Akute Maus Gehirn Schneiden, um spontane Hippocampal-Netzwerk-Aktivität zu untersuchen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von horizontalen Hippocampus-entorhinalen Kortex-Scheiben (HEC) von Mäusen, die eine spontane scharfe Wellenwelligkeit saufen. Slices werden in einer vereinfachten Grenzraum-Haltekammer inkubiert und Aufnahmen werden unter getauchten Bedingungen mit schnell fließender künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit durchgeführt, um die Sauerstoffversorgung des Gewebes und die spontane Entstehung von Netzwerkaktivität zu fördern.

Zusammenfassung

Akutes Nagetier-Gehirnschneiden bietet einen belastbaren experimentellen Ansatz, um Einblicke in die Organisation und Funktion neuronaler Schaltkreise mit einzelliger Auflösung mittels Elektrophysiologie, Mikroskopie und Pharmakologie zu gewinnen. Ein wichtiger Aspekt bei der Gestaltung von In-vitro-Experimenten ist jedoch das Ausmaß, in dem verschiedene Scheibenpräparate naturalistische Muster der neuronalen Aktivität rekapitulieren, wie sie in vivo beobachtet werden. Im intakten Gehirn erzeugt das Hippocampus-Netzwerk eine hochsynchronisierte Populationsaktivität, die den Verhaltenszustand des Tieres reflektiert, wie die scharfwelligen Wellenkomplexe (SWRs) am Beispiel der scharfwelligen Wellenkomplexe (SWRs) am Beispiel des Aufwachens oder des Nicht-REM-Schlafs. SWRs und andere Formen der Netzwerkaktivität können unter geeigneten Bedingungen spontan in isolierten Hippocampusscheiben entstehen. Um das leistungsstarke Gehirn-Slice-Toolkit auf die Untersuchung der Hippocampus-Netzwerkaktivität anzuwenden, ist es notwendig, einen Ansatz zu nutzen, der die Gewebegesundheit und die Erhaltung der funktionellen Konnektivität innerhalb des Hippocampus-Netzwerks optimiert. Mäuse werden transkardial mit kalter, auf Saccharose basierender künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit durchlässig. Horizontale Scheiben, die den Hippocampus enthalten, werden mit einer Dicke von 450 m geschnitten, um die synaptische Konnektivität zu erhalten. Slices werden in einer Kammer im Interface-Stil wiederhergestellt und für Aufnahmen in eine untergetauchte Kammer übertragen. Die Aufnahmekammer ist für die doppelte Oberflächensuperfusion von künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit bei hoher Durchflussrate ausgelegt, um die Sauerstoffversorgung der Scheibe zu verbessern. Dieses Protokoll liefert gesundes Gewebe, das für die Untersuchung komplexer und spontaner Netzwerkaktivitäten in vitrogeeignet ist.

Einleitung

Die elektrophysiologische Messung von lebenden Hippocampusscheiben in vitro ist ein kraftvoller experimenteller Ansatz mit zahlreichen Vorteilen. Der Experimentator kann ein Mikroskop, Mikromanipulatoren und ein Aufzeichnungssystem verwenden, um Messungen von einzelnen Neuronen im Gewebe direkt zu visualisieren und zu sammeln. Gewebescheiben sind auch sehr zugänglich für Photostimulation oder Arzneimittelabgabe für optogenetische, chemogenetische oder pharmakologische Experimente.

Das Hippocampus-Netzwerk erzeugt eine hochsynchrone Populationsaktivität in vivo, sichtbar als Schwingungen im extrazellulären lokalen Feldpoten....

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Columbia University (AC-AAAU9451) genehmigt.

1. Vorbereiten von Lösungen

1. Herstellung der Saccharoseschneidlösung zum Schneiden, wie in Tabelle 1beschrieben.
   HINWEIS: Nach der Zubereitung von 1 L Saccharoselösung eine kleine Menge (ca. 100–200 ml) in einer Eisschale einfrieren. Diese gefrorenen Saccharosewürfel werden zu einer eisigen Gülle vermischt (siehe Schritt 4.3).
2. Bereiten Sie künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) für die Aufzeichnung vor, wie in Tabelle 2beschrieben....

