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Messung von 3-dimensionalen cAMP-Verteilungen in lebenden Zellen mittels 4-dimensionaler (x, y, z und λ) hyperspektraler FRET-Bildgebung und -Analyse

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DOI:

10.3791/61720

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27. Oktober 2020

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1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Aufgrund des inhärenten niedrigen Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR) von Fӧrster-Resonanz-Energieübertragungssensoren (FRET) war die Messung von cAMP-Signalen eine Herausforderung, insbesondere in drei räumlichen Dimensionen. Hier beschreiben wir eine hyperspektrale FRET-Bildgebungs- und Analysemethodik, die die Messung der cAMP-Verteilung in drei räumlichen Dimensionen ermöglicht.

Zusammenfassung

Cyclic AMP ist ein zweiter Botenstoff, der an einer Vielzahl von zellulären und physiologischen Aktivitäten beteiligt ist. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass cAMP-Signale kompartimentiert sind und dass die Kompartimentierung zur Signalspezifität innerhalb des cAMP-Signalwegs beiträgt. Die Entwicklung von FRET-basierten Biosensoren (Fӧrster resonance energy transfer) hat die Fähigkeit zur Messung und Visualisierung von cAMP-Signalen in Zellen gefördert. Diese Messungen beschränken sich jedoch oft auf zwei räumliche Dimensionen, was zu Fehlinterpretationen von Daten führen kann. Bisher gab es nur sehr begrenzte Messungen von cAMP-Signalen in drei räumlichen Dimensionen (x, y und z), aufgrund der technischen Einschränkungen bei der Verwendung von FRET-Sensoren, die von Natur aus ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) aufweisen. Darüber hinaus sind herkömmliche filterbasierte Bildgebungsansätze aufgrund einer Reihe von Faktoren, einschließlich spektralem Übersprechen, begrenzter Signalstärke und Autofluoreszenz, oft unwirksam für die genaue Messung von cAMP-Signalsignalen in lokalisierten subzellulären Regionen. Um diese Einschränkungen zu überwinden und die Verwendung von FRET-basierten Biosensoren mit mehreren Fluorophoren zu ermöglichen, haben wir hyperspektrale FRET-Bildgebungs- und Analyseansätze entwickelt, die spektrale Spezifität für die Berechnung von FRET-Wirkungsgraden und die Fähigkeit bieten, FRET-Signale spektral von verwirrender Autofluoreszenz und / oder Signalen von zusätzlichen fluoreszierenden Markierungen zu trennen. Hier stellen wir die Methodik zur Implementierung der hyperspektralen FRET-Bildgebung sowie die Notwendigkeit vor, eine geeignete Spektralbibliothek zu konstruieren, die weder unter- noch übersampelt ist, um eine spektrale Entmischung durchzuführen. Während wir diese Methodik zur Messung dreidimensionaler cAMP-Verteilungen in pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen (PMVECs) vorstellen, könnte diese Methodik verwendet werden, um räumliche Verteilungen von cAMP in einer Reihe von Zelltypen zu untersuchen.

Einleitung

Cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) ist ein zweiter Botenstoff, der an wichtigen zellulären und physiologischen Prozessen wie Zellteilung, Kalziumzufluss, Gentranskription und Signaltransduktion beteiligt ist. Eine wachsende Zahl von Beweisen deutet auf die Existenz von cAMP-Kompartimenten in der Zelle hin, durch die die Signalspezifität erreicht wird1,2,3,4,5,6,7. Bis vor kurzem wurde die cAMP-Kompartimentierung auf der Grundlage verschiedener physiologischer oder zellulärer Effekte abgeleitet, die von verschiedenen G-gekoppelten Rezeptoragonisten induziert wurden8,9,10,11. In jüngerer Zeit haben FRET-basierte Fluoreszenzbildgebungssonden neue Ansätze für die direkte Messung und Beobachtung von cAMP-Signalen in einer Zelle12,13,14geliefert.

Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) ist ein physikalisches Phänomen, bei dem die Energieübertragung zwischen Donor- und Akzeptormolekülen in einer nicht-strahlenden Weise stattfindet, wenn sich die Moleküle in unmittelbarer Nähebefinden 15,16. Mit der Entwicklung von FRET-basierten Fluoreszenzindikatoren wurde dieses physikalische Phänomen in biologischen Anwendungen verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen17, Protein-Co-Lokalisation18, Ca+2-Signalisierung 19, Genexpression20, Zellteilung21 und zyklische Nukleotidsignalisierung zu untersuchen. FRET-basierte cAMP-Indikatoren bestehen typischerweise aus einer cAMP-Bindungsdomäne, einem Donorfluorophor und einem Akzeptorfluorophor22. Zum Beispiel besteht der H188 cAMP-Sensor12,22, der in dieser Methodik verwendet wird, aus einer cAMP-Bindungsdomäne, die aus Epac gewonnen wird und zwischen Türkis- (Spender-) und Venus- (Akzeptor) Fluorophoren liegt. Bei basalen Bedingungen (ungebunden) sind Türkis und Venus in einer Ausrichtung, so dass FRET zwischen den Fluorophoren auftritt. Bei der Bindung von cAMP an die Bindungsdomäne tritt eine Konformationsänderung auf, so dass sich Türkis und Venus auseinander bewegen, was zu einer Abnahme der FRET führt.

