Method Article

Gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Insektenembryonen in probenkammerbasierten Lichtbogenfluoreszenzmikroskopen

DOI:

10.3791/61713

⸱

September 9th, 2020

 ,  , 
1Physical Biology/Physikalische Biologie (IZN, FB15), Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes (CEF - MC), Goethe-Universität

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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Die Lichtbogen-basierte Fluoreszenzmikroskopie ist das wertvollste Werkzeug in der Entwicklungsbiologie. Ein wichtiges Thema in vergleichenden Studien ist die Varianz der Umgebung. Unser Protokoll beschreibt ein experimentelles Framework für die gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Proben und befasst sich daher proaktiv mit diesem Problem.

Abstract

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Die Lichtbogen-basierte Fluoreszenzmikroskopie bietet effiziente Lösungen, um komplexe Prozesse auf mehreren biologisch relevanten Skalen zu untersuchen. Probenkammer-basierte Setups, die speziell entwickelt wurden, um die dreidimensionale Integrität der Probe zu erhalten und in der Regel Probenrotation aufweisen, sind die beste Wahl in der Entwicklungsbiologie. Zum Beispiel wurden sie verwendet, um die gesamte embryonale Morphogenese der Fruchtfliege Drosophila melanogaster und des Rotmehlkäfers Tribolium castaneumzu dokumentieren. Viele verfügbare Live-Bildgebungsprotokolle bieten jedoch nur experimentelle Frameworks für einzelne Embryonen. Gerade bei Vergleichsstudien sind solche Ansätze unbequem, da sequenzielle abgebildete Proben von der Umgebungsvarianz beeinflusst werden. Darüber hinaus begrenzt dies die Anzahl der Proben, die innerhalb einer bestimmten Zeit untersucht werden können. Wir bieten einen experimentellen Rahmen für die gleichzeitige Live-Bildgebung, der den Durchsatz in Probenkammer-basierten Setups erhöht und somit ähnliche Umgebungsbedingungen für alle Proben gewährleistet. Zunächst bieten wir eine Kalibrierrichtlinie für Lichtbogenfluoreszenzmikroskope an. Zweitens schlagen wir eine Montagemethode für mehrere Embryonen vor, die mit der Probenrotation kompatibel ist. Drittens bieten wir beispielhafte dreidimensionale Live-Imaging-Datensätze von Drosophila, für die wir drei transgene Linien mit fluoreszierend markierten Kernen sowie von Triboliumgegenüberstellen, für die wir die Leistung von drei transgenen Sublinien vergleichen, die dasselbe Transgen tragen, aber an verschiedenen genomischen Stellen. Unser Protokoll wurde speziell für vergleichende Studien entwickelt, da es proaktiv die Umgebungsvarianz anspricht, die immer in der sequenziellen Live-Bildgebung vorhanden ist. Dies ist besonders wichtig für quantitative Analysen und Die Charakterisierung von aberrationalen Phänotypen, die z.B. aus Knockout-Experimenten resultieren. Darüber hinaus erhöht es den Gesamtdurchsatz, was sehr praktisch ist, wenn der Zugang zu Lichtblattfluoreszenzmikroskopen begrenzt ist. Schließlich kann die vorgeschlagene Montagemethode für andere Insektenarten und weitere Modellorganismen, z.B. Zebrafische, ohne Optimierungsaufwand angepasst werden.

Introduction

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Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine der wichtigsten bildgebenden Verfahren in den Biowissenschaften, insbesondere in der Zell- und Entwicklungsbiologie. Bei konfokalen Fluoreszenzmikroskopen1, die seit Mitte der 1990er Jahre auf dem Stand der dreidimensionalen Fluoreszenz-Bildgebung sind, wird dieselbe Linse für die Fluorophorerregung und Dieerkennung von Emissionslicht verwendet. Der Beleuchtungslaserstrahl regt alle Fluorophore entlang der Beleuchtungs-/Detektionsachse an und das jeweilige Out-of-Fokus-Signal wird vor der Erkennung durch ein Loch diskriminiert. Somit wird für jedes zweidimensionale Bild die gesamte Probe beleuchtet. Folglich wird für jedes dreidimensionale Bild, d.h. ein Stapel räumlich aufeinander folgender zweidimensionaler Bilder, die gesamte Probe mehrere Dutzend bis einige hundert mal2beleuchtet, was Photobleichungen und Phototoxizität3fördert.

