Kombination von Multiplex-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit fluoreszierender Immunhistochemie an frischen, gefrorenen oder fixierten Mäusehirnschnitten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kombination von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Fluoreszenz-Immunhistochemie (IHC) sowohl in frisch gefrorenen als auch in fixierten Maus-Hirnschnitten, mit dem Ziel, Multilabel-FISH und Fluoreszenz-IHC-Signal zu erreichen. IHC zielte auf zytoplasmatische und membrangebundene Proteine ab.

Zusammenfassung

Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine molekulare Technik, die das Vorhandensein und die räumliche Verteilung spezifischer RNA-Transkripte in Zellen identifiziert. Die neurochemische Phänotypisierung von funktionell identifizierten Neuronen erfordert in der Regel die gleichzeitige Markierung mit mehreren Antikörpern (Targeting-Protein) mittels Immunhistochemie (IHC) und die Optimierung der In-situ-Hybridisierung (Targeting-RNA ). Eine "neurochemische Signatur" zur Charakterisierung bestimmter Neuronen kann erreicht werden, aber zu den erschwerenden Faktoren gehören die Notwendigkeit, FISH- und IHC-Ziele vor der Kombination der Methoden zu verifizieren, und die begrenzte Anzahl von RNAs und Proteinen, die gleichzeitig innerhalb desselben Gewebeschnitts anvisiert werden können.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das sowohl frisch gefrorene als auch fixierte Mäusegehirnpräparate verwendet, das mehrere mRNAs und Proteine im selben Gehirnschnitt mit RNAscope FISH und anschließender Fluoreszenz-Immunfärbung nachweist. Wir verwenden die kombinierte Methode, um das Expressionsmuster von mRNAs mit geringer Häufigkeit (z. B. Galaninrezeptor 1) und mRNAs mit hoher Häufigkeit (z. B. Glycintransporter 2) in immunhistochemisch identifizierten Hirnstammkernen zu beschreiben.

Die wichtigsten Überlegungen für die Proteinmarkierung nach dem FISH-Assay gehen über die Gewebevorbereitung und die Optimierung der FISH-Sondenmarkierung hinaus. Zum Beispiel haben wir herausgefunden, dass die Antikörperbindung und die Markierungsspezifität durch den Proteaseschritt innerhalb des FISH-Sonden-Assays nachteilig beeinflusst werden können. Proteasen katalysieren die hydrolytische Spaltung von Peptidbindungen und erleichtern so den Eintritt der FISH-Sonde in die Zellen, aber sie können auch das Protein verdauen, auf das der nachfolgende IHC-Assay abzielt, wodurch eine Off-Target-Bindung entsteht. Die subzelluläre Lokalisation des Zielproteins ist ein weiterer Faktor, der zum Erfolg der IHC nach dem FISH-Sondentest beiträgt. Wir beobachteten, dass die IHC-Spezifität erhalten blieb, wenn das Zielprotein membrangebunden ist, während IHC, das auf das zytoplasmatische Protein abzielte, eine umfangreiche Fehlerbehebung erforderte. Schließlich stellten wir fest, dass die Handhabung von fixiertem gefrorenem Gewebe auf Objektträgern schwieriger war als die von frischem gefrorenem Gewebe, jedoch war die IHC-Qualität mit fixiertem gefrorenem Gewebe in Kombination mit RNAscope insgesamt besser.

Einleitung

Proteine und mRNAs, die neurochemisch Subpopulationen von Neuronen definieren, werden üblicherweise mit einer Kombination aus Immunhistochemie (IHC) und/oder In-situ-Hybridisierung (ISH) identifiziert. Die Kombination von ISH mit IHC-Techniken erleichtert die Charakterisierung von Kolokalisationsmustern, die für funktionelle Neuronen einzigartig sind (neurochemische Kodierung), indem die Multiplex-Markierungskapazität maximiert wird.

Fluoreszierende ISH (FISH)-Methoden, einschließlich RNAscope, haben eine höhere Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu früheren RNA-Nachweismethoden wie radioaktivem ISH und nicht-radioaktivem chromogenem ISH. FISH ermöglicht die Visualisierung einzelner mRNA-Transkripte als punktgefärbte Spots¹. Darüber hinaus ermöglicht der RNAscope-Assay die gleichzeitige Markierung einer größeren Anzahl von RNA-Zielen unter Verwendung verschiedener Fluorophor-Tags. Trotz dieser Vorteile können technische Einschränkungen die Anzahl der Fluorophore/Chromogene beeinflussen, die in einem einzigen Experiment verwendet werden können. Dazu gehören die Verfügbarkeit von Mikroskop-Filtersets; Solche Überlegungen werden noch verstärkt, wenn die neurochemische Identifizierung kombinierte FISH und IHC verwendet, verglichen mit der Verwendung beider Techniken allein, da inhärente Schritte, die für eine Methode optimal sind, für die andere nachteilig sein können.