FRET-basierte Bildgebungsansätze bieten ein vielversprechendes Werkzeug zur Untersuchung und Visualisierung von cAMP-Signalen innerhalb einer Zelle. Aktuelle FRET-basierte mikroskopische Bildgebungsverfahren sind jedoch oft nur teilweise erfolgreich, um eine ausreichende Signalstärke zu erreichen, um FRET mit subzellulärer räumlicher Klarheit zu messen. Dies ist auf mehrere Faktoren zurückzuführen, darunter die begrenzte Signalstärke vieler FRET-Reporter, die hohe Präzision, die erforderlich ist, um Änderungen der FRET-Effizienz genau zu quantifizieren, und das Vorhandensein von Störfaktoren wie zellulärer Autofluoreszenz23,24. Das Ergebnis ist oft ein FRET-Bild, das von schwachem SNR geplagt wird, was die Visualisierung subzellulärer Veränderungen in FRET sehr schwierig macht. Darüber hinaus wurde die Untersuchung von räumlich lokalisierten cAMP-Signalen fast ausschließlich in nur zwei räumlichen Dimensionen durchgeführt und die axiale cAMP-Verteilung wurde selten berücksichtigt25. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass ein niedriger SNR die Fähigkeit behinderte, cAMP-Gradienten in drei räumlichen Dimensionen zu messen und zu visualisieren. Um die Einschränkungen bei der Verwendung von FRET-Sensoren mit niedrigem SNR zu überwinden, haben wir hyperspektrale Bildgebungs- und Analyseansätze zur Messung von FRET in einzelnen Zellen25,26,27implementiert.

Hyperspektrale Bildgebungsansätze wurden von der NASA entwickelt, um terrestrische Objekte in Satellitenbildern zu unterscheiden28,29. Diese Techniken wurden seitdem in das Fluoreszenzmikroskopiefeld30übersetzt, wobei mehrere kommerzielle konfokale Mikroskopsysteme Spektraldetektoren anbieten. Bei der traditionellen (nicht-spektralen) Fluoreszenzbildgebung wird die Probe mit einem Bandpassfilter oder einer Laserlinie angeregt, und die Emission wird mit einem zweiten Bandpassfilter gesammelt, der oft so ausgewählt wird, dass er der Maximalen Emissionswellenlänge des Fluorophors entspricht. Im Gegensatz dazu versuchen hyperspektrale Bildgebungsansätze, ein vollständiges spektrales Profil entweder der Fluoreszenzemission26,31,32 oder der Anregung 33,34in bestimmten Wellenlängenintervallen zu testen. In unseren früheren Studien haben wir gezeigt, dass hyperspektrale Bildgebungs- und Analyseansätze im Vergleich zu herkömmlichen filterbasierten FRET-Bildgebungsverfahren eine verbesserte Quantifizierung von FRET-Signalen in Zellen bieten können26. Hier stellen wir eine Methodik zur Durchführung von 4-dimensionalen (x, y, z und λ) hyperspektralen FRET-Bildgebung und -Analyse vor, um cAMP-Verteilungen in drei räumlichen Dimensionen zu messen und zu visualisieren. Diese Ansätze haben die Visualisierung von agonisteninduzierten cAMP-Raumgradienten in einzelnen Zellenermöglicht 25. Interessanterweise können je nach Agonist cAMP-Gradienten in Zellen sichtbar sein. Die hier vorgestellte Methodik nutzt die spektrale Entmischung von ungleichmäßigem Hintergrund und zellulärer Autofluoreszenz, um die Genauigkeit der FRET-Messungen zu verbessern. Während diese Methodik in pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen (PMVECs) mit einem cAMP FRET-Biosensor demonstriert wird, könnte die Methodik leicht für die Verwendung mit alternativen FRET-Reportern oder alternativen Zelllinien modifiziert werden.

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Protokoll

Dieses Protokoll folgt Verfahren, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of South Alabama genehmigt wurden.

1. Zell-, Proben- und Reagenzienvorbereitung für die Bildgebung

  1. Isolieren Sie pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen (PMVECs) von Ratten wie zuvor beschrieben35.
    HINWEIS: Die Zellen wurden vom Zellkulturkern an der University of South Alabama, Mobile, AL, auf 100-mm-Zellkulturschalen isoliert und kultiviert.
  2. Samenisolierte PMVECs auf 25 mm runden Glasdeckeln und lassen sie im Inkubator bei 37 °C wachsen, bis die Zellen mindestens 80% Konfluenz erreichen (mindestens 24 Stunden).
    HINWEIS: Zellen und Zelltyp können von Studie zu Studie variieren, und daher sollten zellspezifische Zellkulturverfahren befolgt werden, um Zellen zu säen und zu züchten. Das in diesen Studien verwendete Zellaussaat- und Kultivierungsprotokoll ist als ergänzende Information in der Datei "Supplemental File_Cell Culture and Transfection" verfügbar.
  3. PmVECs mit einem FRET-Biosensor transfizieren und 48 Stunden bei 37 °C inkubieren.
    HINWEIS: Das Protokoll zur Transfektierung von PMVECs wird auch in der ergänzenden Informationsdatei "Supplemental File_Cell Culture and Transfection" beschrieben.
  4. Am Tag der Bildgebung tyrodes Puffer in einem Wasserbad auf 37 °C erwärmen.
    HINWEIS: Tyrodes Puffer besteht aus 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM Glucose, 1 mM MgCl2 und 1 mM CaCl2
  5. Montieren Sie einen Abdeckrlip mit transfizierten Zellen in einer Zellkammer und befestigen Sie die Oberseite mit einer Montagedichtung, um ein Auslaufen zu verhindern.
  6. Wischen Sie die Unterseite des Abdecks mit einem empfindlichen Aufgabentuch ab, um überschüssige Medien oder anhaftende Zellen zu reinigen.
  7. 800 μL Arbeitspuffer und 4 μL 5 mM Kernmarkmark in die Zellkammer geben und 5 – 10 Sekunden sanft schaukeln.
    HINWEIS: Wenn Sie Puffer- oder Reagenzlösungen zu in der Zellkammer montierten Abdeckren hinzufügen, stellen Sie sicher, dass Sie die Lösung vorsichtig und an der Seite der Zellkammer hinzufügen, um adhärente Zellen nicht zu verdrängen. Die Zugabe von 4 μL 5 mM Kernmarkmark zu 800 μL Puffer ergibt eine Endkonzentration von 25 μM Kernmarkmark. Für lose haftbare Zellen wie HEK293-Zellen mischen Sie zuerst Kernmarkmark und Puffer in einer Durchstechflasche und fügen Sie sie dann zu den in der Zellkammer montierten Abdeckungslippen hinzu. Dies verhindert, dass die Zellen von der Abdeckung abgezogen werden.
  8. Decken Sie die Zellkammer zum Schutz vor Licht mit Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur.
  9. Reagenzvorbereitung: 1 μL 50 mM Forskolin zu 199 μL Puffer hinzufügen. Dies führt zu einer Endkonzentration von Forskolin von 50 μM, wenn sie zu Zellen hinzugefügt wird, die mit 800 μL Puffer hergestellt wurden. 1 μL DMSO in 199 μL Puffer sollte auch für die Verwendung als Fahrzeugsteuerung vorbereitet werden.
    HINWEIS: In diesen Studien wird Forskolin als Adenylylcyclase-Aktivator verwendet, um die cAMP-Produktion zu stimulieren. Falls gewünscht, kann diese Methodik leicht modifiziert werden, um eine Behandlung mit alternativen Reagenzien zur Stimulation oder Hemmung von Adenylylcyclase, Phosphodiesterasen usw. zu ermöglichen.

