Summary
我们介绍了一个用于复杂生命机械高吞吐量研究的微流体系统，该系统由 1500 个培养单元、一系列增强的永久泵和现场混合模组组成。微流体芯片可分析体内高度复杂和动态的微环境条件。
Abstract
模仿体内环境条件对于复杂生命机械的体外研究至关重要。然而，目前针对活细胞和器官的技术要么非常昂贵，比如机器人技术，要么在液体操作中缺乏纳米线体积和毫秒时间精度。我们介绍一个微型流体系统的设计和制造，该系统由 1，500 个培养单元、一系列增强的永久泵和现场混合模组组成。为了证明微流体装置的能力，神经干细胞（NSC）球体在拟议的系统中保持。我们观察到，当 NSC 球体在第 1 天接触 CXCL，在第 2 天接触 EGF 时，圆形构象维护良好。6 种药物输入顺序的变化导致 NSC 球体的形态变化和 NSC 茎的表达水平代表标记（即 Hes5 和 Dcx）。结果表明，动态复杂的环境条件对NSC分化和自我更新有重大影响，建议的微流体装置是复杂生命机械高吞吐量研究的适宜平台。
Introduction
高吞吐量技术对生物医学和临床研究至关重要。通过同时进行数百万次化学、遗传或活细胞和器官测试，研究人员可以快速识别调节生物分子通路的基因，并根据自己的特定需求定制顺序药物输入。机器人1和微流体芯片与设备控制程序相结合，允许复杂的实验程序自动化，包括细胞/组织操作，液体处理，成像和数据处理/控制2，3。因此，根据所需的吞吐量4，5，可以在一个芯片上维持成百上千的实验条件。
在此协议中，我们描述了微流体装置的设计和制造过程，该装置由 1500 个培养单元、一系列增强的围流泵和现场混合模组组成。二级细胞培养室可防止在中等交换过程中不必要的剪切，从而确保长期活细胞成像不受干扰的文化环境。研究表明，拟议中的微流体装置是研究复杂生命机械的高吞吐量的合适平台。此外，微流体芯片的先进功能允许在体内自动重组高度复杂和动态的微环境条件，如不断变化的细胞因子和配体组成6，7，其完成需要几个月的传统平台，如96井板。
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Protocol
1. 微流体芯片设计
- 设计由 18 个入口组成的微流体多路复用器，每个入口都由单个阀门和永久泵控制。为了增加每个泵周期驱动的液体体积，由 3 个控制通道（特意加宽至 200 μm）和 10 条连接的流线组成。
- 设计无剪切文化室。二级培养单元的复制由较低细胞培养室（400μm x 400 μm x 150 μm）和较高的缓冲层（400μm x 400 μm x 75 μm）组成，可防止在中等交换期间对细胞产生不必要的剪切应力（图1）。
- 设计高通量功能。复制培养单元，形成 30 x 50 矩阵布局，占地约 7 厘米 x 5 厘米。
2. 芯片制造和操作
- 使用紫外线光刻制作复制品成型
注：复制品成型是根据标准光刻协议8在硅晶片上制造的。- 制造通道结构
- 旋转光分辨率：在硅晶片上旋转 5 mL 的 SU-8 3025 负光分辨率，在 10s 的 500 rpm 和 30s 的 3000 rpm 上旋转涂层。
- 软烘烤：将晶圆放在热板上2分钟，然后在95°C下加热10分钟，冷却至室温。
- 对齐和固化：修复对齐器支架上的晶圆和面膜，打开光源18s，以治愈暴露的光分辨率。
- 暴露前烘烤：将晶圆从室温提升至 110°C/h 95°C，并保持至少 40 分钟，直到移除。
- 开发：将晶圆浸入开发解决方案（SU-8 开发人员）中，搅拌 2.5 分钟，以冲洗多余的光分辨率，并获得 25μm 高通道结构。
- 硬烘烤：用玻璃培养皿盖住晶圆，在 65 °C 下烘烤 2 分钟，然后以 120 °C/h 的速度加速至 160°C，并保持 3 小时。
- 用缓冲层制造细胞培养室
- 使用步骤 2.1.1.1 的参数在上述晶圆上旋转 SU-8 3075 负光分辨率的 7 mL。
- 软烘烤（在第 2.1.1.2 步中描述）晶圆并更改面膜，以便与晶圆上的标记物很好地对齐。然后打开24s的光源来治愈暴露的光电。