Ergebnisse

Hier werden repräsentative Aufnahmen von HEC-Slices präsentiert, die wie in diesem Protokoll beschrieben vorbereitet werden. Nach der Wiederherstellung in einer Schnittstellenhaltekammer (Abbildung 1C) werden die Scheiben einzeln in eine untergetauchte Aufnahmekammer übertragen (Abbildung 2B). Die Aufnahmekammer wird mit autobogengesättigtem ACSF mit einer peristaltischen Pumpe geliefert (Abbildung 2A). Die Pumpe zieht ACSF zunächst.......

Diskussion

Es gibt mehrere Schritte in diesem Schneideprotokoll entwickelt, um die Gesundheit des Gewebes zu fördern und die Entstehung von spontanen naturalistischen Netzwerkaktivität zu fördern: die Maus ist transkardial durchlässig mit gekühlten Saccharose Schneiden Lösung; horizontal-entorhinale Kortex-Scheiben (HEC) werden mit einer Dicke von 450 m aus dem mittleren oder ventralen Hippocampus geschnitten; Scheiben erholen sich an der Schnittstelle von erwärmter ACSF und befeuchteter, autobogenreicher Luft; Während der Aufnahme.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3D-Drucker	Lulzbot	LulzBot TAZ 6
Inkubationshalter für akute Hirnscheiben	NIH 3D Print Exchange	3DPX-001623	Entworfen von ChiaMing Lee, erhältlich bei https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623
Adenosin 5′-triphosphate magnesium	salt Sigma Aldrich	A9187-500MG
Ag-Cl gemahlene Pellets	Warner	64-1309, (E205)
Agar	Becton, Dickinson	214530-500g
Ascorbinsäure	Alfa Aesar	36237
Becherglas (250 mL)	Kimax	14000-250
Becherglas (400 mL)	Kimax	14000-400
Biocytin	Sigma Aldrich	B4261
Mixer	Oster	BRLY07-B00-NP0
Bonn Schere, kleiner	Becton, Dickinson	14184-09
Kapillaren aus Borosilikatglas mit Filament (AD 1,5 mm, I.D. 0,86 mm, Länge 10 cm)	Sutter Instruments	BF150-86-10HP	Feuerpolierte Kapillaren sind vorzuziehen.
Calciumchlorid-Lösung (1 M)	G-Biosciences	R040
Kamera	Olympus	OLY-150
komprimiertes Carbogen-Gas (95% Sauerstoff / 5% Kohlendioxid)	Airgas	X02OX95C2003102
komprimierter Sauerstoff	Airgas	OX 200
isolierter Stimulator mit konstanter Spannung	Digitimer Ltd.	DS2A-Mk.II
Deckgläser (22x50 mm)	VWR	16004-314
Cyanacrylat-Klebstoff	Krazy Glue	KG925	Verwenden Sie idealerweise die Brush-on-Form für die
Präzisionsdatenerfassungssoftware	Axograph	N/A	Jede gleichwertige Software (z.B. pClamp) würde funktionieren.
Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop	Dell	N/A	Die Katalognummer hängt vom jeweiligen Computer ab – jeder Computer funktioniert, solange er elektrophysiologische Erfassungssoftware ausführen kann.
Digidata 1440A	Molecular Devices	1-2950-0367
digitaler Timer	VWR	62344-641	4-Kanal Rückverfolgbarer Timer
Einweg-Absorptionspads	VWR	56616-018
Dissektorschere	Fine Science Tools	14082-09
zweischneidige Rasierklingen	Personna	BP9020
dual automatisch Temperaturregler	Warner Instrument Corporation	TC-344B
Dual-Surface- oder Laminar-Flow-optimierte Aufnahmekammer	N/A	N/A	Die in diesem Protokoll vorgestellte Kammer ist eine Sonderanfertigung. Ein kommerzielles Pendant wäre die RC-27L von Warner Instruments.
Gerätegestell	Automate Scientific	FR-EQ70"	Ein Gestell ist nicht unbedingt erforderlich, aber nützlich für die Organisation der Elektrophysiologie