2. Bilderfassung

  1. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, das mit einem Spektraldetektor ausgestattet ist.
    HINWEIS: Alle hier beschriebenen Bildaufnahmeschritte wurden mit einem handelsüblichen Nikon A1R Mikroskopsystem entwickelt. Diese Schritte müssen möglicherweise angepasst werden, wenn ein alternatives Spektralmikroskop verwendet wird. Stellen Sie sicher, dass alle Geräte mindestens 30 Minuten vor Beginn des Experiments eingeschaltet sind, um stabile Betriebsbedingungen zu erreichen.
  2. Wählen Sie das 60-fache Wasserimmersionsziel und fügen Sie dem Objektiv einen Tropfen Wasser hinzu.
    HINWEIS: Für hochauflösende Live-Cell-Bildgebung wird empfohlen, ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur zu verwenden. Bitte beachten Sie die Liste der Materialien für Informationen über das in diesen Studien verwendete Ziel.
  3. Legen Sie die beladene Zellkammer (ab Schritt 1.7) auf den Mikroskopstand.
  4. Wählen Sie den DFT-Filtersatz (DAPI/FITC/TRITC) aus, indem Sie den Filterknopf auf der rechten Seite des Mikroskops einstellen.
  5. Betreiben Sie das Mikroskop im Fluoreszenz-Weitfeldmodus mit den Okularen, um ein Sichtfeld auszuwählen, das Zellen enthält, die den cAMP FRET-Sensor exprimieren.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die durchschnittliche Intensität des FRET-Signals an der Spitzenwellenlänge der Donor- oder Akzeptoremission in der ausgewählten Zelle mindestens 100 Intensitätseinheiten (A.U.) oder mindestens das 4-fache des Basissignals einer Region ohne exprimierende Zellen beträgt. Dies kann mit dem in der NIS Elements-Software verfügbaren Spektrumprofil-Viewer bestätigt werden. Bei der Suche nach einer Zelle mit gutem Signal ist es ratsam, übermäßig helle Zellen zu verwerfen (sie können kompromittiert sein).
  6. Öffnen Sie die NIS-Software, wechseln Sie in den konfokalen Modus, entsperren Sie die Laser-Interlock-Taste und klicken Sie auf Live.
  7. Verwenden Sie den Fokusknopf, um sich auf die Zellen zu konzentrieren, indem Sie sich die Vorschau auf dem Bildschirm ansehen.
  8. Konfigurieren Sie geräte-, erfassungs- und Z-Stack-Einstellungen in der Software, wie unten beschrieben.
  9. Erfassungseinstellungen:
    HINWEIS: Kamera- und Geräteerfassungseinstellungen können mithilfe eines zuvor aufgenommenen Bildes angewendet werden. Öffnen Sie das Bild, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Kameraeinstellungen wiederverwenden.
    1. Öffnen Sie das A1-Einstellungsmenü, aktivieren Sie die Kontrollkästchen für 405 nm und 561 nm Laserlinien, wählen Sie SD für Spektraldetektor, wählen Sie 10 für Auflösung und 31 für Kanäle.
      HINWEIS: Das A1-Einstellungsmenü wird als kleines Zahnradsymbol in der oberen linken Ecke des Fensters A1 Plus-Einstellungen angezeigt. Der 405-nm-Laser wird für die Donor-Anregung und der 561-nm-Laser für die Anregung von Kernmarkierungen verwendet.
    2. Legen Sie den Wellenlängenbereich (410 – 730 nm) fest, indem Sie Start- und Endwellenlängenwerte auswählen.
    3. Klicken Sie im Menü A1-Einstellungen auf das Symbol zum Binning/Überspringen, wählen Sie das Feld mit der Nummer 15 aus, und klicken Sie dann im Menü A1-Einstellungen auf OK.
      HINWEIS: Dies dient dazu, den Wellenlängenkanal zu entfernen, der dem 561-nm-Anregungslaser entspricht (dies ist typischerweise der15. Wellenlängenkanal). Es ist wichtig, dieses Wellenlängenband nicht zu verwenden, um ein künstlich niedriges Signal zu vermeiden, das ein spektrales Artefakt erzeugen kann. Das Signal ist in diesem Band aufgrund des mechanischen Fingers, der das Detektorelement bedeckt, um es vor Laserschäden zu schützen, niedriger.
    4. Stellen Sie die Laserdicken für die Laser 405 nm bzw. 561 nm auf 8% bzw. 2% ein, Si Hv (Detektorverstärkung) bei 149 und einen Lochradius von 2,4 luftigen Scheibeneinheiten (AU).
      HINWEIS: Die Laserdicken müssen möglicherweise je nach Alter des Instruments und Zustand der Laser angepasst werden. Bei der Anpassung der Laserdicken zwischen verschiedenen Proben oder Versuchsgruppen ist es wichtig, das gleiche Verhältnis der Laserdicken (z. B. 8:2) beizubehalten. Darüber hinaus ist es wichtig, eine Laserintensität zu wählen, die nicht so hell ist, dass eine schnelle Photobleachung entsteht. Die Detektorverstärkung sollte angepasst werden, um die Signalintensität zu maximieren und gleichzeitig das Detektorrauschen zu minimieren. Für diese Studien wurde ein Gewinn von 149 verwendet. Eine Lochgröße von 2,4 AE wurde als Ausgleich zwischen der Aufnahme von Bildern mit ausreichendem Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) und der Aufrechterhaltung der optischen Schnitte (Konfoalität) gewählt. Eine Zunahme der Lochgröße erhöht den SNR, verringert aber die Konfoalität.
    5. Stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf 0,25 Spektralbilder pro Sekunde ein, wählen Sie das Symbol für unidirektional für die Scanrichtung aus, geben Sie 4 für die Anzahl ein und legen Sie 1024 x 1024 für die Scangröße fest.
      HINWEIS: FRET-Signale sind schwach und eine langsame Scangeschwindigkeit ist oft erforderlich. Bei einer Scangeschwindigkeit von 0,25 ist die Erfassung eines spektralen Z-Stacks in ~3 Minuten abgeschlossen. Die Scangeschwindigkeit kann je nach verwendeten Fluorophoren erhöht oder verringert werden. Zum Beispiel kann für hellere Fluorophore wie eGFP eine schnellere Scangeschwindigkeit (2 Bilder / Sekunde) verwendet werden. Die unter Anzahl eingegebene Zahl entspricht einem Frame-Mittelwert von 4, was bei der Rauschunterdrückung während der Bildaufnahme hilft. Für sehr stabile Proben und wenn die Zeit keine Einschränkung ist, können höhere Mittelwerte (bis zu 16) verwendet werden, um Bilder mit verbessertem SNR zu erhalten.