- 将晶圆浸入开发解决方案（SU-8 开发人员），搅拌 4 分 40 秒，以洗掉多余的光分辨率，并获得 75μm 高的层结构，该结构围绕 25μm 高通道结构制造。硬烘烤（在步骤 2.1.1.6 中描述）晶圆，使复杂的结构更坚固。
- 重复步骤 2.1.2.1-2.1.2.3，以构建堆叠在层结构上的 75μm 高室结构。
- 阀门结构的制造
- 使用步骤 2.1.1.1 的参数在上述晶圆上旋转 AZ 50 倍正光分辨率的 5mL。
- 软烘烤（在第 2.1.1.2 步中描述）晶圆，使面膜与晶圆上的标记物保持良好对齐，然后保持光源打开 20s，然后立即关闭 30s。在 5 个圆圈中重复开/关程序，以治愈暴露的光分辨率。
- 将晶圆浸入匹配的开发人员，搅拌约 8 分钟，以冲洗多余的光分辨率，并获取与控制通道重叠的圆形阀门，以确保良好的连接。硬烘焙（在步骤 2.1.1.6 中描述）图案晶圆，使整个模型更坚固。
- 制造通道结构
- 使用软光刻技术进行微流体芯片生产
- 用硅氯硅烷处理图案和空白硅晶片15分钟。
- 分别准备 3 份 PDMS 凝胶（10：1 的单体/催化剂比），对应 50 克流层、20 克控制层 2 和 20 克膜。
- 在图案硅晶片上铸造 50 克 PDMS 凝胶，在真空室中以 -0.85 MPa 对它们进行 1-2 小时的除气，以复制流层。
- 将 20 克 PDMS 的 2 部分分解，并在图案晶圆和空白硅晶片上旋转 2000-2800 rpm，30s，以准备控制层和膜层。
- 将 PDMS 覆盖的晶圆放入通风烤箱中 60 分钟，在 80 °C 下进行孵化。
- 通过定制光学设备（放大 100 倍）和等离子蚀刻机将不同层对齐并粘合在一起。然后在 80 °C 的通风烤箱中保存 2 小时，以增强芯片的粘接。
- 在芯片上打入孔，然后将其粘接到 PDMS 涂层盖上，并在使用前在 80 °C 下固化至少 12 小时。
- 芯片操作
- 将微型气动电磁阀连接到芯片的控制层，并打开自定义的 MATLAB 图形用户界面8 来连接和控制开关。
- 将俯卧撑 PDMS 膜阀的闭合压力设置为 25 psi。
- 通过及时关闭阀门，向指定腔室（图 2d）提供动态变化的组合/顺序输入。
3. 在细胞微环境下生成动态输入
- 芯片处理和细胞加载
- 在显微镜上保持标准培养条件（37 °C，5% CO2）至少5小时。
- 将芯片填充涂层介质（即注释中提及的），并在标准培养条件下（第 3.1.1 步中描述）孵育至少一小时。
- 通过磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 或细胞培养介质 （杜尔贝科的改良鹰的介质， DMEM） 冲洗芯片， 以建立一个健康的文化环境。
- 以 80% 的二致性收获细胞，并使用培养介质 （DMEM） 以大约 106/mL的密度恢复细胞。然后通过加压含细胞的溶液将细胞加载到芯片中。
注意：在芯片上培养不同的细胞系需要相应的涂层介质来治疗细胞培养室。通常，对于 3T3 成纤维细胞和母鸡的粘附培养物的实验，控制培养室的所有阀门都是开放的，细胞流入同一列内的所有培养室。
- 用于高吞吐量活细胞成像的设置
注意：在图像采集方面，使用了具有自动转换阶段的倒显微镜和数字互补金属氧化物半导体 （CMOS） 相机。舞台和图像采集通过自定义软件进行控制。- 在明亮的领域中使用 10 倍目标透镜可视化文化室的矩阵，以确认和定义 30 乘 50 腔室矩阵中每个腔室的位置坐标。
- 将目标镜头转换为 20 倍或 40 倍，然后选择所需腔室的位置坐标，并在确认后将转换阶段移动到指定位置。微调 x、y、z 焦距平面以获得最佳图像。
- 优化每个通道的光强度、暴露时间和其他图像参数（即亮场和荧光成像）。
- 设置成像周期的间隔和持续时间，保存路径，然后开始成像。
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Representative Results
