Wir präsentieren eine einfache Methode, um hochlebensfähige Fettvorläuferzellen von mausepididymalen Fettpolstern mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung zu isolieren.
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Methodenartikel
Herstellung von Adipose-Progenitorzellen aus Maus-Epididymal-Adipose-Geweben
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Adipositas und Stoffwechselstörungen wie Diabetes, Herzerkrankungen und Krebs sind alle mit einer dramatischen Umgestaltung des Fettgewebes verbunden. Geweberesidente Fettvorläuferzellen (APCs) spielen eine Schlüsselrolle bei der Adipinengewebehomöostase und können zur Gewebepathologie beitragen. Der zunehmende Einsatz von Einzelzellanalysetechnologien – einschließlich einzelliger RNA-Sequenzierung und einzelliger Proteomik – transformiert das Stamm-/Vorläuferzellfeld, indem es eine beispiellose Auflösung einzelner Zellexpressionsänderungen im Kontext populations- oder gewebeweiter Veränderungen ermöglicht. In diesem Artikel stellen wir detaillierte Protokolle zur Sezieren von Mausepididymalfettgewebe bereit, isolieren einzelne Fettgewebe-abgeleitete Zellen und führen fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) durch, um für lebensfähige Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs anzureichern. Diese Protokolle ermöglichen es den Forschern, hochwertige APCs vorzubereiten, die für nachgelagerte Analysen wie die sequenziumierende RNA-Sequenzierung einzelner Zellen geeignet sind.
Einleitung
Adipose-Gewebe spielt eine Schlüsselrolle im Energiestoffwechsel. Überschüssige Energie wird in Form von Lipiden gespeichert, und Fettgewebe ist in der Lage, signifikante Expansion oder Rückzug je nach Ernährungszustand und energetischen Bedarf. Die Ausweitung des Fettgewebes kann aus einer Erhöhung der Adipozytengröße (Hypertrophie) und/oder aus einer Erhöhung der Adipozytenzahl (Hyperplasie) resultieren; letzteres Verfahren streng reguliert durch Proliferation und Differenzierung der Fettvorläuferzellen1,2. Während der Fettleibigkeit, Fettgewebe übermäßig erweitert, und Gewebedysfunktion – einschließlich Hypoxie, Entzündung, und Insulinresistenz – entwickelt oft3,4. Diese Komplikationen sind Risikofaktoren für viele chronische Krankheiten wie Bluthochdruck, Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Schlaganfall und Krebs5. Daher sind die Begrenzung der unkontrollierten Fettgewebeexpansion und die Milderung von Fettgewebepathologien oberste biomedizinische Forschungsprioritäten. Während der Fettgewebeexpansion vermehren sich die aus dem Fettgewebe abgeleiteten Stammzellen (ASCs) und differenzieren sich sequenziell in Präsipozyten (verpflichtete Vorläuferzellen) und dann in reife Adipozyten6. Jüngste einzellige RNA-Sequenzierungsstudien (scRNA-seq) zeigen, dass diese Adipose-Vorläuferzellpopulationen (APC) (ASCs und Preadipozyten) eine erhebliche molekulare und funktionelle Heterogenität7,8,9,10,11,12aufweisen. AsCs weisen beispielsweise eine reduzierte adipogene Differenzierungskapazität auf und weisen im Vergleich zu Denreadipozyten7auch höhere Proliferations- und Erweiterungsfähigkeiten auf. Weitere molekulare Unterschiede werden innerhalb der ASC- und Präsipozytenpopulationen berichtet, obwohl die funktionelle Relevanz dieser Unterschiede unklar bleibt7. Zusammen unterstreichen diese Daten die Komplexität des Fettvorläuferzellpools und unterstreichen die Notwendigkeit, Tools zu entwickeln und zu standardisieren, um diese kritischen Zellpopulationen besser zu verstehen und zu manipulieren.
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von hochlebensfähigen Sca1+ Fettvorläuferzellpopulationen von mausepididymalen Fettpolstern, die für empfindliche nachgeschaltete Analysen geeignet sind, einschließlich einzelliger Studien (ScRNA-Sequenzierung) und Zellkultur. Die Isolierung und Dissoziation von epididymalen Fettpolstern wurde wie zuvor beschrieben7,13 mit leichten Modifikationen durchgeführt, die die Lebensfähigkeit isolierter APCs verbessern. Kurz gesagt, dissoziierte Zellen von epididymalen Fettpolstern werden mit Antikörpern gegen Sca1, einem Marker für ASCs und Prereadipocyten6,7, und andere Lineage (Lin) Marker: Ter119 (Erythroid-Zellen), CD31 (Endothelzellen) und CD45 (Leukozyten) gefärbt. Viable Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- Zellen werden dann nach fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) sortiert. Wichtig ist, dass dieses Protokoll durch erfolgreiche Isolierung und Analyse lebensfähiger Sca1+/Lin- Fettvorläuferzellen validiert wurde, die in einer kürzlich durchgeführten einzelzelligen RNA-Sequenzierungsstudie berichtet wurden, die funktionell heterogene Subpopulationen innerhalb von ASCs und Preadipozyten7identifizierte.