Vor fast zwanzig Jahren entwickelte sich die Lichtbogentechnologie4 als vielversprechende Alternative zur dreidimensionalen Fluoreszenz-Bildgebung und wurde so zu einem wertvollen Werkzeug in der Entwicklungsbiologie5. Dabei werden Beleuchtung und Erkennung entkoppelt. Die Beleuchtungslinse wird verwendet, um eine Lichtplatte mit einer Tiefe von nur wenigen Mikrometern innerhalb der Brennebene der senkrecht angeordneten Detektionslinse zu erzeugen. Daher wird für jedes zweidimensionale Bild nur ein dünnes planares Volumen um die Brennebene beleuchtet. Folglich wird für jedes dreidimensionale Bild die gesamte Probe nur einmal beleuchtet, was die Photobleaching und Phototoxizität stark verringert6. Aus diesem Grund bieten Lichtbogenfluoreszenzmikroskope (LSFMs) effiziente Lösungen zur Untersuchung komplexer Prozesse auf mehreren biologisch relevanten Skalen und sind daher von besonderem Wert in der Entwicklungsbiologie, wo Proben bis zu mehreren Millimetern auf subzellulärer Ebene analysiert werden müssen.

In der Vergangenheit waren LSFMs stichprobenkammerbasiert7,8. In diesen Setups sind die Beleuchtungsachsen (x) und die Erkennungsachse (z) in der Regel senkrecht zur Gravitationsachse (y) angeordnet. Probenkammern bieten reichlich experimentelle Freiheit. Erstens bieten sie große bildgebende Pufferkapazitäten, was wiederum den Einsatz eines Perfusionssystems zur Kontrolle der Umwelt erleichtert, z. B. zur Aufrechterhaltung einer bestimmten Temperatur9 oder zur Anwendung biochemischer Stressoren. Darüber hinaus unterstützen sie kundenspezifische Montagemethoden10, die auf die jeweiligen experimentellen Bedürfnisse zugeschnitten sind, während die dreidimensionale, in einigen Fällen dynamische11-Integrität der Probe erhalten bleibt. Darüber hinaus sind Probenkammer-basierte Setups in der Regel mit einer Rotationsfunktion ausgestattet, die verwendet wird, um die Proben um die y-Achse zu drehen und sie so in zwei, vier oder sogar mehr Richtungen abzubilden. Da Embryonen von häufig verwendeten Modellorganismen im Kontext der Mikroskopie relativ große, aufeinander folgende Bildgebung entlang der ventral-dorsalen, lateralen und/oder vorderen-hinteren Körperachsen sind, bietet eine umfassendere Darstellung. Dies ermöglicht z.B. die langfristige Verfolgung von Zellen, die sich entlang komplexer dreidimensionaler Migrationspfadebewegen 12,13.

Die Lichtbogen-basierte Fluoreszenzmikroskopie wurde ausgiebig eingesetzt, um die embryonale Morphogenese von Drosophila melanogasterzu untersuchen, sowohl systematisch14,15 als auch mit einem spezifischen Fokus auf die biophysikalischen Aspekte der Entwicklung. Zum Beispiel wurde es verwendet, um hochauflösende morphogenetische Daten zu sammeln, um eine biomechanische Verbindung zwischen Endoderm-Invagination und Achsverlängerung während der Keimbanddehnung16 zu erkennen und den komplexen Zellfluss weiter mit Krafterzeugungsmustern während der Gastrulation17in Beziehung zu setzen. Es wurde auch mit anderen modernsten Techniken kombiniert, z.B. Optogenetik, um die Regulierung der Wnt-Signalisierung während der vorderen posterioren Musterung in der Epidermis18zu untersuchen.

Das Studium nur einer Art gibt jedoch keine Erkenntnisse über die Entwicklung der Entwicklung. Um die Embryogenese im phylogenetischen Kontext zu verstehen, wurde intensiv an alternativen Insektenmodellorganismen geforscht. Eine der am umfassendsten untersuchten Arten ist der Rotmehlkäfer Tribolium castaneum, ein wirtschaftlich relevanter gelagerter Getreideschädling19, dessen embryonale Morphogenese ebenfalls bereits systematisch mit LSFM20abgebildet wurde. Die embryonale Morphogenese dieser beiden Arten unterscheidet sich in mehreren Aspekten bemerkenswert, z.B. der Segmentierungsmodus21, sowie die Bildung und degradierung von extraembryonalen Membranen22. Letzterer Aspekt wurde bereits mit LSFMs ausgiebig analysiert. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass die Serosa, ein extraembryonales Gewebe, das den Tribolium-Embryo vor verschiedenen Gefahren für den großteil seiner Embryogenese23,24schützt und schützt, auch als morphogenetischer "Treiber" für seinen eigenen Entzugsprozess während des rückenförmigen Verschlusses25fungiert. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass während der Gastrulation ein bestimmter Bereich des Blastoderms an der Vitelline-Membran verankert bleibt, um asymmetrische Gewebebewegungen zu erzeugen26 und dass die regionalisierte Gewebefluidisierung es den Zellen ermöglicht, die Serosa-Kante während des Serosa-Fensterverschlusses sequenziell zu verlassen27.