Ethylenglykol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-Teetraessigsäure (EGTA)	Sigma Aldrich	324626-25GM
Filterpapier	Whatman	1004 070
Feinkalk	Mettler Toledo	XS204DR
/Brauner Mikropipettenabzieher	Sutter Instruments	P-97
Petrischale aus Glas (100 x 15 mm)	Corning	3160-101
Glukose	Fisher Scientific	D16-1
Guanosin 5′-Triphosphat Natriumsalzhydrat	Sigma Aldrich	G8877-250MG
Eiskübel	Sigma Aldrich	BAM168072002-1EA
Isofluran-Verdampfer	General Anesthetic Services	Tec 3
Laborband	Fisher Scientific	15-901-10R
Linsenpapier	Fisher Scientific	11-996
Lichtquelle	Olympus	TH4-100
Magnesiumchloridlösung (1 M)	Qualität Biologisch	351-033-721EA
magnetisch Rührstäbchen	Fisher Scientific	14-513-56	Die Katalognummer hängt von der Größe des Rührstäbchens ab.
Mikromanipulator	Luigs & Neumann	SM-5
Mikromanipulator (manuell)	Scientifica	LBM-2000-00
Mikroskop	Olympus	BX51WI
Mikrospatel	Fine Science Tools	10089-11
Monitor	Dell	2007FPb
MultiClamp 700B Mikroelektrodenverstärker	Molekulare Bauelemente	MULTICLAMP 700B	Die MultiClamp 700B sollte Kopftische, Pipettenhalter und eine Modellzelle enthalten.
N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N′-(2-Ethansulfonsäure), (HEPES)	Sigma Aldrich	H3375-25G
Nadel (20 Gauge, 1,5 Zoll Länge)	Becton, Dickinson	305176
Nylon Filament	YLI Wonder Invisible Thread	212-15-004	Größe 0,004. Diese Katze. # ist aus Amazon.com
Nylonnetz	Warner Instruments Corporation	64-0198
Perstaltikpumpe	Harvard Apparatus	70-2027
Phosphokreatin Di(tris) Salz	Sigma Aldrich	P1937-1G
Pipettenhalter	Molecular Devices	1-HL-U
Platindraht	World Precision	PT0203
Polymilchsäure (PLA) Filament	Ultimaker	RAL 9010
Kaliumchlorid	Sigma Aldrich	P3911-500G
Kaliumgluconat	Sigma Aldrich	1550001-200MG
Kaliumhydroxid	Sigma Aldrich	60377-1KG
Rasierklingen	VWR	55411-050
Rollenklemme	Welt Precision Instruments	14041
Waage	Mettler Toledo	PM2000
Skalpellgriff	Fine Science Tools	10004-13
Scheibe Harfe	Warner	SHD-26GH/2
Natriumbicarbonat	Fisher Chemical	S233-500
Natriumchlorid	Sigma Aldrich	S9888-1KG
Natriumphosphat monobasisch wasserfrei	Fisher Chemical	S369-500
Natriumpyruvat	Fisher Chemical	BP356-100
Spatel	VWR	82027-520
Spatel/Löffel, groß	VWR	470149-442
sterile Skalpellklingen	Feder	72044-10
Rührer / Heizplatte	Corning	6795-220
Absperrventile, 1-Wege	World Precision Instruments	14054
Absperrventile, 3-Wege	World Precision Instruments	14036
Saccharose	Acros Organics	AC177142500
Halterung für Drehklemmen	Fisher Scientific	14-679Q
chirurgische Schere, scharf/stumpf	Fine Science Tools	14001-12
Spritze (1 mL)	Becton, Dickinson	309659
Spritze (60 mL mit Luer-Lok-Spitze)	Becton, Dickinson	309653
dreizinkige Klemme	Fisher Scientific	05-769-8Q
Gewebezange, groß	Fine Science Tools	11021-15
Gewebezange, kleine	Fine Science Tools	11023-10
Transferpipetten	Fisher Scientific	13-711-7M
Schlauch	Tygon	E-3603	ID 1/16 Zoll, AD 3/16 Zoll
Schlauch	Tygon	R-3603	ID 1/8 Zoll, AD 1/4 Zoll
Vakuumfett	Dow Corning	14-635-5D
Vibrationsklingen-Mikrotom	Leica	VT 1200S
Schwingungsdämpfender Tisch mit Faradayscher Käfig	Micro-G / TMC-ametek	2536-516-4-30PE
Messkolben (1 L)	Kimax	KIM-28014-1000
Messkolben (2 L)	PYREX	65640-2000
Warmwasserbad	VWR	1209

Flammender