Method Article

Mechanische Trennung und Proteinlöslichkeit der äußeren und inneren Perivitelline-Sublayer aus Henneneiern

DOI:

10.3791/61739

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January 27th, 2021

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1Institut National de Recherche pour l'Agriculture, l'Alimentation et l'Environnement, Université de Tours, Biologie des Oiseaux et Aviculture, 37380, Nouzilly, France

In This Article

Summary

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Dieser Artikel berichtet über eine einfache Methode, um die äußeren und inneren Perivitelline-Sublayer von Hühnereiern zu isolieren und gleichzeitig strukturelle Veränderungen zu minimieren und die Proteinlöslichkeit jeder Subschicht für proteomische Analysen zu optimieren.

Abstract

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Die Perivitelinschicht, die das Eigelb umgibt, spielt eine grundlegende Rolle bei der Befruchtung, bei der Eiverteidigung und bei der Entwicklung des Vogelembryons. Es wird von zwei proteinhaltigen Sublayern gebildet, die eng miteinander verbunden sind und durch unterschiedliche weibliche Fortpflanzungsorgane gebildet werden. Beide Strukturen haben vermutlich ihre eigenen funktionalen Besonderheiten, die noch definiert werden müssen. Um die Funktion von Proteinen zu charakterisieren, die jede Subschicht bilden, besteht die erste Herausforderung darin, die Bedingungen zu schaffen, die eine mechanische Trennung dieser beiden komplizierten Schichten ermöglichen, während gleichzeitig strukturelle Schäden begrenzt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die experimentellen Bedingungen zu optimieren, um die Proteinlöslichkeit dieser beiden Sublayer für nachfolgende biochemische Analysen zu erleichtern. Die Effizienz dieses Ansatzes wird durch die Analyse des Proteinprofils jeder Subschicht durch Natriumdodecylsulfat-Poly-Acrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) bewertet, die sich zwischen den beiden Strukturen unterscheiden soll. Dieses zweistufige Verfahren bleibt einfach; es erfordert klassische biochemische Geräte und Reagenzien; und ist mit weiteren tiefgehenden Proteomics kompatibel. Es kann auch auf andere Aviäre Eier für die vergleichende Biologie übertragen werden, in dem Wissen, dass die Struktur und die Zusammensetzung der Perivitelinschicht nachweislich artspezifische Merkmale aufweisen. Darüber hinaus ermöglichen die für die Sublayer-Trennung entwickelten nicht-denaturierenden Bedingungen (Schritt 1) ihre Strukturanalysen durch Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie. Es kann auch den ersten Schritt für die nachfolgende Proteinreinigung darstellen, um ihre jeweiligen biologischen Aktivitäten und 3D-Struktur zu analysieren oder weitere immunhistochemische oder funktionelle Analysen durchzuführen. Solche Studien würden dazu beitragen, die physiologische Funktion dieser beiden Sublayer zu entschlüsseln, deren strukturelle und funktionelle Integriitäten determinante Kriterien für den Fortpflanzungserfolg sind.

Introduction

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Der Zweck dieser Methode ist es, ein Protokoll bereitzustellen, das eine nachfolgende biochemische Charakterisierung der Perivitellineschicht (PL) ermöglicht, einer dünnen proteinhaltigen Schicht, die das Eigelb umschließt und eine grundlegende Rolle bei der Fortpflanzung von Vogelarten spielt. Die PL, in der Literatur auch "Vitelline-Membran" genannt, ist ein dreidimensionales Netzwerk dicker Fasern, das aus mehreren Arten von Glykoproteinen besteht. Es besteht aus einer inneren Perivitelline-Schicht (IPL) (in Kontakt mit dem Dotter), die im Eierstock montiert wird, und einer äußeren Perivitelline-Schicht (OPL, in Kontakt mit dem Weißen), die auf der IPL liegt (Abbildung 1) und vom Infundibulum produziert wird. Letzteres Gewebe ist das trichterartige obere Segment des Eileiters, das den reifen Yolkyfollikel nach dem Eisprung erhält, und der Ort, an dem die Befruchtung stattfindet. Die Sekretion von OPL erfolgt nach diesen beiden Ereignissen und wird durch die sukzessive Ablagerung des Eiweißes und der Eierschale in anderen spezifischen Segmenten des Eileiters gefolgt. Die physiologischen Funktionen von PL hängen nicht nur mit der Befruchtung und den frühen Stadien der Embryogenese zusammen, sondern auch mit dem physischen und molekularen Schutz des Embryos. Die proteomische Analyse von Hühnerei, die auf der gesamten PL durchgeführt wurde, ergab das Vorhandensein von 137 verschiedenen Proteinen1, aber die Verteilung der meisten dieser Proteine zwischen IPL und OPL muss noch aufgeklärt werden. Die minimale Menge an Daten, die im Literaturbericht zur Verfügung stehen, dass IPL und OPL sehr unterschiedliche Proteinprofile2,3,4aufweisen, was auf unterschiedliche strukturelle und funktionelle Eigenschaften hindeutet. Die relative Knappheit der Daten über die Verteilung von Proteinen zwischen OPL und IPL ist wahrscheinlich auf die Schwierigkeit zurückzuführen, beide Sublayer zu trennen, die dünn und eingebettet sind.

