Methodenartikel

Gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Insektenembryonen in probenkammerbasierten Lichtbogenfluoreszenzmikroskopen

DOI:

10.3791/61713

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9. September 2020

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1Physical Biology/Physikalische Biologie (IZN, FB15), Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes (CEF - MC), Goethe-Universität

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Lichtbogen-basierte Fluoreszenzmikroskopie ist das wertvollste Werkzeug in der Entwicklungsbiologie. Ein wichtiges Thema in vergleichenden Studien ist die Varianz der Umgebung. Unser Protokoll beschreibt ein experimentelles Framework für die gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Proben und befasst sich daher proaktiv mit diesem Problem.

Zusammenfassung

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Die Lichtbogen-basierte Fluoreszenzmikroskopie bietet effiziente Lösungen, um komplexe Prozesse auf mehreren biologisch relevanten Skalen zu untersuchen. Probenkammer-basierte Setups, die speziell entwickelt wurden, um die dreidimensionale Integrität der Probe zu erhalten und in der Regel Probenrotation aufweisen, sind die beste Wahl in der Entwicklungsbiologie. Zum Beispiel wurden sie verwendet, um die gesamte embryonale Morphogenese der Fruchtfliege Drosophila melanogaster und des Rotmehlkäfers Tribolium castaneumzu dokumentieren. Viele verfügbare Live-Bildgebungsprotokolle bieten jedoch nur experimentelle Frameworks für einzelne Embryonen. Gerade bei Vergleichsstudien sind solche Ansätze unbequem, da sequenzielle abgebildete Proben von der Umgebungsvarianz beeinflusst werden. Darüber hinaus begrenzt dies die Anzahl der Proben, die innerhalb einer bestimmten Zeit untersucht werden können. Wir bieten einen experimentellen Rahmen für die gleichzeitige Live-Bildgebung, der den Durchsatz in Probenkammer-basierten Setups erhöht und somit ähnliche Umgebungsbedingungen für alle Proben gewährleistet. Zunächst bieten wir eine Kalibrierrichtlinie für Lichtbogenfluoreszenzmikroskope an. Zweitens schlagen wir eine Montagemethode für mehrere Embryonen vor, die mit der Probenrotation kompatibel ist. Drittens bieten wir beispielhafte dreidimensionale Live-Imaging-Datensätze von Drosophila, für die wir drei transgene Linien mit fluoreszierend markierten Kernen sowie von Triboliumgegenüberstellen, für die wir die Leistung von drei transgenen Sublinien vergleichen, die dasselbe Transgen tragen, aber an verschiedenen genomischen Stellen. Unser Protokoll wurde speziell für vergleichende Studien entwickelt, da es proaktiv die Umgebungsvarianz anspricht, die immer in der sequenziellen Live-Bildgebung vorhanden ist. Dies ist besonders wichtig für quantitative Analysen und Die Charakterisierung von aberrationalen Phänotypen, die z.B. aus Knockout-Experimenten resultieren. Darüber hinaus erhöht es den Gesamtdurchsatz, was sehr praktisch ist, wenn der Zugang zu Lichtblattfluoreszenzmikroskopen begrenzt ist. Schließlich kann die vorgeschlagene Montagemethode für andere Insektenarten und weitere Modellorganismen, z.B. Zebrafische, ohne Optimierungsaufwand angepasst werden.

Einleitung

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Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine der wichtigsten bildgebenden Verfahren in den Biowissenschaften, insbesondere in der Zell- und Entwicklungsbiologie. Bei konfokalen Fluoreszenzmikroskopen1, die seit Mitte der 1990er Jahre auf dem Stand der dreidimensionalen Fluoreszenz-Bildgebung sind, wird dieselbe Linse für die Fluorophorerregung und Dieerkennung von Emissionslicht verwendet. Der Beleuchtungslaserstrahl regt alle Fluorophore entlang der Beleuchtungs-/Detektionsachse an und das jeweilige Out-of-Fokus-Signal wird vor der Erkennung durch ein Loch diskriminiert. Somit wird für jedes zweidimensionale Bild die gesamte Probe beleuchtet. Folglich ....

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Protokoll

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1. Vorbereitende Arbeiten

  1. Wählen Sie für den LSFM eine Beleuchtungslinse/Erkennungslinse/Kamera-Kombination, die der wissenschaftlichen Frage gerecht wird, und richten Sie das Mikroskop ein. Die Größe des Sichtfeldes ist der Quotient der Kamerachipgröße und die Vergrößerung der Erkennungslinse. Die Beleuchtungslinse sollte so gewählt werden, dass das gesamte Sichtfeld durch ein grob planares Lichtblatt34abgedeckt wird. Drei empfohlene Kombinationen sind in Tabelle 1aufgeführt.
  2. Um Agarose-Aliquots zuzubereiten und Geschirr zu holen, 2 g schmelzende Agarose zu 200 ml autoklaviertem Leitungswasser hinzufügen un....