Frühere Anwendungen von FISH in Kombination mit IHC haben die Expression spezifischer zellulärer Ziele in humanen B-Zell-Lymphomen², Kükenembryonen³, Zebrafischembryonen⁴, Maus-Retina⁵ und Maus-Innenohrzellen⁶ gezeigt. In diesen Studien wurde das Gewebepräparat entweder in formalinfixiertes Paraffin eingebettet (FFPE)^2,3,5 oder in frisches ganzes^Mount-4,6 eingelassen. In anderen Studien wurde chromogenes RNAscope auf fixierte Gehirnpräparate von Mäusen und Ratten angewendet ^7,8,9. Insbesondere Baleriola et al.⁸ beschrieb zwei verschiedene Gewebepräparate für die kombinierte ISH-IHC; Korrigierte Maus-Gehirn-Schnitte und FFPE-Sektionen des menschlichen Gehirns. In einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung haben wir FISH und fluoreszierende IHC auf frischen Gefrierschnitten kombiniert, um gleichzeitig mRNA mit geringer Häufigkeit (Galaninrezeptor 1, GalR1), mRNA mit hoher Häufigkeit (Glycintransporter 2, GlyT2) und vesikuläres Acetylcholintransporter (vAChT)-Protein¹⁰ in der retikulären Formation des Hirnstamms sichtbar zu machen.

Der Kern des Solitärtrakts (NTS) ist eine wichtige Hirnregion, die an der autonomen Funktion beteiligt ist. Diese heterogene Population von Neuronen befindet sich im Hinterhirn und empfängt und integriert eine große Anzahl autonomer Signale, einschließlich solcher, die die Atmung regulieren. Das NTS beherbergt mehrere neuronale Populationen, die phänotypisch durch das Expressionsmuster von mRNA-Zielen wie GalR1 und GlyT2 sowie Proteinmarker für das Enzym Tyrosinhydroxylase (TH) und den Transkriptionsfaktor Paired-like homeobox 2b (Phox2b) charakterisiert werden können.

Der RNAscope-Inhaber empfiehlt frische, gefrorene Gewebepräparate, aber Gewebe, das durch transkardiale Perfusionsfixierung bei Ganztieren hergestellt wurde, zusammen mit langfristiger Kryoprotektion (Lagerung bei -20 °C) von fixierten gefrorenen Gewebeschnitten, ist in vielen Labors üblich. Daher haben wir versucht, Protokolle für FISH in Kombination mit IHC unter Verwendung von frisch gefrorenen und fixierten gefrorenen Gewebepräparaten zu erstellen. Hier stellen wir für frisch gefrorene und fixierte gefrorene Hirnschnitte zur Verfügung: (1) ein Protokoll für kombinierte FISH und fluoreszierende IHC, (2) eine Beschreibung der Qualität der mRNA- und Proteinmarkierung, die bei Verwendung jedes Präparats erzeugt wird, (3) eine Beschreibung der Expression von GalR1 und GlyT2 im NTS.

Unsere Studie zeigte, dass in Kombination mit der RNAscope-Methodik der IHC-Erfolg in frisch gefrorenen und fixierten gefrorenen Präparaten variierte und von der Lokalisierung der Zielproteine in der Zelle abhing. In unseren Händen war die Markierung membrangebundener Proteine immer erfolgreich. Im Gegensatz dazu erforderte die IHC für zytoplasmatische Proteine eine Fehlerbehebung auch in Fällen, in denen das zytoplasmatische Protein in einem transgenen Tier überexprimiert wurde (Phox2b-GFP)¹¹. Während GalR1 im NTS in nicht-katecholaminergen Neuronen exprimiert wird, fehlt die GlyT2-Expression im NTS.

Protokoll

Eine Zusammenfassung der Schritte zur Gewebevorverarbeitung ist in Abbildung 1 zu finden. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Animal Care and Ethics Committee der University of New South Wales in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Verwendung und Pflege von Tieren für wissenschaftliche Zwecke (Australian National Health and Medical Research Council) durchgeführt.