In allen oben genannten Drosophila-und Tribolium-assoziiertenStudien wurden kammerbasierte LSFMs verwendet. In den meisten wurde die Embryos in mehreren Richtungen mit hilfe der Probenrotationsfunktion aufgezeichnet. Obwohl nicht ausdrücklich angegeben, kann davon ausgegangen werden, dass sie einzeln und damit unabhängig voneinander in sequenziellen Live-Imaging-Assays aufgezeichnet wurden, ähnlich wie unsere früheren Arbeiten an Tribolium20,28. In bestimmten Szenarien ist ein solcher Ansatz akzeptabel, aber insbesondere bei quantitativen Vergleichsansätzen kann die Umgebungsvarianz die Ergebnisse verzerren. Zum Beispiel ist es seit langem bekannt, dass die Entwicklungsgeschwindigkeit von Insekten temperaturabhängigist 29, aber eine neuere Studie legt weiter nahe, dass in Drosophila,Temperatur kann auch die Konzentration von Morphogenen beeinflussen30. Sollten daher bestimmte Merkmale der Embryogenese, z. B. die dynamischen Proportionen, Teilungsraten und Migrationsgeschwindigkeiten der Zellen, genau quantifiziert werden, sind ausreichende Wiederholungen ohne Umgebungsvarianz erforderlich. Dies minimiert Standardabweichungen und Standardfehler, was wiederum die Gegenüberstellung mit anderen, auch nur geringfügig divergierenden Versuchsbedingungen erleichtert.

Beispielkammerbasierte LSFMs sind jedoch in erster Linie für Tests mit hohem Gehalt und nicht für Tests mit hohem Durchsatz konzipiert. Im Gegensatz zu konfokalen Mikroskopen, die typischerweise mit standardisierten Klemmmechanismen für Mikroskopien, Petrischalen und Brunnenplatten ausgestattet sind, verwenden fast alle probenkammerbasierten LSFMs zylinderbasierte Klemmmechanismen. Diese Mechanismen sind für kundenspezifische Probenhalter gedacht, die rotationskompatibel sowie nicht-invasive10sind, aber in der Regel nicht für mehr als eine Probe20,31,32ausgelegt sind. Ein Rahmen für die gleichzeitige Live-Bildgebung von zwei oder mehr Embryonen, bei dem die Vorteile von probenkammerbasierten Setups nicht beeinträchtigt werden, befasst sich mit dem Problem der Umgebungsvarianz und erhöht so den Wert von LSFMs für vergleichende Studien.

In unserem Protokoll stellen wir einen experimentellen Rahmen für die vergleichende Live-Bildgebung in probenkammerbasierten LSFMs (Abbildung 1A) vor, in dem die y-Achse als Option zum "Stapeln" von Embryonen verwendet wird. Erstens bieten wir eine fluoreszierende mikrosphärenbasierte Kalibrierrichtlinie für Probenkammer-basierte LSFMs an, was besonders für Instrumente wichtig ist, die keinen Kalibrierassistenten haben. Zweitens beschreiben wir ein Montageverfahren für mehrere Embryonen auf der Grundlage des Spinnwebenhalters28 (Abbildung 1B), das mit der Probenrotation kompatibel ist und somit die gleichzeitige Abbildung mehrerer Proben entlang mehrerer Richtungen ermöglicht (Abbildung 1C). Mehrere Embryonen werden auf einem dünnen Agarosefilm ausgerichtet und nach dem Einsetzen in die Probenkammer sukzessive durch das Lichtblatt bewegt, um dreidimensionale Bilder zu erhalten. Drittens bieten wir drei beispielhafte Live-Imaging-Datensätze für Drosophila sowie für Triboliuman. Für erstere stellen wir transgene Linien fluoreszierend gekennzeichneten Kernen gegenüber. Für letztere vergleichen wir die Leistung transgener Sublinien, die dasselbe Transgen tragen, aber an verschiedenen genomischen Stellen. Schließlich diskutieren wir die Bedeutung der Parallelisierung im Hinblick auf die vergleichende Live-Bildgebung und Umgebungsvarianz33, diskutieren die Durchsatzgrenze unseres experimentellen Rahmens und bewerten die Anpassung unseres Ansatzes an andere Modellorganismen.