Die hier vorgestellte Methode beschreibt die Bedingungen, die verwendet werden müssen, um die beiden Sublayer mit begrenzten Auswirkungen auf ihre jeweilige histologische Struktur zu trennen und ihren Proteingehalt zu erhalten und das Protokoll bereitzustellen, das die vollständige Löslichkeit von Proteinen für die nachfolgende Analyse durch Proteomik ermöglicht. Es umfasst zwei Hauptschritte: 1) PL-Probenahme und OPL/IPL-Trennung und 2) PL-, OPL- und IPL-Behandlung für Proteinlöslichkeit und Elektrophorese für die Massenspektrometrie-Analyse. Der Workflow ist in Abbildung 2dargestellt. Obwohl das vorliegende Protokoll für proteomische Analysen optimiert wurde (Schritt 2.2), kann es bei einigen Schritten für histologische (z. B. Elektronenmikroskopie), immunhistochemische Analysen, funktionelle Studien (Schritt 1) und zur Reinigung salzlöslicher Proteine gestoppt werden, um deren Struktur und biologische Aktivität zu charakterisieren (Schritt 2.1) (Abbildung 2).

Der erste Schritt ist die Entfernung der gesamten PL aus dem Eigelb (Abbildung 2, Schritt 1.1). Alle veröffentlichten Methoden beginnen mit der manuellen Trennung des Eiweißes vom Eigelb oder mit einem Eiabscheider. Es folgt die Entfernung des restlichen Eiweißes und der dicken Chalazae mit Zangen oder durch Adsorption auf einem Filterpapier5 (Abbildung 2A). Als Nächstes sind die Techniken, die für die Beispiel-PL ausgewählt wurden, je nach den veröffentlichten Artikeln variabel. Einige Papiere enthalten mehrere Wäschen des Dotters, in entionisiertem oder destilliertem Wasser1,5,6, in 0,85 bis 1% Salzlösung2,7,8, in Pufferlösungen wie 0,15 M NaCl/N-[Tris(Hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethanesulfonsäure, pH 7.44 , oder in 0.01N HCl (pH 2)3. Diese Verfahren wurden auf Huhn, Ente, Ringhals fasan, graues Rebhuhn, Kakerlakenpapagei, Haustaube oder Laufvögel Eier2,6,9angewendet. Die Entfernung von PL, während das Eigelb in einer Petrischale ohne wässrige Lösungen gehalten wird, kann sehr mühsam sein, da die PL zerbrechlich ist und Eigelb dazu neigt, an PL1,5 zu kleben und daher danach schwer zu beseitigen. Die Verwendung von sauren Puffer oder Lösung für eine Stunde bei 37 °C3 ist auch nicht bevorzugt, da solche Bedingungen pl Struktur verändern und zu Proteinverlust führen können. Es ist auch wichtig, den Bereich zu entfernen, der die Keimscheibe enthält, da diese Zone wahrscheinlich ein ausgeprägtes strukturelles und molekulares Muster aufweist, das nicht die gesamte PL4,6,10 ( Abbildung2B) widerspiegelt. Diese Methode nutzt die in einigen veröffentlichten Artikeln hervorgehobenen Ideen und schlägt einige Verbesserungen vor, um pl sampling zu erleichtern und gleichzeitig ihre Integrität zu wahren (Abbildung 2C).