1. Probenvorbereitung von frischem, gefrorenem Hirngewebe

1. Transkardiale Perfusion
   1. Bereiten Sie heparinisierten (2500 U/L) 0,1 M Phosphatpuffer (PB) mit einem pH-Wert von 7,5 vor. Stellen Sie Trockeneis-Ethanol-Aufschlämmung her, indem Sie Trockeneis mit Ethanol mischen. Dieser hat eine Temperatur von ca. −72 °C und wird zum sofortigen Einfrieren des entnommenen Gewebes verwendet.
   2. Euthanasieren adulte Mäuse mit C57BL/6 und Phox2b-GFP¹¹ (Mouse Genome Informatics database ID MGI:5776545) durch Anästhesie mit Natrium-Pentobarbital (70 mg/kg, i.p.) unter Verwendung einer 27,5-Zoll-Nadelstärke.
      ACHTUNG: Pentobarbital ist ein Barbiturat. Es ist in hohen Dosen akut toxisch und kann zum Tod durch Atemstillstand führen. Konsultieren Sie vor der Verwendung die örtlichen Gesundheits-, Rechts- und Materialsicherheitsrichtlinien.
   3. Legen Sie das Herz frei und kanülieren Sie die linke Herzkammer mit einer Aufziehnadel (23 Zoll Gauge). Führen Sie eine transkardiale Perfusion mit heparinisierten 0,1 M PB durch, bis das Blut mit einer Flussrate von 11-13 ml/min klar ist (2-3 Minuten). Bestimmung der Blutreinigung durch Überwachung der Färbung der Leber und des Ausflusses aus dem rechten Vorhof¹².
   4. Isolieren Sie das Gehirn von der Schädelhöhle, betten Sie es sofort in Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) in einer Kryomol- oder Aluminiumfolie ein und legen Sie es auf das Trockeneis-Ethanolbad. Lagern Sie das gefrorene eingebettete Gewebe in einem luftdichten Behälter bei - 80 °C bis zu 3 Monate.
2. Schneiden von frischem, gefrorenem Gewebe
   1. Stellen Sie die Kryostattemperatur auf -20 °C ein. Lassen Sie das OCT-eingebettete Gewebe und ein Kryostat-Chuck ~30 Minuten lang im Kryostaten, um ein Gleichgewicht mit der neuen Temperatur zu ermöglichen.
      HINWEIS: Halten Sie das Taschentuch immer gefroren; Transportieren Sie das Gewebe aus dem -80 °C-Gefrierschrank auf Trockeneis zum Kryostaten.
   2. Befestigen Sie das Gewebe mit OCT-Compound auf dem vorgekühlten Kryostatfutter. In diesem Protokoll wurden Gewebeblöcke auf das Futter in der koronalen Ebene montiert.
      HINWEIS: Schneiden Sie überschüssige OCT mit einer Rasierklinge aus dem Gewebe, um die Menge an OCT zu minimieren, die vom Kryostaten geschnitten und anschließend auf den Objektträger übertragen wird.
   3. Schneiden Sie 14 μm dicke koronale Schnitte und montieren Sie sie auf geladene Glasobjektträger.
      1. Erwärmen Sie die Objektträger auf Raumtemperatur, bevor Sie die Profile montieren. Sobald der Abschnitt montiert ist, bewahren Sie die Objektträger in einer Objektträgerbox im Kryostaten auf.
      2. Wenn mehr als ein Abschnitt auf einem Objektträger montiert werden muss, erwärmen Sie den Bereich für den zweiten Teil, indem Sie einen Finger 5-10 Sekunden lang auf die gegenüberliegende Seite des Objektträgers legen, um das Anhaften des Abschnitts am Objektträger zu erleichtern. Ein kalter Gewebeschnitt lässt sich nicht an einem kalten Objektträger befestigen. Die Abschnitte sollten flach auf den Schienen haften; Das Zusammenklappen führt dazu, dass sie während der Waschschritte von den Objektträgern fallen.
      3. Wenn Risse in den Abschnitten festgestellt werden, erhöhen Sie die Kryostattemperatur um 1-5 °C, um dies zu vermeiden. Besonders wichtig ist es, Gewebeschnitte in unmittelbarer Nähe zueinander auf demselben Objektträger zu platzieren. Dadurch wird die Verschwendung von FISH-Sonden und Reagenzien während des Assays vermieden.
   4. Auf Objektträgern montierte Gewebeschnitte in einem luftdichten Behälter bei -80 °C bis zu 6 Monate lagern.
      HINWEIS: Halten Sie die Abschnitte immer gefroren und vermeiden Sie Einfrier-Auftauzyklen, um einen RNA-Abbau zu verhindern. Transportieren Sie die Objektträgerbox aus dem Inneren des Kryostaten in den -80 °C Gefrierschrank auf Trockeneis.
3. Fixierung von frischem, gefrorenem Gewebe
   1. An dem Tag, an dem der FISH-Sondentest durchgeführt werden soll, werden 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M PB, pH 7,5 (4 % PFA-Lösung) hergestellt. Filtern Sie, indem Sie Filterpapier (Güteklasse 1: 11 μm, Materialtabelle) in einem Buchner-Trichter oder Tiegelfilter durchlaufen.
      VORSICHT : PFA ist bei Hautkontakt oder Einatmen schädlich und giftig. Alle Verfahren mit PFA-Lösung sollten in einem Abzug durchgeführt werden. PFA-Lösungsabfälle sollten sorgfältig gemäß den institutionellen Sicherheitsprotokollen entsorgt werden.
   2. Die 4%ige PFA-Lösung auf 4 °C abkühlen lassen. Transportieren Sie das Objektträgergewebe aus dem -80 °C Gefrierschrank in Trockeneis und tauchen Sie es sofort für 15 Minuten in das vorgekühlte Fixiermittel.
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass dieser Fixierungsschritt 15 Minuten nicht überschreitet, da eine Überfixierung zu einer unspezifischen Hintergrundbeschriftung führt.
4. Dehydrierung von frischem, gefrorenem Gewebe
   1. Dehydrieren Sie Gewebeschnitte, indem Sie die Objektträger in abgestufte Ethanolkonzentrationen eintauchen. In einem Coplin-Glas zuerst 50 %, dann 70 % und schließlich absolutes Ethanol für jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur eintauchen. Wiederholen Sie die abschließende absolute Ethanol-Inkubation ein zweites Mal.
   2. Trocknen Sie die Objektträger an der Luft und skizzieren Sie die Schnittgruppe mit einem hydrophoben Barrierestift, wobei darauf zu achten ist, dass der Innenbereich auf ein Minimum reduziert wird.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Objektträger vollständig trocken ist, bevor Sie die hydrophobe Barriere ziehen. Die hydrophobe Barriere sollte die Gewebeschnitte völlig lückenlos umschließen und muss vor der Weiterverarbeitung trocken sein.

