschen Sie sie einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Eliminieren Sie PBS durch Zentrifugation und resuspendieren Sie Zellen in frischem PBS vor dem Zählen.
    2. Zählen Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in PBS in einer Konzentration von 0,5-1 x 107 Zellen/ml, um eine Endkonzentration von 0,5-1 x 106 Zellen/100 μL zu injizieren. Bereiten Sie die Zellen im Überschuss vor. Halten Sie die Zellen bis zum Ende des Eingriffs bei 4 °C oder auf Eis.
    3. Gruppieren Sie die Tiere (8 Wochen alte weibliche C57BL / 6J-Mäuse) in verschiedenen Käfigen nach verschiedenen Zelllinien oder Behandlungen.
    4. Halten Sie die Tiere manuell zurück und betäuben Sie sie mit einer Mischung aus Ketamin (80 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) oder nach lokal zugelassenen Verfahren.
    5. Rasieren Sie die Injektionsstelle, normalerweise eine Flanke über einem Bein, mit einem Elektrorasierer und reinigen Sie die Injektionsstelle sorgfältig mit Alkohol.
    6. Pipettieren Sie die Zellsuspension mit einer 1-ml-Spritze auf und ab und entfernen Sie Luftblasen, indem Sie den Kolben auf und ab bewegen. Befestigen Sie eine 25 G Nadel an der Spritze und drücken Sie den Kolben nach oben, bis die Zellsuspension die Nadelöffnung erreicht.
    7. Drücken Sie die Haut der Flanke mit einer flachen Pinzette zusammen und führen Sie die Nadel vorsichtig an der Basis der Hautfalte zwischen die Pinzette ein, ohne die Peritonealhöhle oder die Muskulatur zu punktieren. Um die korrekte Position der Nadel zu überprüfen, versuchen Sie vorsichtig, die Nadelspitze seitlich unter die Haut zu bewegen. Die Nadel sollte sich frei bewegen.
    8. Injizieren Sie langsam 100 μL Zellsuspension (mit 0,5-1 x 106 Zellen), klemmen Sie die Injektionsstelle vorsichtig für einige Sekunden und ziehen Sie die Nadel langsam ohne seitliche Bewegung zurück.
    9. Bringen Sie die Maus zurück in ihren Käfig und überwachen Sie die Erholung von der Narkose.
    10. Überprüfen Sie das Tumorwachstum mit einem Messschieber für 3-4 Wochen. Euthanasieren Sie die Tiere, wenn Tumore etwa 0,5-1 cm3 erreichen, mit CO2 oder nach lokal zugelassenen Verfahren.