Der zweite Schritt besteht darin, die beiden Sublayer zu trennen (Abbildung 2, Schritt 1.2). Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung, da OPL und IPL eng aneinander gebunden sind. Dieser Schritt sollte sorgfältig mit Zangen unter einem binokularen Sezieren Mikroskop durchgeführt werden. Veröffentlichungen, die über die OPL/IPL-Trennung berichten, sind sehr begrenzt2,3,7,11 und einige von ihnen verwenden spezifische Bedingungen (saurer Puffer bei 37 °C für 1 h2,3), die die histologische Struktur der Sublayer beeinflussen und/oder zu Proteinverlust oder Eigelb oder weißen Verunreinigungen beitragen können. Um die OPL besser von der IPL zu unterscheiden, berichteten einige Autoren über die Verwendung des Toluidinblaus, um die OPL (die innere Schicht bleibt farblos) leicht zu färben11. In der entwickelten Methode haben wir die Bedingungen so optimiert, dass die Trennung leicht zu erreichen ist und keine Farbstoffe verwendet werden müssen (Abbildung 2D).

Der zweite Hauptschritt ist die Löslichkeit von Proteinen, die jede Subschicht bilden. Klassisch wird es durch Mischen von sauberen lyophilisierten1, getrocknet2,6, oder frisch zubereitet3,4,11 PL/Sublayer direkt mit dem Laemmli Puffer für die Elektrophorese verwendet erreicht. Andere Autoren bevorzugten eine vorläufige Löslichkeit von Schichten in 1% NaCl, in einer 1% SDS-Pufferlösung2,3,11 oder in einer Lösung, die Protease-Inhibitoren und SDS6 bei Raumtemperatur oder Triton enthält, gefolgt von inkubation bei 45 °C12, unter konstantem kräftigem Rühren. Einige Autoren beschrieben auch ein Protokoll, in dem die PL in Phosphatpuffer-Saline oder Harnstoff inkubiert und beschallt wurde13. Auf diese Behandlungen folgten eine Zentrifugation und Verdünnung im Laemmli-Puffer und alle teilen sich den Nachteil einer unvollständigen Proteinlösung aus Schichten, da die unlösliche Materie (das nach der Zentrifugation erhaltene Pellet) aus der zu analysierenden Probe verworfen wird.

Darüber hinaus ist die Verwendung von denatierenden Bedingungen (Harnstoff, Waschmittel, Hochtemperatur usw.) durch bestimmte Autoren für die Proteinlöslichkeit nicht mit der nachfolgenden Proteinreinigung zur Charakterisierung vereinbar, da sie Proteine irreversibel inaktivieren, ihre biologischen Aktivitäten beeinträchtigen und auch ihre 3D-Struktur beeinträchtigen können. Für diesen speziellen Schritt 2 enthält das Protokoll einen ersten Unterschritt, der die Löslichkeit der am häufigsten vorkommenden Proteine unter nicht denaturierenden Bedingungen nach der mechanischen Destrukturierung von PL/OPL/IPL ermöglicht, die bei Bedarf weitere Proteinstudien nicht beeinträchtigen wird (Abbildung 2, Schritt 2.1), und einen zweiten Unterschritt, der eine vollständige Lösung von Proteinen für die Elektrophorese und die eingehende Proteomik ermöglicht (Abbildung 2,Schritt 2.2). Es kombiniert Vorschläge aus verschiedenen veröffentlichten Arbeiten und Anpassungen, die sich aus neuen Ideen ergeben, die durch experimentelle Studien validiert wurden.

Protocol

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1.PL-, IPL- und OPL-Samplings