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Protokoll
Alle tierexperimentellen Verfahren wurden unter Genehmigung des Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee durchgeführt.
1. Lösungsvorbereitung
- Bereiten Sie Kollagenase 2% (w/v) Lösung durch Auflösen von Kollagenase II 2 g in 100 ml Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS). Aliquot 200 l für jede Verwendung.
- Vorbereiten Sie neutralisationsmedium durch Mischen von 84 ml F-12 medium, 15 ml Pferdeserum und 1 ml Penicillin/Streptomycin.
- Vorbereiten Sie den Puffer für die Durchflusszytometrie, indem Sie 500 mg Rinderserumalbumin (BSA) und 400 l 0,5 M EDTA in 100 ml Phosphat-gepufferter Kochchen (DPBS) von Dulbecco auflösen.
2. Dissektion des epididymalen Fettpolsters und der Gewebedissoziation
- Humane euthanize (Isoflurane/zervikale Dislokation) eine männliche Maus. In diesem Protokoll wurde eine vier Monate alte FVB-Maus verwendet.
- 70% Ethanol auf den Bauch auftragen/sprühen und die untere Bauchhöhle mit sauberer Schere und Zange aussetzen.
- Suchen Sie epididymales Fettpolster (proximal/an Hoden befestigt). Halten Sie die Kreuzung zwischen Hoden und epididymale Fettpad mit stumpfer Zange und ziehen Sie sanft, um das epididymale Fettpolster zu befreien.
- Entfernen Sie die Tests durch Schneiden mit einer Schere und inkubieren epididymalen Fettpolster in 5 ml HBSS ergänzt mit 3% BSA in einem 50 ml konischen Rohr bei Raumtemperatur für 15 min.
- Zentrifuge bei 150 x g für 7 min bei 4 °C.
- Nehmen Sie das schwimmende epididymale Fettpolster aus dem 50 ml konischen Rohr und zerkleinern Sie das Gewebe mit einer sauberen Schere.
- Fügen Sie 200 l Kollagennase 2% Lösung in 3,8 ml HBSS in einem 13 ml Kulturrohr hinzu. Das gehackte Gewebe hinzufügen und in einem rotierenden Inkubator bei 5 Umdrehungen pro Minute für 1 h bei 37 °C brüten. Anstelle eines rotierenden Inkubators kann der Zellkultur-Inkubator bei 37 °C alternativ mit gelegentlichen Rührungen verwendet werden.
- Den gesamten Inhalt in ein 50 ml konisches Rohr übertragen und 10 ml Neutralisationsmedium hinzufügen. Mischen Sie sanft, indem Sie das Rohr 2-3 mal invertieren.
- Bereiten Sie ein weiteres 50 ml konisches Rohr vor, das mit einem 70 m Zellsieb ausgestattet ist. Filtern Sie das verdaute Gewebe mit dem Zellsieb in das neue Rohr.
- Übertragen Sie den Durchfluss in ein 15 ml kegelförmiges Rohr und zentrifugieren bei 350 x g für 10 min bei 4 °C.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und setzen Sie Zellpellets mit 5 ml DPBS wieder auf. Zentrifuge bei 350 x g für 10 min bei 4 °C.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und fügen Sie 50 L Durchflusszytometriepuffer hinzu. Gut mischen, indem Sie sanft pfeifen und Zellen auf Eis halten. Aufgrund des Volumens der Zellpellets und der geringen Menge an Restüberstand wird das Gesamtvolumen der Zellen im Durchflusszytometriepuffer größer als 50 l (ca. 100 l) sein.
3. Antikörperkennzeichnung und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)
- Nach dem Mischen der Zellen gut mit sanfter Pipettierung 54 l der Zellsuspension in ein 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen. Fügen Sie 6 l FcR blockierendes Reagenz hinzu und mischen Sie sie gut, indem Sie sanft pipetieren. Bei 4 °C für 10 min inkubieren. Speichern Sie alle übrig gebliebenen Zellen nach der Einnahme von 54 l und halten Sie sie im Eis, um sie als unbefleckte Kontrolle in Schritt 3.5 und Schritt 3.6 zu verwenden.
- Bereiten Sie während der Inkubation in Schritt 3.1 einen Antikörpercocktail zu, indem Sie jeweils 11 L Anti-Sca1-APC, Anti-Ter119-FITC, Anti-CD31-FITC und Anti-CD45-FITC-Antikörper in einem Mikrozentrifugenrohr kombinieren. Durch sanftes Pipettieren gut mischen und auf Eis vor Licht geschützt halten.