2. Probenvorbereitung von fixiertem gefrorenem Hirngewebe

1. Transkardiale Perfusionsfixierung
   1. Euthanasie der Mäuse durch Anästhesie mit Natrium-Pentobarbital (70 mg/kg, i.p.), gefolgt von transkardialer Perfusion, zuerst mit 0,1 M PB, dann mit 4%iger PFA-Lösung. Fixieren Sie mit 10 Minuten Perfusion bei 11-13 ml/min.
   2. Das Gehirn wird nach der Perfusionsfixierung von der Schädelhöhle isoliert und über Nacht in eine 4%ige PFA-Lösung bei 4 °C getaucht.
2. Gewebeschnitt von fixiertem Gewebe
   1. Spülen Sie das Gehirn mit steriler 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ab, bevor Sie die Hirnhautschichten mit Hilfe eines Präpariermikroskops mit einer feinen Pinzette entfernen.
   2. Schneiden Sie das Gehirn präzise in Blöcke (trennen Sie den Hirnstamm vom Vorderhirn vor dem Vibratomschnitt) mit Hilfe einer Gehirnmatrix (Materialtabelle). Konkret wird der Hirnstamm kaudal an der pyramidalen Dekussion durchtrennt und das Kleinhirn wegseziert. In ähnlicher Weise schneidest du das Vorderhirn unmittelbar rostral zum Chiasma opticus.
   3. Befestigen Sie das Gewebe mit Cyanacrylat auf einem vibrierenden Mikrotomfutter und betten Sie es in eine 2%ige Agarlösung ein.
   4. Schneiden Sie 30 μm dicke Gewebeschnitte mit einem vibrierenden Mikrotom und lagern Sie die geschnittenen Abschnitte in kryoprotektiver Lösung (30 % RNase-freie Saccharose, 30 % Ethylenglykol, 1 % Polyvinylpyrrolidon (PVP-40), in 0,1 M PB, pH 7,4). Gewebeschnitte können bis zu 6 Monate in Kryoprotektivum bei -20 °C gelagert werden.
3. Vorbereitung von fixierten Schnitten vor FISH
   1. Waschen Sie am Tag des FISH die frei schwimmenden Abschnitte dreimal für 10 Minuten pro Wäsche, um die Kryoprotektivlösung zu entfernen. Zum Waschen werden die Abschnitte in 0,1 M PBS in eine 12-Well-Zellkulturplatte gegeben und auf einem rotierenden Plattformschüttler (90 - 100 U/min) gerührt.
   2. Verwenden Sie nach dem Waschen einen Pinsel, um Abschnitte auf Glasobjektträgern zu befestigen, und lassen Sie sie mindestens 2 Stunden lang an der Luft trocknen.
      HINWEIS: Die Abschnitte sollten flach auf den Objektträgern haften, da sich ausgeprägte Falten beim Waschen lösen.
   3. Ziehen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift eine Barriere um die Abschnitte, um die FISH-Reagenzien auf die Abschnitte zu beschränken. Auch hier ist es wichtig, den Innenbereich des mit dem Barrierestift gezeichneten Umrisses zu minimieren.
      MÖGLICHER BRUCHPUNKT: Die Abschnitte könnten über Nacht bei Raumtemperatur gelagert werden, um den Assay am nächsten Tag fortzusetzen.