  1. PL-Probenahme
    1. Brechen Sie das frisch gelegte unbefruchtete Ei manuell und verwenden Sie einen Aufglasbecher liegenden Eiabscheider, um das Eigelb vom Weiß zu trennen. Entfernen Sie die Chalazae mit einer kleinen Schere und rollen Sie das Eigelb über ein Filterpapier, um haftende Albumen zu entfernen, die als transparente und sichtbare Struktur erscheint (Abbildung 2A).
      VORSICHT: Achten Sie darauf, die PL nicht mit einer Schere zu durchstechen. Die Verwendung von Pinzette anstelle von Schere, um Chalazas zu entfernen kann PL Bruch und anschließende Eigelb Leckage provozieren. Der Rollschritt auf dem Filterpapier ist entscheidend und sollte aufgrund der saugfähigen Eigenschaften des Papierfilters, der PL-Bruch auslösen kann, sehr schnell durchgeführt werden. Es ist auch sehr wichtig, ein unbefruchtetes Ei vom Tag der Laien zu verwenden, um den Erfolg dieses ersten Schritts und aller nachfolgenden Schritte zu optimieren. Alternativ können Eier verwendet werden, die weniger als 10 Tage in einer gekühlten Umgebung gelagert wurden, aber Experimentatoren müssen potenzielle Risiken von PL-Änderungen berücksichtigen.
    2. Tauchen Sie das Eigelb in einen Kristallisator mit 10 mM Tris-HCl pH 8 ein, der zuvor auf 4 °C abgekühlt wurde, und entfernen Sie den PL-Bereich über der Keimscheibe innerhalb einer 1 cm Zone mit einer stumpfen Schere(Abbildung 2B).
      HINWEIS: Anfangs wurde PL in entionisiertes Wasser getaucht, aber dieser Ansatz hat einige Nachteile, wie z. B. das Fehlen einer pH-Kontrolle und die Schwierigkeiten, Sublayer anschließend zu trennen (Schritt 1.2). Daher wurden mehrere Bedingungen getestet, darunter die Tris-Konzentration (Abbildung 3A) und pH -Abbildung 3B). Die Verwendung eines Puffers bei pH 8 anstelle von entionisiertem oder demineralisiertem Wasser entspricht der Eiphysiologie (der pH-Wert von Eiweiß beträgt am Tag der Verlegung etwa 7,8)14 und minimiert den Proteinverlust. Im Gegensatz dazu wird ein saurer oder sehr alkalischer pH-Wert vermutet, um EINE PL-Destrukturierung und eine frühe Proteinlösung auszulösen (Abbildung 3B). Der Puffer, der aus 10 mM Tris-HCl pH 8 besteht, erwies sich als optimal, da er die Eiphysiologie respektiert und keine signifikante Proteinlösung verursacht (die Proteinkonzentration im Arbeitspuffer bleibt minimal, Abbildung 3A,B).
    3. Rupture die PL mit einer kleinen Schere im Puffer. Halten Sie die beiden Kanten der gebrochenen PL mit Zangen und schälen Sie die PL vom Eigelb.
    4. Halten Sie die PL mit Zangen und spülen Sie die PL mehrmals in mehreren Bädern von 10 mM Tris-HCl, pH 8, bis keine Spur von Dotter sichtbar ist. Stellen Sie in dieser Phase sicher, dass die PL sauber, weiß und im Puffer schwebend ist. Es kann in Schritt 1.2 für die Sublayer-Trennung oder direkt zu Schritt 2.1 für biochemische Analysen verarbeitet werden.
  2. OPL- und IPL-Probenahme
    1. Verteilen Sie die gesamte PL-Probe, indem Sie OPL nach oben in eine Kunststoff-Petrischale geben und sie mit möglichst weniger Falten flach halten. Bedecken Sie die Probe mit 10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl. Verwenden Sie eine Kunststoff-Petrischale (und nicht Glas), um PL-Bewegungen zu begrenzen, da PL besser an Kunststoff klebt.
      1. Um die OPL-Seite zu finden, sehen Sie sich die Position der verbleibenden Chalazae an, die an die OPL und nicht an die IPL angefügt sind. Dieser Schritt erfordert eine kleine NaCl-Konzentration (50 mM), um die Sublayer-Trennung zu erleichtern.
        HINWEIS: Basierend auf dem Inschaubild in Abbildung 3C und Literatur11sollte diese Konzentration nicht zu einem größeren Proteinverlust führen. Anfangs wurde entionisiertes Wasser verwendet, um die Sublayer zu trennen, wie zuvor beschrieben1,5,6, aber diese Technik wurde als sehr mühsam und führte zu einer Veränderung der strukturellen PL Integrität. Daher wurden verschiedene NaCl-Konzentrationen (Abbildung 3C) getestet, da Salz die Trennung der beiden Sublayer erleichterte. Bemerkenswert ist jedoch, dass die Verwendung der NaCl-Konzentration >100 mM die Proteinlöslichkeit/Freisetzung aus der PL erhöht, was hier nicht das Ziel ist (dies wird das Ziel in Schritt 2 sein) (Abbildung 3C). Das Hinzufügen von 50 mM NaCl zum 10 mM Tris-HCl pH 8 Puffer erleichtert die Trennung der beiden Sublayer und minimiert den Proteinverlust.
    2. Schneiden Sie die gesamte PL mit einer kleinen Schere in Stücke von ca. 2 cm x 3 cm. Trennen Sie mechanisch die beiden Schichten jedes PL-Stücks mit ultrapräzisen Spitzenzangen unter einem binokularen Sezierendes Mikroskop (Abbildung 4). Bewahren Sie die resultierenden IPL- und OPL-Proben bis zur weiteren Verwendung einzeln in Mikroröhrchen bei -80 °C auf.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Es sollte beachtet werden, dass die Effizienz und die Möglichkeit der Trennung der beiden Schichten stark von der Frische des Eis abhängt. Tatsächlich zeigen gelagerte Eier drastische interne Veränderungen aufgrund des raschen Anstiegs des pH-Wertes von Eiweiß und der anschließenden Veränderung des Dotterindex aufgrund der Pl-Lockerung (und Schwächung). IPL ist im Vergleich zu OPL zerbrechlicher. Es ist daher vorzuziehen, die Fläche der OPL oben zu platzieren und die beiden Sublayer zu trennen, indem sie an OPL mit den Zangen ziehen. Beide Sublayer sollten mit kostbarer Sorgfalt behandelt werden.