  10. Definieren Sie Z-Stack-Erfassungsparameter:
    HINWEIS: Die in Schritt 2.10 eingegebenen Werte müssen möglicherweise angepasst werden, um Änderungen der Bindung oder Konzentration fluoreszierender Markierungen, der Art des Etiketts, der Anzahl der verwendeten Etiketten, der Zelllinie und anderer Änderungen in der Probenvorbereitung Rechnung zu tragen, die sich auf die Zellmarkierungsdichte und/oder die zelluläre Autofluoreszenz auswirken können. Bei der Einstellung der Erfassungsparameter sollte darauf geachtet werden, einen ausreichenden SNR zu erreichen und gleichzeitig die Photobleachung zu minimieren. Darüber hinaus sollte bei der Konfiguration eines spektralen FRET-Assays darauf geachtet werden, dass die Parameter über alle Behandlungsgruppen hinweg gut funktionieren. Es ist ratsam, eine Studie mit jeder Behandlungsgruppe mit den vorgeschlagenen Parametereinstellungen durchzuführen, um sicherzustellen, dass SNR ausreichend ist und Photobleaching minimiert wird.
    1. Öffnen Sie das Fenster ND-Erfassung, indem Sie auf Ansicht klicken, → Erfassungssteuerung → ND-Erfassung .
    2. Geben Sie den Pfad/das Ziel und einen Dateinamen ein, um die ND-Datei im Popup-Fenster zu speichern.
    3. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für die z-Reihe.
    4. Klicken Sie im Fenster A1 Plus Einstellungen auf live. Dadurch öffnet sich ein Live-Sichtfenster.
    5. Stellen Sie den Fokusknopf am Mikroskop ein, um die Oberseite der Zelle auszuwählen, und klicken Sie im ND-Erfassungsfenster auf Oben, um die aktuelle Position als Oberseite festzulegen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, etwas über der Oberseite der Zelle zu fokussieren, um sicherzustellen, dass die gesamte Zelle in der z-Serie abgetastet wird.
    6. Stellen Sie den Fokusknopf am Mikroskop ein, um die Unterseite der Zelle auszuwählen, und klicken Sie im ND-Erfassungsfenster auf Unten, um die aktuelle Position als Unterseite festzulegen.
      HINWEIS: Konzentrieren Sie den Fokus etwas unterhalb der Unterseite der Zelle, um sicherzustellen, dass die gesamte Zelle abgetastet wird.
    7. Geben Sie 1 μm für die Schrittgröße ein, wählen Sie oben unten für die Z-Scan-Richtung und klicken Sie im Fenster ND-Erfassung auf Ausführen, um einen Z-Stack zu erhalten.
      HINWEIS: Die Schrittgröße bestimmt die Anzahl der Z-Slices, die in Abhängigkeit von der oberen und unteren Position (d. h. der zurückgelegten Entfernung) erfasst werden. Als Kompromiss zwischen Bildgeschwindigkeit, z-Achsenabtastung und Photobleaching wurde eine Schrittgröße von 1 μm gewählt. Die Verwendung des konfokalen Lochdurchmessers von 2,4 AE und des 60-fachen Wasserimmersionsobjektivs führte zu einer optischen Querschnittsdicke von 1,73 μm. Daher liegt eine Schrittgröße von 1 μm leicht unter den Nyquist-Abtastkriterien, aber dies ist ein Kompromiss, der eingegangen wurde, um die Zeit zu reduzieren, die für die Erfassung eines Z-Stacks benötigt wird. Für sehr stabile Proben, für die die Geschwindigkeit nicht kritisch ist, kann ein kleinerer z-Achsenschritt und möglicherweise ein kleinerer konfokales Lochdurchmesser verwendet werden, um die Auflösung der z-Achse zu erhöhen. Bottom-Top sollte ähnliche Ergebnisse liefern und kann verwendet werden, um alle Effekte von Photobleaching zu bewerten, die während des Z-Scans auftreten können.
  11. Richten Sie das Perfect Focus System (PFS) ein, falls verfügbar:
    HINWEIS: MIT PFS kann das System Schwankungen der Brennweite während der Bildaufnahme ausgleichen. Die folgenden Schritte können zum Einrichten von PFS verwendet werden, und diese Schritte können je nach Version der Nikon A1R und der verwendeten Version von NIS Elements leicht variieren.
    1. Markieren Sie den symmetrischen Modus, der durch das Bereichssymbol im ND-Erfassungsfenster definiert ist.
    2. Schalten Sie die PFS-Taste auf der Vorderseite des Mikroskops ein (stellen Sie sicher, dass der dichroitische Spiegelknopf im Abschnitt unterhalb der Probenstufe "in" ist).
    3. Definieren Sie die Oberseite (gegen den Uhrzeigersinn drehen) und die Unterseite (im Uhrzeigersinn drehen) mit dem Knopf auf der Vorderseite des PFS-Offset-Controllers neu.
    4. Definieren Sie eine relative z-Position/z-Tiefe, indem Sie im ND-Erfassungsfenster auf "relativ" klicken.
    5. Klicken Sie auf den Speicher auf der Vorderseite des Mikroskops, damit die Software die relative z-Tiefe speichert.
  12. Nachdem die Z-Stack-Erfassung abgeschlossen ist, fügen Sie das gewünschte Reagenz (Forskolin oder Fahrzeugsteuerung) vorsichtig mit einer Pipette hinzu und warten Sie 10 Minuten.
    HINWEIS: Fügen Sie das Reagenz sehr vorsichtig hinzu, um die Zellen nicht zu stören oder die Position der Zellkammer innerhalb des Mikroskop-XY-Stadiums zu verschieben; Es ist hilfreich, in einer nachfolgenden Live-Ansicht oder einem nachfolgenden Bild zu überprüfen, ob sich das Sichtfeld während der Reagenzienzugabe nicht verschoben hat. Die 10-minütige Wartezeit beträgt, bis die Forskolin-Behandlung wirksam wird. Wenn eine alternative Behandlung verwendet wird, muss die Wartezeit möglicherweise angepasst werden.
  13. Ändern Sie nach 10 Minuten den Dateinamen und klicken Sie im Fenster ND-Erfassung auf Ausführen.
  14. Wiederholen Sie die Schritte 2.11 – 2.13 wie oben beschrieben für mindestens 5 Coverlips, um ausreichende Ergebnisse für die statistische Analyse zu erzielen (n = 5 für jede Behandlungsgruppe - Forskolin und Fahrzeugkontrolle).
  15. Bereiten Sie Proben und Probenrohlinge vor, um die Spektralbibliothek zu erstellen, und erfassen Sie Spektralbilder mit ähnlichen Erfassungseinstellungen, wie in den Schritten 2.9 und 2.10 beschrieben.