3. FISH-Analyse

HINWEIS: Der Rest des Protokolls gilt sowohl für frisch gefrorenes als auch für fixiertes gefrorenes Gewebe.

1. Bereiten Sie die Reagenzien und Instrumente für die Hybridisierungs- und Amplifikationsschritte vor.
   1. Stellen Sie einen Tischinkubator und ein Wasserbad auf 40 °C ein.
   2. Bereiten Sie eine befeuchtete, lichtgeschützte Kammer für die Inkubation von Objektträgern vor. Die Befeuchtung verhindert das Austrocknen des Gewebes - die Objektträger befinden sich sicher über einem feuchten Reservoir. Im Idealfall besteht die Kammer aus strapazierfähigem Polystyrol, sie ist licht- und luftdicht, um eine gesättigte Wasserdampfatmosphäre aufrechtzuerhalten. Der Verschluss der Kammer beruht auf minimaler Reibung, um Bewegungen zu vermeiden. Wir haben unten eine Objektträgerbox verwendet, die mit feuchten Labortüchern (Materialtabelle) ausgekleidet war. Stellen Sie die Objektträgerbox in den Inkubator, um sie auf 40 °C vorzuwärmen.
   3. Erwärmen Sie den 50x Waschpuffer (Materialtabelle) und die Sonden 10 Minuten lang im Wasserbad auf 40 °C und kühlen Sie sie dann auf Raumtemperatur ab.
   4. Bereiten Sie 1 l 1x Waschpuffer aus der 50-fachen Vorratskonzentration vor.
   5. Sondenmischung vorbereiten (Materialtabelle): Die C1-Sonde ist bei Lagerkonzentration gebrauchsfertig, während C2- und C3-Sonden als 50-fache Konzentration geliefert werden und mit dem im Kit enthaltenen Verdünnungsmittel verdünnt werden müssen.
      HINWEIS: Sondenmischungen können bei 4 °C bis zu 6 Monate gelagert werden.
2. Protease-Behandlung
   1. Schnitte mit Protease III (Materialtabelle) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Protease III und Inkubationsreagenzien in nachgeschalteten Prozessen (Sondenmischung, Amplifikationslösungen, Blockierungspuffer und Antikörperseren) die Abschnitte vollständig abdecken. Eine Pipettenspitze kann verwendet werden, um das Reagenz auf dem Abschnitt zu verteilen, um den gesamten Bereich innerhalb der hydrophoben Barriere abzudecken.
   2. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit 0,1 M PBS jeweils 2 Minuten lang in einer großen quadratischen Petrischale aus Kunststoff. Hier wurde eine 245 mm x 245 mm große quadratische Bioassay-Schale verwendet (Materialtabelle). Halten Sie die Schale von einer Seite und kippen Sie sie vorsichtig 3-5 Mal. Nach dem Waschen überschüssige 0,1 M PBS vom Objektträger entfernen und sofort das nächste Reagenz hinzufügen. Gewebeschnitte nicht austrocknen lassen.
      HINWEIS: Bei jedem Waschen werden die Objektträger bei Raumtemperatur in Lösung getaucht. Dies ist der Arbeitsablauf für alle nachfolgenden Waschschritte. Die festen 30 μm dicken Abschnitte lösen sich leichter von den Objektträgern als 14 μm dicke Abschnitte, seien Sie während der Wäsche schonend.
3. Hybridisierung und Amplifikation
   1. Nach dem Abwaschen der Proteaselösung legen Sie die Objektträger in die befeuchtete, vorgewärmte Kammer. Inkubieren Sie Schnitte mit Sondenmischung (Materialtabelle) für 2 Stunden bei 40 °C in einem Tischinkubator.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass mindestens 2 Abschnitte für Positiv- und Negativkontrollsonden reserviert sind, um die RNA-Qualität der Probe und die optimale Permeabilisierung zu beurteilen. Positive Kontrollsonden zielen auf Haushaltsgene ab; hier handelte es sich um einen Cocktail von RNAs, die auf Ubiquitin C (UBC; hohe Abundanz), Peptidylpropylisomerase B (PPIB; moderate Abundanz) und RNA-Polymerase 2a (POLR2A; geringe Abundanz) abzielen. Negative Kontrollsonden zielen auf das bakterielle 4-Hydroxy-Tetrahydrodipicolinat-Reduktase-Gen (DapB) ab, das normalerweise in Gehirnproben von Mäusen fehlt. Ein positives DapB-Signal weist auf ein unspezifisches Signal und/oder eine bakterielle Kontamination der Probe hin.
   2. Nach der Hybridisierung mit dem Sondengemisch bestehen die Signalverstärkungsschritte aus der Inkubation mit Amp 1-FL (30 Minuten), dann mit Amp 2-FL (15 Minuten), gefolgt von Amp 3-FL (30 Minuten) und schließlich Amp 4-FL (15 Minuten) - jeweils bei 40 °C. Decken Sie die Gewebeabschnitte mit den mitgelieferten Tropfflaschen mit Amplifikationslösung ab. Fahren Sie nach dem letzten Amplifikationsschritt mit dem IHC-Assay fort.
   3. Spülen Sie die Objektträger zwischen der Sondenhybridisierung und jedem Amplifikationsschritt zweimal 2 Minuten lang mit Waschpuffer.