2. Probenbehandlung für Proteinlöslichkeit und SDS-PAGE-Analysen

  1. Primäre Proteinlöslichkeit
    1. Gefriertrockene IPL- und OPL-Proben einzeln. Nach Abschluss der Gefriertrocknung ca. 1 mg aus jeder Probe in sauberen Mikroröhrchen mit einer leckagesicheren Schraubkappe schneiden. Bewahren Sie die restlichen Proben in dicht verschlossenen Rohren für eine längere Lagerung bei -80 °C auf.
      HINWEIS: Die Verwendung von Mikroröhren mit einer auslaufsicheren Schraubkappe gewährleistet einen hermetischen und auslaufsicheren Verschluss, um eine Probenrehydratation zu verhindern, und sichert die Proben.
    2. Mischen Sie 1 mg jeder lyophilisierten Sublayer mit 400 l von 50 mM Tris pH 7, 500 mM NaCl. Verwenden Sie eine Mischmühle für 2 mal für 5 min bei 30 Hz, um OPL- und OPL-Strukturen in Mikropartikeln aufzulösen und die Proteinlösung zu erleichtern. Sammeln Sie 400 l der Proben, die OPL und IPL enthalten, in zwei sauberen Mikroröhren.
      HINWEIS: Der hier verwendete Puffer wurde gewählt, um die Proteinlöslichkeit zu erhöhen (im Gegensatz zu Schritt 1). Dieser Puffer basierte auf den in Abbildung 3dargestellten Ergebnissen, die eine Erhöhung der Proteinlöslichkeit bei pH 7 (Abbildung 3B) und mit 0,5 M NaCl (Abbildung 3C) zeigen. Das Protokoll kann hier angehalten werden. In diesem Stadium können Proben zur Proteinreinigung von Haupt-PL-Proteinen verwendet oder zu Schritt 2.2 verarbeitet werden.
  2. Proteinlöslichkeit für Elektrophorese
    1. 5x SDS-PAGE Probenpuffer (100 l, 0,25 M Tris-HCl, 0,05% Bromphenolblau, 50% Glycerin, 5% SDS, 5% Beta-Mercaptoethanol, pH 6,8) zu je 400 l der Probe hinzufügen und bei 100 °C für 5 min erhitzen.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten und Proben bei -80 °C gespeichert werden. In dieser Phase des Protokolls werden OPL und IPL vollständig aufgelöst. Die Effizienz der Probenlöslichkeit kann durch Zentrifugieren von Proben für 5 min bei 10.000 x gbeurteilt werden. Die vollständige Löslichkeit zeichnet sich durch das Fehlen sichtbarer Pellets nach der Zentrifugation aus. So wird hier nach vollständiger Löslichkeit davon ausgegangen, dass 1 mg lyophilisierte Sublayer 1 mg Proteine entspricht (die Proteinkonzentration in der 500-L-Probe beträgt 2 mg/ml). Tatsächlich besteht PL aus mehr als 80% Protein2,15. Die Verwendung eines 5x-Probenpuffers begrenzt die Probenverdünnung, aber auch ein 1x- oder 2x-Probenpuffer.
    2. Tragen Sie maximal 20 g Proteine/Lane auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel (4%–20% Gradientengel) und führen Sie die Elektrophorese bei 120 V mit einem vertikalen Elektrophoresesystem durch.
      HINWEIS: Die Verwendung eines 4%–20% Gradientengels ist nicht obligatorisch, ist aber hier vorzuziehen, da OPL und IPL Proteine mit Molekulargewichten von <10 kDa bis >250 kDa aufweisen. Es könnte auch nützlich sein, das Stapelgel (das in der Regel entfernt wird) zu halten, da das Vorhandensein von unlöslichen Proteinen oder Proteinaggregaten am Boden von Brunnen auf eine schlechte Löslichkeit und einen möglichen fehlenden Schritt während der Probenvorbereitung hinweisen würde.
    3. Nach der Elektrophorese Gele von den Glasplatten entfernen und mit Coomassie Brilliant Blue Lösung (50% H2O, 40% EtOH, 10% Essigsäure und R250 Coomassie Brilliant Blue) für 30 min färben.
    4. Entflecken Sie mit einer Lösung bestehend aus 50%H2O, 40% EtOH, 10% Essigsäurelösung, bis der Gelhintergrund hellblau erscheint.
    5. Schließlich das Gel in Petrischalen mit entionisiertem Wasser übertragen, um eine Entfärbung und Rehydratation von Polyacrylamidgelen zu erreichen. Proteine sollten als blaue Bänder mit transparentem Hintergrund erscheinen.