4. Isolierung von Tumor-Interstitialflüssigkeit (TIF)

  1. Exzision von subkutanen Tumoren
    1. Blockieren Sie die Gliedmaßen der Tiere mit Klebeband und reinigen Sie die Haut mit Alkohol. Schneiden Sie die Haut am Bauch auf, um sie vom Peritoneum zu trennen und bis zu den Gliedmaßen zu gehen. Entfernen Sie den Tumor, der unter der Haut der Flanke gewachsen ist, mit Hilfe von Scheren, Klemmen und schließlich einem Skalpell.
    2. Wiegen Sie den Tumor und bewahren Sie ihn bis zur Isolierung von TIF in einem sauberen Röhrchen auf Eis auf.
  2. Isolierung von TIF durch Zentrifugation
    1. Schneiden Sie den Tumor in zwei Hälften, spülen Sie die beiden Teile schnell in PBS und tupfen Sie sie vorsichtig auf Filterpapier, um überschüssiges PBS zu entfernen. Führen Sie diese Schritte so schnell wie möglich durch, um eine Verdunstung aus dem Tumor zu vermeiden.
    2. Übertragen Sie den Tumor sofort in ein 20 μm Nylonzellsieb, das auf einem 50 ml konischen Röhrchen befestigt ist.
    3. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 x g für 10 min bei 4 °C.
      HINWEIS: Diese Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit bewahrt die Zellintegrität und vermeidet eine Kontamination von TIF durch intrazelluläre Kompartimente. Intrazelluläre Inhaltsverluste können in nachgeschalteten Anwendungen getestet werden, indem beispielsweise das Vorhandensein von intrazellulären Housekeeping-Proteinen wie ribosomalen Proteinen bewertetwird 25.
    4. Gewinnen Sie das TIF vom Boden des Röhrchens, aliquotieren Sie es schließlich und frieren Sie es sofort auf Trockeneis ein und lagern Sie es bis zur weiteren Analyse bei -80 °C.
      Optional: Basierend auf der durchzuführenden nachgeschalteten proteomischen Analyse die Probe in PBS mit einem Proteaseinhibitor-Cocktail verdünnen, um den Abbau bestimmter Moleküle zu vermeiden.
      HINWEIS: Je nach Zusammensetzung des Tumors geben sehr kleine Tumoren in einigen Fällen keine Flüssigkeit ab.
  3. Isolierung von TIF durch Elution
    1. Schneiden Sie den Tumor mit einer Schere oder einem Skalpell in kleine Stücke (≈1-3 mm3) und spülen Sie ihn vorsichtig mit kaltem PBS ab.
      HINWEIS: In diesem Schritt ist es sehr wichtig, schnell zu arbeiten und minimale Manipulationen durchzuführen, um Zellschäden zu vermeiden.
    2. Die Tumorstücke werden in ein 1,5-ml-Röhrchen überführt und 500 μL PBS mit einem Proteaseinhibitor-Cocktail hinzugefügt, um den Abbau von Analyten zu vermeiden. 1 Stunde bei 37 °C und 5%CO2 inkubieren.
    3. Gewinnen Sie den Überstand zurück und übertragen Sie ihn in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei 1.000 x g für 5 min bei 4 °C, um Zellen aus der Probe zu entfernen.
    4. Der Überstand wird in ein neues Röhrchen überführt und erneut bei 2.000 x g für 8 min bei 4 °C zentrifugiert.
    5. Der Überstand wird in ein neues Röhrchen überführt und erneut bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert, um eventuelle Ablagerungen zu entfernen. Stellen Sie den Überstand wieder her. Die TIF-Probe wird sofort aliquot und auf Trockeneis eingefroren und bis zur weiteren Analyse bei -80 °C gelagert.

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Ergebnisse

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Wir folgten dem oben beschriebenen Verfahren, um Pankreassaft von Patienten mit PDAC (n = 31) und anderen gutartigen Pankreaserkrankungen (nicht-PDAC, n = 9) zu erhalten, einschließlich Pankreatitis (n = 2), papillären Ampullentumoren (n = 4), neuroendokrinen Tumoren (n = 2), intraduktalen papillären muzinösen Neoplasien (IPMN; n = 1) 12. Die Pankreassaftproben wurden dann einer metabolomischen Analyse mittels Kernspinresonanz (1H-NMR)12 unterzogen. ...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Studie haben wir die Technik zur intraoperativen Entnahme von Pankreassaft beschrieben, eine weitgehend unerforschte Flüssigkeitsbiopsie. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Pankreassaft als Quelle für metabolische Marker der Krankheit genutzt werden kann12. Die metabolomische Analyse anderer Flüssigbiopsien wie Blut 5,6,7, Urin8 und Speichel9 hat vielversprechende Ergebniss...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Roberta Migliore für die technische Unterstützung. Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen geführt hat, wurde von der Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) im Rahmen des Projekts IG2016-ID.18443 – P.I. Marchesi Federica – finanziert. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL SpritzeBD Biosciences309659
1,5 mL Eppendorf TubeGreiner BioOneGR616201
20 & micro; m Nylon-ZellsiebpluriSelect43-50020-03
25G NadelBD Biosciences305122
3 mL K2EDTA VacutainerBD Biosciences366473
3 mL SpritzeBD Biosciences309656
50 mL Falcon TubeCorning352098
KlemmenMedicon06.20.12
Einweg-SkalpellMedicom9000-10
Fötales RinderserumMicrotechMG10432
FlachpinzetteMedicon06.00.10
Penicillin-StreptomycinLonzaECB3001D
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Sigma-AldrichD8537
Proteasehemmer-CocktailRoche
RPMI mediumEurocloneECB9006L
SchereMedicon02.04.09
Trypsin/EDTA 1xLonzaBE17-161F
Ultraglutamin 100xLonzaBE17-605E/U1
34044100

Referenzen

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