- Nach der Inkubation mit FcR-Blockierreagenz für 10 min, fügen Sie 40 l des Antikörper-Cocktails hinzu und mischen Sie gut durch sanfte Pipetten. Bei 4 °C für 10 min inkubieren.
- Fügen Sie den gebeizten Zellen 500 l Durchflusszytometriepuffer hinzu, der durch 1 g/ml DAPI ergänzt wird. Mischen Sie gut durch sanfte Pipettier- und Filterzellen mit einem 5 ml Reagenzglas mit Zellsieb-Snap-Cap. Halten Sie Zellen auf Eis.
- Fügen Sie den verbleibenden Zellen in Schritt 3.1 500 l Durchflusszytometriepuffer hinzu und mischen Sie sie gut durch sanfte Pipettierung. Filtern Sie Zellen mit einem 5 ml Reagenzglas mit Zellsieb-Snap-Cap. Halten Sie diese Zellen auf Eis und verwenden Sie als unbefleckte Kontrolle im folgenden Schritt.
- Nehmen Sie die gefärbten Zellen und die ungefärbte Kontrolle zum FACS-Analyse- oder Sortierinstrument.
- Identifizieren und isolieren Sie die APC+/FITC-/DAPI- Grundgesamtheit mit Gating-Strategien, die in Abbildung 1dargestellt sind. Diese Zellen stellen lebensfähige Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45- Zellen dar. Trümmer und Zellaggregate werden mit Vorwärts- (FSC) und Side Scatter (SSC)-Plots aufgebraucht. Dann wird DAPI- Population abgegrenzt, gefolgt von gating von APC+/FITC- Population. Ungefärbte Kontrollen sollten verwendet werden, um bei der Festlegung von Gating-Parametern zu helfen.
- Sammeln Sie die Zellen in 500 l Durchflusszytometriepuffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. In Zukunft sollten alle Verfahren unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, um eine Kontamination zu minimieren. Etwa 50.000 – 100.000 Zellen werden aus einer Maus gesammelt.
- Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer, um die Zelllebensfähigkeit zu bewerten. Da Zellaggregate weitere nachgelagerte Analysen stören können, wird auch das Vorhandensein von Zellaggregaten bewertet, um eine minimale Präsenz (<5% der lebensfähigen Zellzahl) dieser Aggregate zu gewährleisten.
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Ergebnisse
In diesem Experiment wurden vier Monate alte männliche FVB-Mäuse verwendet. Nach dem Ausschluss von Schutt und Doublets mit FSC/SSC-Plots wurden lebensfähige Zellen (DAPI- Population) abgezäut, gefolgt von der Auswahl von APC+/FITC- Population (Abbildung 1). DAPI-, APC- und FITC-Gates wurden basierend auf der ungefärbten Steuerung gezeichnet. Gating-Strategien sind in Abbildung 1dargestellt.
Nach 1 h S...
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Diskussion
Die Sequenzierung der einzelnen Zell-RNA (scRNA-seq) gewinnt schnell an Zugkraft als leistungsstarkes Werkzeug, um gleichzeitig verschiedene Zellpopulationen auf Einzelzellebene zu untersuchen. Aufgrund der hohen Kosten im Zusammenhang mit der Probenvorbereitung und der Sequenzierung des hohen Durchsatzes ist es unerlässlich, die zellulären Eingänge (hohe Lebensfähigkeit und Reinheit) zu optimieren, um die Wahrscheinlichkeit eines experimentellen Erfolgs zu erhöhen. Einige Zellvorbereitungsprotokolle beruhen auf der Entf...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Wir würdigen die Mayo Clinic Microscopy Cell Analysis Core Flow Cytometry Facility für Unterstützung bei der FACS-Sortierung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL Kulturröhrchen | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL konisches Röhrchen | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL Reagenzglas mit Zellsieb Schnappverschluss | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL konisches Röhrchen | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 & Mikro; m-Zell-Sieb | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC Antikörper | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC Antikörper | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC Antikörper | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC Antikörper | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnologie | A-420-500 | |
| Kollagenase Typ II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR-Blockierungsreagenz | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Pferdeserum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidiumiodidlösung | Miltenyi Biotec | Tel.: 130-093-233 |
Referenzen
- Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
- Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).
- Halberg, N., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue. Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).
- Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. Obesity as a Disease. Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).
- Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).
- Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling. Life Science Alliance. 2, 201900561(2019).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. eLife. 7, 39636(2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364, 2501(2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559, 103-108 (2018).
- Raajendiran, A., et al. Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues. Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).
- De Matteis, R., et al. In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells. Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).
- Hanamsagar, R., et al. An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples. Scientific Reports. 10, 2219(2020).
- Marinovic, M. P., et al. Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice. Scientific Reports. 8, 5057(2018).
- Takahashi, H., et al. Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair. Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).
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