4. IHC-Analyse

1. IHC-Sperrschritt
   1. Um eine unspezifische Bindung von Antikörpern zu verhindern, werden die Abschnitte nach dem FISH-Assay 1 h lang bei Raumtemperatur mit einer Blockierungslösung inkubiert, die 10 % normales Pferdeserum und 0,3 % Tween20 in 1x TBSm (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05 % Merthiolat) enthält. Präparation der Primärantikörper in einem Verdünnungspuffer, der 1x TBSm, 5 % normales Pferdeserum und 0,1 % Tween20 enthält. Die Lieferanten von Primärantikörpern sind in der Materialtabelle aufgeführt.
2. Immunhistochemie
   1. Überschüssigen Blockierungspuffer durch Schnippen des Objektträgers entfernen und Abschnitte mit Primärantikörpern über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   2. Objektträger 3 Mal (je 5 Minuten) mit 1x TBSm waschen und mit sekundärem Antikörper in einem Verdünnungsmittel mit 1x TBSm, 1 % normalem Pferdeserum und 0,1 % Tween20 für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Sekundäre Antikörper, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.
   3. Objektträger 3 mal mit 1x TBSm (je 5 Minuten) waschen, bevor sie mit Eindeckmedium mit oder ohne DAPI (Table of Materials) abgedeckt werden.

5. Bildgebung

1. Untersuchen Sie die Immunfärbung unter einem Epifluoreszenzmikroskop, das mit einer Kamera ausgestattet ist (siehe Materialtabelle für Details). Erfassen Sie repräsentative Bilder mit 20-facher Vergrößerung und speichern Sie sie als TIFF-Dateien.
2. Exportieren Sie repräsentative Bilder in eine Bildverarbeitungssoftware (Materialtabelle), um Helligkeit und Kontrast anzupassen, um die Klarheit zu erhöhen und die tatsächliche Wiedergabe widerzuspiegeln.

6. OPTIONAL: Quantitative Analyse der Zieltranskripte

HINWEIS: Dies ist ein Methodenartikel und quantitative Ergebnisse werden nicht bereitgestellt. Die hier vorgestellte Quantifizierungsmethode stammt von Dereli et al.¹⁰. Anmelden