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Protocol

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1. Vorbereitende Arbeiten

  1. Wählen Sie für den LSFM eine Beleuchtungslinse/Erkennungslinse/Kamera-Kombination, die der wissenschaftlichen Frage gerecht wird, und richten Sie das Mikroskop ein. Die Größe des Sichtfeldes ist der Quotient der Kamerachipgröße und die Vergrößerung der Erkennungslinse. Die Beleuchtungslinse sollte so gewählt werden, dass das gesamte Sichtfeld durch ein grob planares Lichtblatt34abgedeckt wird. Drei empfohlene Kombinationen sind in Tabelle 1aufgeführt.
  2. Um Agarose-Aliquots zuzubereiten und Geschirr zu holen, 2 g schmelzende Agarose zu 200 ml autoklaviertem Leitungswasser hinzufügen und das Gemisch in einer Mikrowelle bei 600-800 W erhitzen, bis alle Agarosepartikel gelöst sind. Bereiten Sie mehrere 1 ml Agarose-Aliquots in 1,5 ml oder 2 ml Reaktionsrohren vor, dann füllen Sie mehrere 90-mm-Petrischalen 3-5 mm hoch mit Agarose. Erstarrte Aliquots und Geschirr bei 4 °C lagern.
  3. Für Drosophila: Um frische Aufzuchtfläschchen zuzubereiten, kochen Sie eine ausreichende Menge an maßgeschneiderten oder kommerziell erhältlichen Drosophila Medium, übertragen Sie 5-15 ml in breite Fläschchen und lagern Sie sie bei 4 °C. Um Eierlegende Gerichte zuzubereiten, fügen Sie 1 g niedrigschmelzende Agarose zu 50 ml autoklaviertem Leitungswasser hinzu und erhitzen Sie die Mischung in einer Mikrowelle bei 600-800 W, bis sich alle Agarosepartikel auflösen. Die Mischung auf 45 °C abkühlen lassen, dann 50 ml Fruchtsaft (vorzugsweise Apfel oder rote Traube) hinzufügen und gründlich vermischen. Gießen Sie die Mischung in 35 mm, Petrischalen und lagern Sie erstarrte Eierlegeschalen bei 4 °C.
  4. Für Tribolium: Um das Wachstumsmedium vorzubereiten, geben Sie Vollweizenmehl sowie inaktive trockene Hefe durch ein 710 m Maschenmaß sieb, dann ergänzen Sie das gesiebte Mehl mit 5% (w/w) gesiebte Hefe. Um eilegendes Medium zuzubereiten, geben Sie feines Weizenmehl sowie inaktive trockene Hefe durch ein 250 m Maschennetzsieb, dann ergänzen Sie das gesiebte Mehl mit 5% (w/w) gesiebter Hefe.

2. Kalibrierung von Probenkammer-basierten LSFMs mit fluoreszierenden Mikrosphären

HINWEIS: Der Zweck der Kalibrierung besteht darin, die Brennpunkte der Beleuchtungs- und Detektionslinsen auszurichten (Abbildung 2A), da dies die Voraussetzung für klare Bilder ist. LSFMs sollten regelmäßig kalibriert werden, mindestens einmal alle 3-4 Wochen.

  1. Eine Agarose aliquot in einem Trockenblocker/Mischer bei 80 °C wieder verflüssigen, dann die Agarose aliquot auf 35 °C abkühlen lassen.
  2. Übertragen Sie 50 l Agarose in ein 1,5 ml Reaktionsrohr und fügen Sie 0,5 l fluoreszierende Mikrosphärenlösung hinzu. Mischen Sie bei 1.400 Rpm für 1 min.
  3. Füllen Sie das Schlitzloch des Spinnwebenhalters mit 10 l Agarose/Fluoreszenz-Mikrosphärenlösungsmischung, dann so viel Agarose wie möglich ansaugen, bis nur noch ein dünner Agarosefilm übrig bleibt. Warten Sie 30-60 s auf Erstarrung.
  4. Füllen Sie die Probenkammer mit autoklaviertem Leitungswasser. Setzen Sie den Spinnwebenhalter langsam in die Probenkammer ein und bewegen Sie das Geschlitzloch mit den Mikroübersetzungsstufen vor der Erkennungslinse.
  5. Drehen Sie den Spinnwebenhalter mit der Rotationsstufe auf eine 45°-Position relativ zur Beleuchtungsachse (x) und Erkennungsachse (z). Der Spinnwebenhalter sollte im Transmissionslichtkanal nicht sichtbar sein.
  6. Schalten Sie auf den jeweiligen Fluoreszenzkanal um und passen Sie die Laserleistung sowie die Belichtungszeit so an, dass die fluoreszierenden Mikrosphären ein richtiges Signal liefern.
  7. Geben Sie ein Bildvolumen an, das den nun quer ausgerichteten Agarosefilm vollständig abdeckt. Definieren Sie den z-Abstand, indem Sie die maximal mögliche axiale Auflösung für die jeweilige Beleuchtungslinsen-/Erkennungslinsenkombination34berechnen. Alternativ kann die 4-fache seitliche Auflösung als grobe Annäherung verwendet werden.
  8. Zeichnen Sie einen dreidimensionalen Test-z-Stack der fluoreszierenden Mikrosphären auf und vergleichen Sie die maximalen x-, y- und z-Projektionen mit dem Kalibrierdiagramm (Abbildung 2). Wenn die Mikrosphären verschwommen, unscharf und/oder verzerrt erscheinen (Abbildung 2B,C), passen Sie die Positionen der Beleuchtungs- und/oder Erkennungslinse an.