传统的芯片上渗透泵最初由斯蒂芬·奎克在2000年描述，使用这种渗透是由模式101，100，110，010，011，0018，10激活的。 数字 0 和 1 表示 3 个水平控制线的"打开"和"关闭"。使用超过3个阀门（例如，5个）的研究也报告了11个。尽管由 3 条控制线和 3 条流线组成的永久泵提供了纳米线精度，但传输速度太慢，无法养活 1，500 个培养室。为了解决这个问题，我们包括更多的流线（即10个连接通道），以增加每个泵送周期（即101，100，110，010，011，001）驱动的液体体积。因此，营养物质和药物可以有效地输送到指定的腔室。每泵周期的永久泵输送液体体积可增加 16 倍至约 50 纳米升。由于围产泵阵列由 3 个连接控制通道（图 1b）控制，因此每个入口的解决方案同时交付到芯片中，并允许即时混合。因此，通过及时关闭连接到不同解决方案的入口，可以生成组合和顺序输入。使用相同的方法，也可以产生动态变化的细胞因子和配体浓度。例如，选定的 1、0.9、0.2、0.05、0.01 g/L 和 4 个空白培养介质的组合可以产生 0 到 0.5 g/L 的内在波波动，其步幅从 0.0005 到 0.01 g/L 不等。
对于原细胞的培养，保持稳定的微环境至关重要。在中等交换过程中，有条件介质的剪切应力和疲惫将影响细胞行为和细胞命运12。为了克服这些问题，我们设计了一个缓冲层，以防止在中等交换过程中对细胞造成不必要的剪切压力（图1c）。与传统培养单元不同，该设备的主要优点（即阀门控制）是其现场混合、交付和维护独立条件的能力。在 图2d中，我们演示了一个复杂的中文单词可以通过精确地将液体输送到指定位置和维持个别文化室中未受影响的状况在芯片上产生。现场混合中活动流体装置的功能通过视频剪辑进行说明，显示培养室中动态变化的 FITC 浓度（图 3c 和 视频 7：47-7：50），通过控制连接到 2 个入口12的 2 个独立永久泵的泵速率来实现。数字模拟表明，当介质自上而下通过文化室定向时，剪切流会迅速到达文化井底（视频 4：07-4：25）。当解决方案从左到右定向时，可以有效地防止剪切力。即使在 10 mm/s 的输入流速下，细胞或微米大小的组织在培养单元底部仍不受干扰。
如图 3b（1）中所示，每个入口均由下部永久泵以外的阀门控制。当一种药物被选定交付到指定的腔室时，与药物相连的入口是开放的，而围产泵阵列的操作只运输这种药物。对于 2 种或多种药物，我们只需打开连接的入口，以等量生成药物的混合物。我们还集成了一个独立于阵列的独立渗透泵（图2g），该泵可以以不同于阵列的泵速运行，从而产生不同的稀释。为了模拟内在 NSC 动态环境条件，6 个配体（即锯齿状、DLL、EGF、PACAP、CXCL、PDGF）的顺序和组合状态，由720 和 56 种不同条件组成，使用围立泵阵列生成并交付给指定的腔室。 详细说来，顺序条件可以表示为 Sij = [ligand i 在第 j天添加] 和组合条件为 Ci = [利根德i存在] ， 其中配衣i =锯齿状， DLL， EGF， PACAP， CXCL， PDGF和j=1，2，3，4，5，6。在培养和刺激期间，每2小时记录一次国家安全委员会细胞和球体的反应。
NSC 球体由 400μm 细胞培养室（图 2e和图 4）保持在 400μm 中。干细胞的分化和干细胞（即自我更新）分别由Dcx和 Hes5的表达水平表示。我们观察到，当 NSC 球体在第 1 天暴露在 CXCL 中，在第 2 天暴露在 EGF 中时，圆形构象保持良好，球体大小明显增加。具有高Dcx表达水平的NSC在EGF被PACAP取代的第3天死亡，这表明对分化细胞13、14、15、16的影响。细胞在 DLL 的刺激下于 4 日开始附着在未经处理的 PDMS 表面，并在5 天加入 PDGF 并在6天加入锯齿状，分离成单个细胞。这6个配体的输入顺序的变化带来了独特的国家安全地位（图5）。例如，当 CXCL 沿序列（图 5a 和 5b）切换与 PDGF 的位置时，NSC 的演变会发生巨大变化。结果表明，动态变化的环境条件对NSC的分化和自我更新有很大影响，为生物医学研究和临床应用开发脑片平台铺平了道路。