3. Bildanalyse

HINWEIS: Diese Bilder werden verwendet, um eine Spektralbibliothek zu erstellen, die die reinen Spektren aller einzelnen Endmitglieder enthält, die in der Studie vorhanden sind. Die Endmitglieder in der Spektralbibliothek können von Studie zu Studie variieren, wenn verschiedene Fluorophore verwendet werden. Ein detailliertes Verfahren zum Aufbau der Spektralbibliothek finden Sie in einer ergänzenden Informationsdatei mit dem Namen "Supplemental File_Spectral Library". Hier beschreiben wir den Export von Daten in .tiff Dateien, lineare spektrale Entmischung, FRET-Effizienzmessungen, dreidimensionale Rekonstruktion und cAMP-Niveauschätzung. Die Bildanalyse kann mit verschiedenen Bildanalyse- und Programmierplattformen wie ImageJ, Python, MATLAB oder CellProfiler durchgeführt werden. In diesen Studien wurden MATLAB-Skripte verwendet.

  1. Bilddaten exportieren:
    1. Erstellen Sie neue Ordner mit demselben Dateinamen, der den spektralen Z-Stack-Bildern entspricht, die in den Schritten 2.13 und 2.14 aufgenommen wurden.
      HINWEIS: Die folgenden Schritte zum Exportieren von Daten sind spezifisch für NIS Elements AR Version 4.30.01. Diese Schritte können je nach Version der Software leicht variieren.
    2. Klicken Sie auf Datei, um ein Dateifenster zu öffnen. Durchsuchen und wählen Sie die in Schritt 2.12 aufgenommene Spektralbilddatei aus, und klicken Sie auf Öffnen.
    3. Sobald die Datei geladen ist, klicken Sie auf Datei→ Importieren/Exportieren→ ND-Dokument exportieren.
    4. Im Popup-Fenster: Durchsuchen und wählen Sie den in Schritt 3.1.1 erstellten Ordner aus, wählen Sie Tagged Image Format (TIF) für Dateityp, dann Mono-Bild für jeden Kanal und Bittiefe beibehalten.
      HINWEIS: Das Dateipräfix wird vorgeneriert. Ändern Sie diesen Wert aus Gründen der Bequemlichkeit. Die Indexreihenfolge ändert sich je nach den ausgewählten Kanälen und sollte "z, c" für die Indizierung nach z-Slice-Position zuerst und Wellenlängenband nummer sekunde anzeigen. Stellen Sie sicher, dass die Felder für LUTs anwenden oder Überlagerungen einfügen oder Punktnamen verwenden deaktiviert sind.
    5. Klicken Sie auf Exportieren, um die TIFF-Dateien als einzelne TIFF-Dateien in einen Zielordner zu exportieren.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.2 bis 3.1.5, um spektrale Bilddateien zu exportieren, die in Schritt 2.13 aufgenommen wurden.
  2. Lineare spektrale Entmischung:
    1. Öffnen Sie die Programmiersoftware.
      HINWEIS: Ein speziell entwickeltes Programmierskript zum Entmischen von spektralen Rohbildern wird auf der Website der University of South Alabama BioImaging and BioSystems unter der Registerkarte Ressourcen (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html) bereitgestellt.
    2. Öffnen Sie die Datei mit der Bezeichnung "Linear Unmixing.m" und klicken Sie in der Symbolleiste des Editors auf die Schaltfläche Ausführen.
    3. Durchsuchen und wählen Sie den Ordner aus, der die exportierte *.tif Dateisequenz enthält, die von der NIS Elements-Software generiert wurde.
    4. Klicken Sie auf OK, um fortzufahren, wodurch ein neues Fenster mit den Namen Wellenlänge und Z-Slicegeöffnet wird.
    5. Kopieren Sie den Dateinamen der ersten Datei (ohne Z-Slice und Kanalnummer) in den in Schritt 3.2.4 ausgewählten Ordner und fügen Sie ihn in den ersten Schritt des Dialogfelds mit der Bezeichnung "Bildnamen eingeben" ein.
    6. Geben Sie die Anzahl der Kanäle im zweiten Schritt mit der Bezeichnung "Geben Sie die Anzahl der Wellenlängenbänder ein", die Anzahl der Z-Slices im dritten Schritt mit der Bezeichnung "Geben Sie die Anzahl der Z-Slices ein" ein und klicken Sie auf OK.
      HINWEIS: Die Anzahl der Wellenlängenbänder kann sich ändern, wenn Änderungen an den Erfassungseinstellungen vorgenommen werden, z. B. durch Anpassen des Wellenlängenbereichs oder der Wellenlängenschrittgröße. Die Anzahl der Z-Slices kann sich auch in Abhängigkeit von der Höhe der Zelle ändern.
    7. Durchsuchen und wählen Sie die Wellenlängendatei "Wavelength.mat" im Popup-Fenster mit der Bezeichnung "Wählen Sie die Wellenlängeninformationsdatei aus" und klicken Sie auf Öffnen.
    8. Durchsuchen und wählen Sie die Datei "Library.mat" im neuen Popup-Fenster mit der Bezeichnung "Wählen Sie die Spektralbibliotheksdatei aus", klicken Sie auf Öffnen und warten Sie, bis die Entmischung der Slices abgeschlossen ist.
      HINWEIS: Library.mat-Datei ist eine Datei, die reine Spektren für jedes Endmemberfluorophor zusammen mit Zellautofluoreszenz und Hintergrundspektralsignaturen enthält. In diesem Fall umfassen Endelementfluorophore Türkis, Venus und DRAQ5. Zu den spektralen Hintergrundsignaturen gehören zelluläre oder Matrix-Autofluoreszenz, Coverslip-Fluoreszenz und Coverslip-Beugung. Die Datei Wavelength.mat ist eine Datei mit Wellenlängenkanalinformationen, die zur Erfassung des Spektralbildes verwendet werden. Eine Beispielbibliotheksdatei und eine Wellenlängendatei sind auf der Bioimaging and Biosystems-Website verfügbar (siehe Hinweis unter 3.2.1). Weitere Informationen zum Generieren von Spektralbibliotheks- und Wellenlängendateien finden Sie in der ergänzenden Informationsdatei "Supplemental File_Spectral Library". Nicht gemischte Bilder, die jedem Z-Slice entsprechen, werden in dem Ordner "Unmixed" gespeichert, der während des Entmischvorgangs innerhalb des in Schritt 3.2.3 ausgewählten Ordners erstellt wurde.