3. Sammlung von Drosophila-Embryonen

  1. Übertragen Sie 100-200 Erwachsene der Drosophila-Linie ihrer Wahl 2-3 Tage vor dem bildgebenden Assay auf eine frische Aufzuchtfläschung, um eine Eiersammelkultur zu etablieren. Wenn noch nicht vorhanden, erwägen Sie, die alte Aufzucht-Fläschigkeit zu verwenden, um eine Nachkommenkultur zu starten. Um sicherzustellen, dass Erwachsene nicht mehr als zwei Wochen alt sind, ersetzen Sie die Embryo-Sammlungskultur rechtzeitig durch die Nachkommenkultur.
  2. Erwärmen Sie eine Eilegende auf Raumtemperatur und fügen Sie einen Tropfen Hefepaste auf den Agar.
  3. Übertragen Sie die Erwachsenen aus der Eiersammelkultur in eine leere schmale Durchstechflasche und legen Sie sie auf die Eierlegeschale. Inkubieren Sie die Ei-Sammlung Einrichtung bei Raumtemperatur für 15 min. Vermeiden Sie anästhesie (kalt, CO2) während dieses Schritts, wenn möglich.
  4. Bringen Sie die Erwachsenen in die Aufzuchtfläschung zurück. Die Eilegende in einer praktischen Temperatur-Zeit-Kombination bebrüten und dann 10-20 Embryonen mit einem kleinen Pinsel von der Eilegende auf ein 100 m Maschennetz-Zellsieb übertragen. Entsorgen Sie die Eierlegeschale.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 3.4 für jede Drosophila-Linie.

4. Sammlung von Tribolium-Embryonen

HINWEIS: Der Einfachheit halber wird ein Schema des Tribolium-Ei-Entnahmeverfahrens (Abbildung 3A) bereitgestellt, auf das sich auch die Zahlen innerhalb der Klammern in diesem Schritt beziehen.

  1. 200-300 Erwachsene (ca. 400-700 mg) der Tribolium-Linie nach Wahl in eine leere 1 L Glasflasche 2-10 Tage vor dem bildgebenden Assay übertragen, um eine Eiersammelkultur zu etablieren (Abbildung 3A_01). Füllen Sie die Flasche mit 50-100 g frischem Wachstumsmedium. Wenn noch nicht vorhanden, erwägen Sie, eine Nachkommenkultur mit verfügbaren Larven und Pupae zu starten. Um sicherzustellen, dass Erwachsene nicht älter als 3 Monate sind, ersetzen Sie die Eiersammelkultur rechtzeitig durch die Nachkommenkultur.
  2. Übergeben Sie die Eiersammelkultur durch ein Sieb der Maschengröße von 800 m (Abbildung 3A_02). Geben Sie das Wachstumsmedium, das nicht inszenierte Embryonen enthält, in die Ausgangsflasche zurück (Abbildung 3A_03) und übertragen Sie Erwachsene in eine leere 1 L Glasflasche(Abbildung 3A_04). Fügen Sie 10 g Ei-Legenmedium hinzu (Abbildung 3A_05) und inkubieren Sie die Ei-Sammlung bei Raumtemperatur für 1 h (Abbildung 3A_06,07).
  3. Übergeben Sie die Ei-Sammlung-Setup durch die 800 m Maschenweite Sieb(Abbildung 3A_08). Kehren Sie Erwachsene zu ihrer ursprünglichen Flasche zurück (Abbildung 3A_09). Je nach dem zu bebildernden Entwicklungsprozess das Eiablagemedium, das jetzt etwa 30-100 Embryonen enthält, bei einer praktischen Temperatur-Zeit-Kombination inkubieren (Abbildung 3A_10).
  4. Übergeben Sie das Eilegendesmittel durch das Sieb der Maschenöffnung von 300 m (Abbildung 3A_11) und übertragen Sie die Embryonen (Abbildung 3A_12) auf ein 100 m Maschennetz-Zellsieb. Entsorgen Sie die gesiebten Eiablagemedien (Abbildung 3A_13).
  5. Wiederholen Sie die Schritte 4.1 bis 4.4 für jede Tribolium-Linie.

5. Natriumhypochlorit-basierte Dechorionation

HINWEIS: Sowohl Drosophila- als auch Tribolium-Embryonen werden von einer Chorion bedeckt, einer schützenden und stark lichtdurchstreuenden Proteinschicht, die für die richtige Entwicklung nicht wesentlich ist, solange die Embryonen nach der Entfernung feucht gehalten werden. Das Dechorionationsprotokoll für die Embryonen beider Arten ist identisch.