1. Nehmen Sie Bilder aus den Regionen von Interesse auf, wie in Abschnitt 5.1 beschrieben, und wenden Sie die gleichen Mikroskop- und Kameraeinstellungen (z. B. Belichtungszeit und Lichtintensität) auf alle Bilder desselben Fluorophors an.
2. Zeichnen Sie die neuronalen Profile mit einer Bildanalysesoftware (Table of Materials) auf.
3. Richten Sie die Abschnitte in Bezug auf das Bregma-Niveau gemäß einem stereotaktischen Hirnatlas¹³ aus.
4. Wenden Sie die gleiche Helligkeit und den gleichen Kontrast auf alle Bilder desselben Fluorophors an. Betrachten Sie nur die Neuronen mit DAPI-gefärbten Kernen.
5. Zählen Sie manuell die Anzahl der mRNA-, Protein-exprimierenden, mRNA/mRNA-, Protein-/Protein- und mRNA/Protein-koexprimierenden Zellen innerhalb der interessierenden Region.
6. Um die Verzerrung in den experimentellen Ergebnissen zu verringern, lassen Sie die Person, die die experimentellen Ergebnisse quantifiziert, für die experimentellen Gruppen verblinden.
7. Wenden Sie die Abercrombie-Korrektur¹⁴ auf die Gesamtzahl der Zellen an, indem Sie die folgende Abercombie-Gleichung verwenden:
   Korrigierte Zellzahl = manuelle Zellzahl x Schnittdicke / (Schnittdicke + Kerngröße)
   Zum Beispiel wird für 14 μm dicke Abschnitte die durchschnittliche Kernbreite mit 7,7 ± 0,3 μm berechnet und die durchschnittliche Querschnittsdicke beträgt 14 ± 1 μm, basierend auf 30 Zellen bzw. 10 Abschnitten bei 5 Tieren¹⁰. Nach der Abercrombie-Gleichung wäre die korrigierte Zellzahl die manuelle Zellzahl x 14/(14+7,7).

Abbildung 1: Paralleler Arbeitsablauf von Gewebevorverarbeitungsschritten sowohl für frisch gefrorenes als auch für paraformaldehydfixiertes Gewebe. Die Verarbeitungsschritte für frisch gefrorenes Gewebe werden in den rot umrandeten Kästchen angezeigt, während die für paraformaldehyd (PFA) fixiertes Gewebe in den blau umrandeten Kästchen angezeigt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Zusammenfassung des kombinierten FISH-Sonden- und immunhistochemischen Verfahrens. Nach der Vorverarbeitung des Gewebes wird das auf dem Objektträger montierte Gewebe mit einem hydrophoben Barrierestift eingekreist, wie im ersten Bild zu sehen, und in einer Proteaselösung bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wird das Gewebe zur Hybridisierung für 2 Stunden in einen Tischinkubator überführt, bevor die sequentiellen Amplifikationsschritte fortgesetzt werden. Das In-situ-Hybridisierungssystem verwendet ein proprietäres "Z-Sonden"-Design, Vorverstärker und Verstärker, wie in den Frames 3-6⁶ zu sehen. Sobald das Gewebe einer FISH-Sondenverarbeitung unterzogen wurde, wird es vor der Blockierung mit normalem Pferdeserum gewaschen. Die Primärantikörper-Inkubation wird über Nacht bei 4 °C durchgeführt, um die Antikörper-Antigen-Bindung zu maximieren. Die Sekundärantikörper-Inkubation (2 Stunden) wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergebnisse

In dieser Arbeit skizzieren wir eine Methode zur Kombination von Multiplex-FISH mit fluoreszierender IHC, um die mRNA-Expression für GalR1 und GlyT2 unter Verwendung von frisch gefrorenem bzw. paraformaldehydfixiertem Gewebe im NTS der Maus zu lokalisieren. Eine Pipeline der in den Methoden beschriebenen Gewebeverarbeitungs-, FISH- und IHC-Verfahren ist in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt. Tabelle 1 enthält eine Zusammenfassung der in jed...