  3. FRET-Effizienzberechnung:
    1. Öffnen Sie das Programmierskript "multiFRRCF.m" und klicken Sie auf Ausführen.
      HINWEIS: Diese Programmierdatei ist auf der Website der University of South Alabama Bioimaging and Biosystems verfügbar (siehe Hinweis unter Schritt 3.2.1).
    2. Geben Sie die Anzahl der zu analysierenden experimentellen Versuche in das Popup-Dialogfeld mit dem Namen "Wie viele Ordner sollen neu aufgebläst werden" ein und klicken Sie auf OK.
      HINWEIS: Bilddaten aus jedem Experiment sollten in einem separaten, nicht gemischten Bildordner gespeichert werden. Dieser Schritt ermöglicht es dem Analysecode einfach, viele Ordner als zeitsparenden Schritt zu durchlaufen.
    3. Suchen Sie nach den nicht gemischten Ordnern, wählen Sie sie aus, und klicken Sie auf OK.
      HINWEIS: Wie oft das Popup-Fenster "Nach Ordner suchen" geöffnet wird, hängt von der Anzahl ab, die im Dialogfeld "Wie viele Ordner neu aufgebläst werden sollen" im vorherigen Schritt eingegeben wurde. Durchsuchen und wählen Sie die Ordner nacheinander aus.
    4. Geben Sie im neuen Popup-Fenster die folgenden Informationen in die entsprechenden Felder ein: Skalierungsfaktor ist 12,4, Schwellenwert ist 5,6, X, Y und Z Frequenz sind 5, 5 bzw. 1 und Glättungsalgorithmus ist Gauß.
      HINWEIS: Der Skalierungsfaktor ist ein Wert in Pixel/μm und wird verwendet, um die Z-Richtungsabtastung auf die XY-Richtung zu skalieren. Der Skalierungsfaktor ergibt sich aus der Bildpixelgröße, die bei den meisten konfokalen Mikroskopsystemen normalerweise als Metadaten im Bild bereitgestellt wird. Wenn das Bild beispielsweise mit einem Abstand von 0,08 μm/Pixel aufgenommen wird, sollte der Skalierungsfaktor 12,5 Pixel/μm betragen. Der Schwellenwert wird verwendet, um den Schwellenwert für die Bilder festzulegen und eine binäre Maske der Zelle zu generieren. Wir haben eine Liste optimaler Werte basierend auf der Intensität des Bildgebers + Akzeptors erstellt. Verwenden Sie 4,5 als Schwellenwert, wenn das Bild eine helle Donor+Akzeptor-Intensität und einen niedrigen Hintergrund aufweist, einen Wert zwischen 5,6 und 6,5 für Bilder mit nur moderater Donor+Akzeptor-Intensität und/oder höherem Hintergrund und einen Wert von 7,5 und höher für Bilder mit einer Donor+Akzeptor-Intensität, die niedriger ist als der Hintergrund. Der Frequenzwert entspricht dem Intervall in Pixelanzahl, in dem das Slicing in den nachfolgenden Schritten durchgeführt wird. Wenn beispielsweise die Z-Tiefe der Zelle 17 μm mit einer Schrittgröße von 1 μm beträgt und ein Skalierungsfaktor von 12,5 Pixel/μm in XY-Richtung verwendet wird, wird die Tiefe des 3-dimensionalen Bilddatensatzes mit 212 Pixeln (Z-Richtung) neu abgerechnet. Basierend auf dem eingegebenen Z-Frequenzwert (z. B. 1 Pixel) wird der 3-dimensionale Bilddatensatz beginnend am oberen Teil des Bilddatensatzes neu geschnitten und dann in Schritten von 1 Pixel nach unten bewegt. Daraus ergeben sich 212 neu liced Bilder. Würde für Z-Frequenz ein größeres Frequenzwertintervall eingegeben, würden weniger resliced Bilder generiert. Neu licierte Bilder werden in nachfolgenden Schritten gespeichert.
    5. Klicken Sie auf Ausführen und warten Sie, bis alle FRET-Messungen und -Neuaufteilungen durchgeführt wurden.
      HINWEIS: Im übergeordneten Verzeichnis wird ein separater Ordner erstellt, in dem neu geordnete Graustufen-FRET-Effizienzbilder und farbige (eine Angewendete Farbkarte) FRET-Effizienzbilder gespeichert werden. Beispielsweise werden alle Graustufen- und Farbkarten-FRET-Bilder, die in X-Richtung (YZ-Ebene) neu aufgeschrieben sind, in einem Ordner namens "Resliced_XFRET" gespeichert.
    6. Wiederholen Sie die Analyse mit ähnlichen Einstellungen für alle Experimente – vor und nach Forskolin-Behandlungen und Fahrzeugkontrollen.
      HINWEIS: Die in Abschnitt 3.3 genannten Schritte beschreiben die Werte, die für das benutzerdefinierte FRET-Analyseprogrammierskript zum Generieren von 3-dimensionalen FRET-Bilddaten eingegeben werden müssen. Dieses Skript führt jedoch während der Ausführung mehrere Operationen aus, darunter: Laden von Bilddaten, Erstellen von Bildstapeln, Glätten, FRET-Effizienzberechnungen, Erstellen und Anwenden einer Zellrahmenmaske, 3-dimensionale Bildrekonstruktion, Neulizieren von 3-dimensionalen Bildern in bestimmten Intervallen (Frequenzen), Anwenden einer Farbkarte zur Visualisierung von FRET-Änderungen und Speichern der neu licierten Bilddaten im selben Verzeichnis. Weitere Details wurden als Kommentare in das Programmskript aufgenommen.