  1. Bereiten Sie eine 6-Well-Platte vor, indem Sie die Brunnen A1, A2, A3 und B3 mit 8 ml autoklaviertem Leitungswasser und die B1- und B2-Brunnen mit 7 ml autoklaviertem Leitungswasser und 1 ml Natriumhypochlorit (NaOCl) Lösung füllen (Abbildung 3B). Beobachten Sie den Dechorionationsprozess unter einem Stereomikroskop, idealerweise bei Überlicht.
    VORSICHT: Natriumhypochlorit ist ätzend.
  2. Setzen Sie das embryohaltige Zellsieb (Schritt 3.4 und/oder 4.4) in den A1-Brunnen ein und waschen Sie die Embryonen etwa 30-60 s unter sanfter Erregung.
  3. Das Zellsieb gut auf den B1 bewegen und die Platten 30 s kräftig schütteln, dann auf den A2-Brunnen übertragen und die Embryonen 1 min unter sanfter Erregung waschen.
  4. Das Zellsieb gut auf den B2-Brunnen bewegen und die Platte kräftig schütteln, bis die meisten Embryonen vollständig dechorioniert sind (Abbildung 3C), dann auf den A3-Brunnen übertragen und die Embryonen 1 min unter sanfter Erregung waschen.
  5. Bewahren Sie das Zellsieb im B3 gut auf, bevor Sie mit dem Montageverfahren fortfahren.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 5.1 bis 5.5 für jede Zeile.

6. Montage mehrerer Embryonen mit dem Spinnwebenhalter

  1. Eine Agarose aliquot in einem Trockenblocker/Mischer bei 80 °C wieder verflüssigen, dann die Agarose aliquot auf 35 °C abkühlen lassen.
  2. Pipetten Sie 10 l Agarose auf dem Schlitzloch des Spinnwebenhalters. Mit der Pipettenspitze die Agarose über das Schlitzloch verteilen, dann so viel Agarose wie möglich aspirieren, bis nur noch eine dünne Agarosefolie übrig bleibt. Warten Sie 30-60 s auf Erstarrung.
  3. Für jede Linie einen oder mehrere Embryonen sorgfältig mit einem kleinen Pinsel auswählen und auf den Agarosefilm legen.
  4. Ordnen Sie die Embryonen entlang der langen Achse des Schlitzlochs an, und richten Sie dann auch ihre vordere hintere Achse an der langen Achse des Schlitzlochs aus (Abbildung 3D).
  5. Stabilisieren Sie die Embryonen sorgfältig, indem Sie 1-2 l Agarose in den Spalt zwischen den Embryonen und dem Agarosefilm pfeifen. Warten Sie 30-60 s auf Erstarrung.
  6. Legen Sie den Spinnwebenhalter mit den montierten Embryonen langsam in die mit Bildpuffergefüllte Probenkammer ein.

7. Vergleichende Live-Bildgebung in Probenkammer-basierten LSFMs

  1. Bewegen Sie einen der Embryonen mit den Mikroübersetzungsstufen vor die Detektionslinse. Stellen Sie sicher, dass sich der Spinnwebenhalter in einer 45°-Position relativ zu den Beleuchtungsachsen (x) und der Erkennungsachse (z) befindet (vgl. Abbildung 1C).
  2. Bewegen Sie den Embryo im Transmissionslichtkanal in die Mitte des Sichtfeldes. Der Spinnwebenhalter sollte nicht sichtbar sein.
  3. Bewegen Sie den Embryo mit den Mikrotranslationsstufen in z, bis sich die Mittelebene des Embryos mit der Brennebene überlappt, d.h. bis der Umriss scharf erscheint. Ohne auf den Fluoreszenzkanal umzuschalten, geben Sie das Bildvolumen an, indem Sie 250 m von der Mittelebene in beide Richtungen bewegen.
  4. Optional, wenn eine Bildgebung in mehreren Richtungen erforderlich ist, drehen Sie den Embryo entsprechend und wiederholen Sie die Schritte 7.2 und 7.3. Der Spinnwebenhalter unterstützt bis zu vier Ausrichtungen in Schritten von 90°.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 7.1 bis 7.3 (oder 7.4) für alle anderen Embryonen, die auf dem Spinnwebenhalter montiert sind (Abbildung 3E). Stellen Sie sicher, dass der oberste Embryo den bildgebenden Puffer nicht verlässt, wenn sich der unterste Embryo vor der Detektionslinse befindet.
  6. Definieren Sie die Fluoreszenzkanalparameter (Laserleistung, Belichtungszeit, Detektionsfilter) und Zeitrafferparameter (Intervall, Gesamtdauer) und starten Sie den Bildgebungsprozess. Indikative Werte finden Sie in der Metadatentabelle der Beispieldatensätze (Ergänzende Tabelle 1). Bei Assays, die mehrere Tage dauern, sollten Sie die Probenkammeröffnung zumindest teilweise abdecken, um die Verdunstung zu reduzieren.