Diskussion

In den Neurowissenschaften werden FISH und IHC routinemäßig eingesetzt, um die räumliche Organisation und funktionelle Bedeutung von mRNA oder Proteinen innerhalb neuronaler Subpopulationen zu untersuchen. Das in dieser Studie beschriebene Protokoll verbessert die Fähigkeit zum gleichzeitigen Nachweis von mRNAs und Proteinen in Hirnschnitten. Unser kombinierter Multiplex-FISH-IHC-Assay ermöglichte die phänotypische Identifizierung verschiedener neuronaler Subpopulationen im NTS sowohl in frisch gefrorenen als auch in fix...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ANIMALS
C57BL/6 Maus	Australian BioResources, Moss Vale	MGI: 2159769
Phox2b-eGFP Maus	Australian BioResources, Moss Vale	MGI: 5776545
REAGENTS
Cyanoacrylat	Loctite
Ethylenglykol	Sigma-Aldrich	324558
Heparin-Natrium	Clifford Hallam Healthcare	1070760	Wenden Sie sich an einen örtlichen Tierarzt oder eine Apotheke.
Lethabarber (Natrium-Pentabarbitol) Euthanasie-Injektion	Virbac (Australien) Pty Ltd	N/A	Konsultieren Sie einen Tierarzt für die örtlichen pharmazeutischen Vorschriften in Bezug auf Natrium-Pentabarbitol
Agarosepulver in molekularer Qualität	Sigma Aldrich	5077
OCT Compound, 118mL	Scigen Ltd	4586
Paraformaldehyd, prilliert, 95%	Sigma-Aldrich	441244-1KG
Polyvinylpyrrolidon, durchschnittliches Molgewicht 40.000 (PVP-40)	Sigma-Aldrich	PVP40
ProLong Gold Eindeckmittel	Invitrogen	P36930	Mit oder ohne DAPI
RNAscope Multiplex-Fluoreszenz-Reagenzkit (bis zu 3-Plex-Fähigkeit)	Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio)	ADV320850	Enthält 50x Waschpuffer und Protease III
RNase Away	Thermo-Fisher Scientific	7003
Tris(hydroxymethyl)Aminomethan	Sigma-Aldrich	252859
Tween-20, für Molekularbiologie	Sigma-Aldrich	P9416
EQUIPMENT
Tisch-Inkubator	Thermoline wissenschaftlicher Mikro-Inkubator	Modell: TEI-13G
Brain Matrix, Maus, 30 g Erwachsener, koronal, 1 mm	Ted Pella	15050
Kryostat	Leica	CM1950
Zeichnungsnadel (23 Zoll Gauge)	BD	0288U07
Hydrophober Barrierestift	Vector Labs	H-4000
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes	Kimberley Clark Professional	34120
Olympus BX51	Olympus	BX-51
Schlauchpumpe	Coleparmer Masterflex	L/S Serie
Retiga 2000R Digitalkamera	QImaging	RET-2000R-F-CLR	Farbkamera
SuperFrost Plus Glasdias (Weiß)	Thermo-Fisher Scientific	4951PLUS4
Vibrierendes Mikrotom (Vibratom)	Leica	VT1200S
Whatman qualitatives Filterpapier, Güteklasse 1, 110 mm Durchmesser	Merck	WHA1001110
SOFTWARES
CorelZEICHNEN	Corel Corporation	Version 7
FIJI (ImageJ Distribution)	Open Source/GNU General Public Licence (GPL)	N/A	ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ für die nächste Generation wissenschaftlicher Bilddaten", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z    und Fidschi: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fidschi: eine Open-Source-Plattform für die Analyse biologischer Bilder", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019
PRIMARY ANTIBODIES
Anti-Tyrosin-Hydroxylase-Antikörper	Millipore Sigma	AB1542	Schaf polyklonal (1:1000 Verdünnung), RRID: AB_90755
Anti-Tyrosin-Hydroxylase-Antikörper, Klon LNC1	Millipore Sigma	MAB318	Maus monoklonal (1:1000 Verdünnung), RRID: AB_2201528
Anti-Vesikulärer Acetylcholin-Transporter (VAchT) Antikörper	Sigma-Aldrich	ABN100	Ziege polyklonal (1:1000 Verdünnung), RRID: AB_2630394
GFP Antikörper	Novus Biologicals	NB600-308	Kaninchen polyklonal (1:1000 Verdünnung), RRID: AB_10003058
Phox2b Antikörper (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-376997	Maus monoklonal (1:1000 Verdünnung), RRID:
AB_2813765SEKUNDÄRE ANTIKÖRPER
Alexa Fluor 488 AffiniPure Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) (min x Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Ratte, Shp Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	711-545-152	Donkey Anti-Rabbit (1:400 Verdünnung), RRID: AB_2313584
AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	713-155-147	Donkey Anti-Schaf (1:400 Verdünnung), RRID: AB_AB_2340725
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat-IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Jackson	ImmunoResearch	705-175-147	Esel Anti-Ziege (1:400 Verdünnung), RRID: AB_2340415
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	715-175-151	Donkey Anti-Mouse (1:400 Verdünnung), RRID: AB_2619678
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	713-175-147	Esel Anti-Schaf (1:400 Verdünnung), RRID: AB_2340730
RNASCOPE PROBES
Galanin Rezeptor 1 Oligonukleotidsonde	ACDBio	448821-C1	zielt auf bp 482 - 1669 (Genbank ref: NM_008082.2)
Glycintransporter 2 Oligonukleotidsonde	ACDBio	409741-C3	zielt auf bp 925 - 2153 ab (Genebank ref: NM_148931.3)
Phox2b Oligonukleotidsonde	ACDBio	407861-C2	targets bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3)