4. Zuordnung der FRET-Effizienz zu cAMP-Werten

  1. Öffnen Sie die Programmierdatei mit dem Namen "Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m" und klicken Sie im Hauptfenster auf Ausführen.
    HINWEIS: Die Datei ist auf der BioImaging- und BioSystems-Website verfügbar (siehe Hinweis unter 3.2.1). Diese Datei liest Graustufen-FRET-Effizienzbilder und konvertiert sie basierend auf einer Kennlinie in cAMP-Werte. Diese Kennlinie verwendet eine cAMP-zu-FRET-Beziehung, die in Literatur15,36 dokumentiert ist und durch die Hill-Gleichung (die dritte unten gezeigte Gleichung) beschrieben wird. Kd der Sonde in intakten Zellen ist jedoch schwer abzuschätzen und wir haben in unseren Berechnungen davon ausgegangen, dass es 1 μM ist. Daher werden die Ergebnisse als Funktion von Kd angezeigt. (d. h. [cAMP] = x* Kd). Gleichungen, die zur Messung der FRET-Effizienz und zur Zuordnung von FRET zu cAMP-Werten verwendet werden, sind unten dargestellt:
    figure-protocol-1
    Dabei ist E die FRET-Effizienz, und einscheinbarer und ein dscheinbarer sind ungemischte Pixeldicken von Akzeptor- bzw. Spenderbildern.
    Qa und Qd sind Quantenausbeuten von Akzeptor und Donor. Beachten Sie, dass Qa und Qd aufheben, wenn die Gleichung für kλ in die FRET-Effizienzgleichung aufgenommen wird, kλ ist ein Korrekturfaktor:
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3 und figure-protocol-4 sind Extinktionskoeffizienten von Donor und Akzeptor bei der Donoranregungswellenlänge i (405nm).
    figure-protocol-5
    E ist FRET-Wirkungsgrad und KD = Dissoziationskonstante = 1 μM.
  2. Navigieren Sie, wählen Sie das erste Graustufen-FRET-Bild (gespeichert in Schritt 3.3.5) aus und klicken Sie auf OK.
  3. Öffnen Sie die FRET/cAMP-Bilder, um die Verteilung der cAMP-Signale dreidimensional zu untersuchen.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung hyperspektraler FRET-Bildgebungs- und Analyseansätze zur Messung von cAMP-Gradienten in drei räumlichen Dimensionen in lebenden Zellen. Bei der Generierung dieser Ergebnisse gibt es mehrere wichtige Schritte, für die bei der Analyse und Quantifizierung der Daten sorgfältige Aufmerksamkeit erforderlich ist. Zu diesen Schlüsselschritten gehören der Aufbau einer geeigneten Spektralbibliothek, die spektrale Entmischung im Hintergrund, die Schwellenwerte zur Identifizierung von Zellg...