8. Rückgewinnung und weitere Kultivierung von abgebildeten Embryonen

  1. Wenn der bildgebende Test beendet ist, entfernen Sie vorsichtig den Spinnwebenhalter aus der Probenkammer.
  2. Lösen Sie die Embryonen mit einem kleinen Pinsel aus dem Agarosefilm und übertragen Sie sie auf ein entsprechend beschriftetes Mikroskopschlitten. Legen Sie die Rutsche in eine Retrievalschale und brüten Sie unter den jeweiligen Standard-Aufzuchtbedingungen.
  3. In Bezug auf die experimentellen Modalitäten, schätzen, wann embryogenese abgeschlossen ist. Wenn sich der Brutzeitpunkt nähert, überprüfen Sie häufig die Retrieval-Gerichte und übertragen Sie geschlüpfte Drosophila-Larven auf einzelne Aufzuchtfläschchen und Triboliumlarven auf einzelne Brunnen einer 24-Well-Platte. Füllen Sie die Brunnen bis zur Hälfte mit Wachstumsmedium. Unter den jeweiligen Standardhaltungsbedingungen inkubieren.
  4. Sobald die beobachteten Personen Erwachsene sind, stellen Sie ihnen einen geeigneten Paarungspartner zur Verfügung und überprüfen Sie nach mehreren Tagen auf Nachkommenschaft.

9. Bilddatenverarbeitung und Metadatendokumentation

HINWEIS: Für die Bilddatenverarbeitung wird das ImageJ-Derivat FIJI35 empfohlen (imagej.net/Fiji/Downloads). FIJI erfordert keine Installation und 32- sowie 64-Bit-Versionen sind verfügbar. Eines der am häufigsten verwendeten Formate für LSFM-Daten ist das markierte Bilddateiformat (TIFF), das die Speicherung von Bildstapeln in Form eines TIFF-Containers ermöglicht.

  1. Berechnen Sie die z maximalen Projektionen für alle z-Stacks(Bild | Stacks | Z-Projekt, wählen Sie Max Intensity). Maximale Projektionen sind Datenvereinfachungsansätze, die die Anzahl der räumlichen Dimensionen von drei auf zwei reduzieren. Ein FIJI-Skript für die Stapelverarbeitung wird bereitgestellt (Zusatzdatei 1).
  2. Verketten Sie die jeweiligen z maximalen Projektionen, um Zeitstapel (t-Stacks) zu erstellen. Speichern Sie diese in einem TIFF-Container. Tun Sie dies für alle aufgezeichneten Embryonen sowie die jeweiligen Richtungen und Fluoreszenzkanäle, falls zutreffend.
  3. Drehen Sie den z- und t-Stapel um die z-Achse, um die vordere hintere Achse der Embryonen an der x- oder y-Bildachse auszurichten(Bild | Transform-| Drehen). Schneiden Sie die z-Stacks entlang aller drei Bildachsen und des t-Stacks in den x- und y-Bildachsen zu, so dass nur minimaler Pufferraum (20-40 Pixel entlang der x- und y-Achse, 5-10 Bilder entlang der z-Achse) um den Embryo herum bleibt(Bild | Anpassen | Canvas-Größe für die x- und y-Achsen, Bild | Stacks | Werkzeuge | Slice Keeper für die z-Achse).
    1. Tun Sie dies einzeln für alle aufgezeichneten Embryonen sowie die jeweiligen Richtungen, falls zutreffend. Gegebenenfalls sollten Fluoreszenzkanäle mit identischen Rotations- und Zuschneideparametern verarbeitet werden.
  4. Dokumentieren Sie die Metadaten so detailliert wie möglich. Als Richtlinie kann die Metadatentabelle der Beispiel-Datasets verwendet werden, die im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse aufgeführt sind (ergänzende Tabelle 1).

10. Datenvisualisierung

HINWEIS: Diese Datenvisualisierungsrichtlinie konzentriert sich in erster Linie auf die Erstellung von z maximalen Projektionsbildmatrizen, die mehrere aufgezeichnete Embryonen entlang mehrerer Richtungen und/oder im Laufe der Zeit zeigen. Die folgenden Schritte beschreiben die Datenvisualisierungsprozedur, die auf die Beispiel-Datasets für die Erstellung der angezeigten Abbildungen und Videos angewendet wurde, die im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse verknüpft sind.