图1：高通量微流体芯片的设计。 增强型永久泵由多个流道和加宽的控制通道组成，从而增加每个泵周期的传输液体体积。 b. 永久泵阵列由 3 条连接的控制线控制。因此，在编程时间点加入不同的入口可以生成组合、顺序和动态的不同输入信号。 c. 为了防止不必要的剪切流，我们设计了一个两级文化单元。细胞保持在较低水平的底部，深度为 150 μm。 d. 每个文化室都连接到 4 个通道，允许通过自上而下和向左向右定向解决方案。 请单击此处查看此图的更大版本。
图2：高通量微流体芯片的制造。 控制和流层的微观结构首先在硅晶片上进行图案化，PDMS 被铸造用于复制。 b. 控制层、膜层和流层通过等离子蚀刻和热粘合对齐在一起。 c-f. 使用绿色、蓝色和黄色食品染料演示芯片的先进特性。我们表明，通过及时关闭阀门，纳奥利特精度的解决方案可以交付给指定的腔室。 g.围网泵阵列由 3 条连接控制线（即控制-1）控制，一个独立的永久泵由其他 3 条控制线（即控制-2）控制。 请单击此处查看此图的更大版本。
图3：显示活动流体装置的示意图。 示意图显示（a）细胞流经旁路通道：（b） 阀门控制入口和永久泵：和（c）细胞流入培养室。 请单击此处查看此图的更大版本。
图4：NSC球体的代表图像，当受到顺序药物输入的刺激。 光明场（上排）、Hes5-GFP（第二排 ）、Dcx-Desred（第三排）图像显示，在连续刺激下 ，Dcx-高细胞和Hes5高细胞之间都会发生大量细胞死亡。黑暗区域的出现表明干细胞的死亡，干细胞主要在核心区域局部化。比例栏： 100μm. 请单击此处查看此图的更大版本。
图 5： 受到不同顺序输入刺激时，NSC 球体构象 、Dcx 和 Hes5 表达水平的变化。 结果表明，6种药物的输入顺序变化导致信号分子的组织、形态和表达水平发生变化，表明国家安全委员会球体对动态环境条件的敏感性。输入序列：（a） DLL = 帕卡普 = EGF = CXCL = PDGF = 锯齿状 ， （b） DLL = PACAP = EGF = PDGF = CXCL = 锯齿状 ， （c） DLL = 帕卡普 • PDGF = CXCL = EGF = 锯齿状 ， （d） PDGF = CXCL = 帕卡普 • EGF = DLL = 锯齿状。比例栏： 100μm. 请单击此处查看此图的更大版本。
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Discussion
各种微流体装置已开发出来，以执行多路复用和复杂的实验17，18，19，20。例如，由一系列拓扑凹槽制成的微井可以捕获单个细胞，而无需使用外部力，表现出有利的特性，包括样本量小、平行、材料成本更低、响应更快、灵敏度高 21、22、23、24。液滴和表面张力密闭液滴消除了对微泵等辅助硬件的需求，使水滴的运输成本更低，环保性更友好。液体滴可以通过微喷头或喷雾器喷嘴轻易地沉积在表面，经过实验，这些系统可以很容易地刷新和重复使用27，28。滑芯片技术允许多路复用反应，而无需集成泵或阀门的参与，因此用户和生产者友好29，30。然而，这些系统面临许多技术障碍，例如将纳米溶液储存在微孔中、控制湿度以及并行低容量液体分配技术的局限性。
本文介绍了使用活细胞成像系统和定制微流体设备进行高通量生物医学实验的协议。详细演示了芯片制造过程，包括紫外线和软光刻，以及自动荧光成像的设置参数。结果表明，拟议的微流体芯片的先进功能（即二级培养室和增强型围流泵）优于先前报告的设备，满足了数千次平行实验的需要。我们还描述了关键参数（例如，维持条件介质），即应仔细控制这些参数，以维持初级细胞和干细胞培养的健康环境。
基于细胞的生物医学实验，包括复杂的协议和化学成分的编程添加，通常被认为是耗时和费力的。例如，除了细胞操作程序外，6种药物的组合输入，每小时至少需要250个管道处理步骤，并重复到实验结束。此外，在体内模拟动态环境条件需要及时添加一个或多个细胞因子、配体和药物，准确度为秒，这在人工操作中是不可能的。我们在此证明，通过将芯片的入口连接到多种药物，或不同浓度的单一药物，组合，顺序和动态变化的输入信号可以在无剪切细胞环境中产生和维护。然后，可以使用商业显微镜软件实时监测细胞和组织的形态和化学反应，这些反应维持在并行运行的培养室中。