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Diskussion

Die Entwicklung von FRET-Biosensoren hat die Messung und Visualisierung von zyklischen Nukleotidsignalen in einzelnen Zellen ermöglicht, und es gibt große Vielversprechende für die Visualisierung subzellulärer Signalereignisse13,22,37,38. Die Verwendung von FRET-Biosensoren birgt jedoch mehrere Einschränkungen, darunter die niedrigen Signal-Rausch-Eigenschaften vieler fluoreszierender proteinba...

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Offenlegungen

Dr. Leavesley und Rich legen finanzielle Beteiligungen an einem Start-up-Unternehmen, SpectraCyte, LLC, offen, das gegründet wurde, um spektrale Bildgebungstechnologien zu kommerzialisieren. Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden jedoch mit kommerziell erhältlichen Produkten durchgeführt, die nicht mit SpectraCyte, LLC verbunden sind.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Kees Jalink (The Netherlands Cancer Institute und van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Niederlande) für die Bereitstellung des H188 cAMP FRET Biosensors und Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) für die technische Hilfe bei der Reduzierung der Zeit, die für die Ausführung unserer speziell entwickelten Programmierskripte erforderlich ist.

Die Autoren möchten die Finanzierungsquellen anerkennen: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Attofluor ZellkammerInvitrogenA7816Attofluor enthält Zellkammern aus Stahl und einen Gummi-O-Ring. Die Zellkammer hält das Deckglas und der O-Ring bietet einen Verriegelungsmechanismus, um den Puffer in der Zellkammer zu halten, ohne dass es zu Leckagen
Dimethylsulfoxid (DMSO)Fisher ScientificBP231-100Lösungsmittel, das zur Herstellung von Stammlösung für Skolin verwendet wird.
DRAQ5 FluoreszenzsondenlösungThermo Scientific62252Nukleares Etikett
Dulbecco Modifiziertes Eagle Medium (DMEM)Gibco11965-092Enthält Nährstoffe und Wachstumsfaktoren, damit die Zellen in den Kulturschalen wachsen und sich teilen können.
Fötales Kälberserum (FBS)SigmaF6178Wachstumsfaktor-Ergänzungsmittel, das dem Kulturmedium zugesetzt wird, DMEM
ForskolinSigmaF3917Adenyly-Cyclase-Aktivator.
H188 Cyclic AMP FRET BiosensorNetherland Cancer Institute, Dr. K. JalinkGeschenkplasmid, das für Turquoise (Donorfluorophor), Venus (Akzeptorfluorophor) und Bindungsdomäne aus Epac kodiert.
Image Jimage.netKostenloser DownloadEine weitere Bildverarbeitungsplattform zur Erfassung spektraler Informationen und Bildverarbeitung.
Integrating SphereOcean OpticsFOIS-1Wird verwendet, um die Beleuchtungsintensität der Laserlinie bei verschiedenen Laserintensitäten (?) zu messen.
Laminin Mausprotein, natürlichesInvitrogen23017-015Deckgläser sind mit Laminin beschichtet und dies hilft bei der Zelladhäsion, dem Wachstum und der Beweglichkeit der Zelle.
Lipofectamine 3000 TransfektionskitInvitrogenL3000-015Transfektionsreagenz zur Transfektion von Zellen mit dem H188 FRET-Biosensor
MATLABMathworksR2019aBildverarbeitungsvorgänge (lineare Entmischung und FRET-Effizienzberechnungen) werden durch Schreiben benutzerdefinierter Programme in der MATLAB-Programmierumgebung durchgeführt
Nikon A1R Konfokalmikroskop NikonInstrumentsNikon A1RDie spektrale Bildaufnahme erfolgt mit einem konfokalen Mikroskop.
Nikon Elements SoftwareNikon InstrumentsSoftware-Donglezum Exportieren und Bearbeiten von nd2-Bilddateien (mehrdimensionale Bilddateien), die mit Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration LampOcean OpticsLS-1-CAL-INTaufgenommen wurden Eine Lampe mit bekanntem Spektrum für die Verwendung als Standard
PBS pH 7,4 (1X)Gibco10010-023bisher nur verwendete Puffer-Suring-Zellkultur
Pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen (PMVECs)Im Haus - Zellkulturkern, Universität von Süd-AlabamaIsoliert aus pulmonalen Mikrovaskulatur-PMVECs der Rattebilden die innere Auskleidung eines Blutgefäßes.
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Gibco15140-122Antibiotika werden dem Kulturmedum zugesetzt, um eine Kontamination der Zellen zu verhindern.
Vorgereinigte Gold Seal Micro SlidesClay Adams3010Objektträger für die Zellfixierung
ProLong Diamond Antifade EindeckmedienInvitrogenP36961Wenn Proben mit Antifade-Eindeckmittel fixiert werden, schützt letzteres Fluoreszenzfarbstoffe und Chromophore vor dem Ausbleichen.
SpektrometerOcean OpticsQE65000Zur Messung der spektralen Empfindlichkeit der Lichtquelle (?)
Trypsin-EDTA (0,25%)Gibco25200-056Verdaut die Protein-Protein-Bindung zwischen der Zelle und der Zellmatrix und hilft, die Zellen während der Zellplattierung zu diskoziieren und anzuheben.
Tyrodes-PufferDerTyrodes-Puffer wird verwendet, um Arbeitslösungen herzustellen und die Zellen während der Bildaufnahme in wässriger Lösung zu halten.
6-Well-ZellkulturplatteCorning3506Laminin-beschichtete Deckgläser werden in eine 6-Well-Kulturschale gelegt (eine Abdeckung/Well). Die Zellen werden zusammen mit dem Medium in jede Vertiefung gegeben.
25 mm Rundmikroskop-DeckgläserFisher Scientific12545102Zellen wurden auf runden Glasdeckgläsern gezüchtet
60X OjectiveNikon InstrumentsPlan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27Wasserimmersion und häufig verwendetes Objektiv für Zellen
kommt.

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cAMP Verteilungspektrales UnmixingKonfokalmikroskopie3D Bildgebungzyklisches AMPFRET EffizienzSpektralbibliotheklineares Unmixing

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