  1. Kombinieren Sie t-Stacks aus mehreren Richtungen(Bild | Stacks | Werkzeuge | Kombinieren) und/oder mehrere Fluoreszenzkanäle zusammenführen (Bild | Farbe | Merge Channels), um die biologische Struktur und/oder den Prozess von Interesse zu visualisieren.
  2. Anpassen der Intensitäten der t-Stacks(Bild | Anpassen | Helligkeit/Kontrast) nach Bedarf mit der Funktion "Set" verwenden. Der angezeigte Mindestwert sollte leicht über dem Hintergrundsignal eingestellt werden, der maximal angezeigte Wert sollte zu einem bequemen Kontrast führen. Dokumentieren Sie beide Werte, da sie für eine konsistente Anpassung der jeweiligen z-Stacks verwendet werden können. Impressumsanpassungen mit der Funktion "Anwenden". Je nach den experimentellen Modalitäten sollten Sie alle aufgezeichneten Embryonen mit identischen Werten verarbeiten.
  3. Speichern Sie intensitätsangepasste t-Stacks als separate Dateien, überschreiben Sie die nicht angepassten t-Stacks nicht. Geeignete Sub-Stacks aus den angepassten t-Stacks mit dedizierten Bildauswahlfunktionen (z.B. Image | Stacks | Werkzeuge | Slice Keeper) und verwenden Sie das Montagewerkzeug(Bild | Stacks | Erstellen Sie Montage), um Bildraster zu erstellen, die für den Abbildungsentwurf verwendet werden können.

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Results

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Unser Protokoll beschreibt einen experimentellen Rahmen für die vergleichende Fluoreszenz-Live-Bildgebung in Probenkammer-basierten LSFMs. Beispielsweise kann das Rahmenwerk verwendet werden, um (i) Embryonen von zwei oder mehr Arten, (ii) Embryonen von Linien, in denen ein oder mehrere Gene ausgeschlagen werden, plus Wildtypkontrollen, (iii) mehrere Embryonen derselben transgenen Linie, (iv) Embryonen aus verschiedenen transgenen Linien oder (v) Embryonen aus Unterlinien, die die gleiche Transgene tragen, gegenüberzuste...

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Discussion

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Eines der exklusiven Anwendungsbereiche von LSFMs ist die Entwicklungsbiologie. In dieser Disziplin ist es wichtig, lebende Exemplare zu betrachten, da sonst morphogenetische Prozesse nicht dynamisch beschrieben werden können. Ein experimenteller Rahmen für die gleichzeitige Live-Bildgebung in Probenkammer-basierten LSFMs, wie hier beschrieben, ist aus zwei Hauptgründen praktisch.

Umgebungsvarianz, die in der sequentiellen Live-Bildgebung unvermeidbar ist, kann proaktiv angegangen werden. In d...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Ernst H. K. Stelzer für die Gelegenheit, seine Ressourcen zu nutzen, sowie seine wertvollen Kommentare zum Manuskript, Anita Anderl für die Unterstützung mit dem Tribolium Live Imaging, Sven Plath für die technische Unterstützung sowie Ilan Davis, Nicole Grieder und Gerold Schubiger für die gemeinsame Nutzung ihrer transgenen Drosophila-Linien über das Bloomington Stock Center.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
6-Well-PlatteOrange Scientific4430500 
24-Well-PlatteOrange Scientific4430300Nur für Live-Bildgebung mit Tribolium
35 mm & Oslash; PetrischaleFisher Scientific153066Nur für Live-Bildgebung mit Drosophila.
90 mm & Oslash; PetrischaleFisher ScientificL9004575
100 µ m Maschenweite ZellsiebBD Biosciences352360
250 µ m Maschenweite SiebVWR International200.025.222-038Nur für Live-Aufnahmen mit Tribolium
300 µ m Maschenweite SiebVWR International200.025.222-040Nur für Live-Imaging mit Tribolium
710 µ m Maschenweite SiebVWR International200.025.222-050Nur für Live-Bildgebung mit Tribolium
800 µ m Maschenweite SiebVWR International200.025.222-051Nur für Live-Imaging mit Tribolium
405 feinem WeizenmehlDemeter e.V.SP061006Nur für Live-Bildgebung mit Tribolium
kommerziell erhältlichem Drosophila-MediumGenesee Scientific66-115Nur für Live-Bildgebung mit Drosophila / Maßgeschneidertes Drosophila-Medium kann auch verwendet werden
Fluoreszierende Mikrosphären, 1,0 & Mikro-Strahlung. m & Oslash;Thermo Fisher ScientificT7282
inaktive TrockenhefeGenesee Scientific62-108
Low-Melt AgaroseCarl Roth6351.2
schmale FläschchenGenesee Scientific32-109Nur für Live-Bildgebung mit Drosophila
smallPinsel VWR International149-2121
Natriumhypochlorit (NaOCl), ~12% aktiv ClCarl Roth9062.3Achtung: Natriumhypochlorit ist ätzend
VollkornmehlDemeter e.V.SP061036Nur für Live-Bildgebung mit Tribolium / Vereinigtes Königreich:
breite DurchstechflaschenGenesee Scientific32-110Nur für Live-Aufnahmen mit Drosophila
aus Vollkornmehl

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