随着微流体设备吞吐量的增加和生物成像过程中的自动数据收集，活细胞成像系统每小时可以生成数千张图像。例如，连续运行 1500 台芯片一周可生成 252，000 张图像。在单细胞水平上手动跟踪组织和细胞群的进化（例如，荧光标记生物分子的表达水平）可能需要几个月的时间。使用自定义的 MATLAB 程序，可以自动对海量数据进行排序、格式化和分析。可检索显示信号分子的移动性、形态特征和表达水平的痕迹（如视频中所示），从而避免人为错误并节省大量时间。
因此，我们在这里演示的方法显示了通过自动化细胞和组织操作、荧光成像和数据分析进行高吞吐量生物医学实验的合适方案。膜阀的关闭开关提供最佳的液体体积、时间和空间分辨率，以重建体外不断变化的复杂环境条件，就像芯片上的器官一样。尽管与过渡性生物医学方法（例如使用96井板的手动程序）相比，该协议要复杂得多，但所提出的协议和平台并不局限于关于细胞和组织功能的研究。组合和连续药物输入的筛选可能使我们能够开发临床应用疗法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢陈氏仪器（中国）有限公司程志峰的技术支持。这项工作得到了资助（中国国家自然科学基金委员会，51927804）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2713 Loker Avenue West | Torrey pines scientific | ||
| AZ-50X | AZ Electronic Materials, Luxembourg | ||
| Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL | Sigma | ||
| CO2 Incubator HP151 | Heal Force | ||
| Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) | Invitrogen | ||
| Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g | Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD. | ||
| FBS | Sigma | ||
| Fibronection 0.25 mg/mL | Millipore, Austria | ||
| Glutamax 100x | Gibco | ||
| Heating Incubator BGG-9240A | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | ||
| Nikon Model Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin | Invitrogen | ||
| Plasma cleaner PDC-002 | Harrick Plasma | ||
| polydimethylsiloxane(PDMS) | Momentive | ||
| polylysine 0.01% | Sigma | ||
| Spin coater ARE-310 | Awatori Rentaro | ||
| Spin coater TDZ5-WS | Cence | ||
| Spin coater WH-SC-01 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| SU-8 3025 | MicroChem, Westborough, MA, USA | ||
| SU-8 3075 | MicroChem, Westborough, MA, USA |
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