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Ergebnisse

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Unser Protokoll beschreibt einen experimentellen Rahmen für die vergleichende Fluoreszenz-Live-Bildgebung in Probenkammer-basierten LSFMs. Beispielsweise kann das Rahmenwerk verwendet werden, um (i) Embryonen von zwei oder mehr Arten, (ii) Embryonen von Linien, in denen ein oder mehrere Gene ausgeschlagen werden, plus Wildtypkontrollen, (iii) mehrere Embryonen derselben transgenen Linie, (iv) Embryonen aus verschiedenen transgenen Linien oder (v) Embryonen aus Unterlinien, die die gleiche Transgene tragen, gegenüberzuste.......

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Diskussion

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Eines der exklusiven Anwendungsbereiche von LSFMs ist die Entwicklungsbiologie. In dieser Disziplin ist es wichtig, lebende Exemplare zu betrachten, da sonst morphogenetische Prozesse nicht dynamisch beschrieben werden können. Ein experimenteller Rahmen für die gleichzeitige Live-Bildgebung in Probenkammer-basierten LSFMs, wie hier beschrieben, ist aus zwei Hauptgründen praktisch.

Umgebungsvarianz, die in der sequentiellen Live-Bildgebung unvermeidbar ist, kann proaktiv angegangen werden. In d.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Wir danken Ernst H. K. Stelzer für die Gelegenheit, seine Ressourcen zu nutzen, sowie seine wertvollen Kommentare zum Manuskript, Anita Anderl für die Unterstützung mit dem Tribolium Live Imaging, Sven Plath für die technische Unterstützung sowie Ilan Davis, Nicole Grieder und Gerold Schubiger für die gemeinsame Nutzung ihrer transgenen Drosophila-Linien über das Bloomington Stock Center.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
6-Well-PlatteOrange Scientific4430500 
24-Well-PlatteOrange Scientific4430300Nur für Live-Bildgebung mit Tribolium
35 mm & Oslash; PetrischaleFisher Scientific153066Nur für Live-Bildgebung mit Drosophila.
90 mm & Oslash; PetrischaleFisher ScientificL9004575
100 µ m Maschenweite ZellsiebBD Biosciences352360
250 µ m Maschenweite SiebVWR International200.025.222-038Nur für Live-Aufnahmen mit Tribolium
300 µ m Maschenweite SiebVWR International200.025.222-040Nur für Live-Imaging mit Tribolium
710 µ m Maschenweite SiebVWR International200.025.222-050Nur für Live-Bildgebung mit Tribolium
800 µ m Maschenweite SiebVWR International200.025.222-051Nur für Live-Imaging mit Tribolium
405 feinem WeizenmehlDemeter e.V.SP061006Nur für Live-Bildgebung mit Tribolium
kommerziell erhältlichem Drosophila-MediumGenesee Scientific66-115Nur für Live-Bildgebung mit Drosophila / Maßgeschneidertes Drosophila-Medium kann auch verwendet werden
Fluoreszierende Mikrosphären, 1,0 & Mikro-Strahlung. m & Oslash;Thermo Fisher ScientificT7282
inaktive TrockenhefeGenesee Scientific62-108
Low-Melt AgaroseCarl Roth6351.2
schmale FläschchenGenesee Scientific32-109Nur für Live-Bildgebung mit Drosophila
smallPinsel VWR International149-2121
Natriumhypochlorit (NaOCl), ~12% aktiv ClCarl Roth9062.3Achtung: Natriumhypochlorit ist ätzend
VollkornmehlDemeter e.V.SP061036Nur für Live-Bildgebung mit Tribolium / Vereinigtes Königreich:
breite DurchstechflaschenGenesee Scientific32-110Nur für Live-Aufnahmen mit Drosophila
aus Vollkornmehl

Referenzen

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  1. St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), Suppl 2-5 (2005).
  2. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of....

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Schlagwörter

LichtschnittmikroskopieAufbau der Probenkammergleichzeitige Embryo BildgebungMontage des Cobweb HaltersKalibrierung mit fluoreszierenden Mikrosph renBildgebung von Drosophila EmbryonenBildgebung von Tribolium EmbryonenProtokoll zur Dechorionierung von EmbryonenEinbetten in Agarosefilmvergleichende Live Bildgebung

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