Results

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OPL und IPL wurden von der PL einer frisch gelegten unbefruchteten Ei, um ihre Proteinprofile durch SDS-PAGE zu analysieren, getrennt. Der experimentelle Workflow des gesamten Protokolls ist in Abbildung 2dargestellt. Abbildung 3 zeigt die Proteinfreisetzung in verschiedenen Tris-Konzentrationen (Abbildung 3A), verschiedene pH- (Abbildung 3B) und verschiedene NaCl-Konzentrationen (Abbildung 3C). Die resultierenden zwei Sublayer wurden unter dem Licht des binokularen Sezierensmikroskops beobachtet und sind in Abbildung 4 dargestellt, wo IPL transluzent ist, während OPL dicht, trüb und weißlich ist. Diese Eigenschaften können teilweise für die Effizienz der Sublayer-Trennung aussagen.

Nach der Trennung wurden OPL und IPL unabhängig lyophilisiert, und ihr Proteingehalt wurde durch eine Kombination aus mechanischem Schleifen, der Verwendung eines anionischen Reinigungsmittels (SDS) und eines Reduktionsmittels (Beta-Mercaptoethanol) vollständig aufgelöst, gefolgt vom Kochen. Nach der Migration in einem Polyacrylamid-Gel (SDS-PAGE-Elektrophorese) weisen OPL- und IPL-Proben erwartungsgemäß unterschiedliche elektrophoretische Profile auf (Abbildung 5).

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Abbildung 1: Struktur der PL einer frisch gelegten unbefruchteten Eie. Schematische Darstellung und Transmissionselektronenmikroskopie der gesamten PL im Querschnitt (persönliche Daten, ©Plateforme IBiSA de Microscopie Electronique, Universität und CHRU von Tours, Frankreich, S. Georgeault). Beachten Sie, dass dieses Bild von PL erhalten wurde, wie in diesem Protokoll dargestellt. OPL, äußere Perivitelline-Schicht; IPL, innere Perivitelline-Schicht. Schwarze Pfeilspitze zeigt die kontinuierliche Membran an, die die beiden Sublayer trennt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Workflow, der die beiden Hauptschritte des Protokolls und Anwendungsbeispiele zusammenfasst. Das Protokoll wurde für die proteomische Analyse von PL-Layern optimiert, kann aber bei einigen Schritten für andere Anwendungen angehalten werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Optimierung der Pufferzusammensetzung für PL-Sampling. Kurz gesagt, wurde saubere PL (n = 4) im gleichen Volumen der verschiedenen Pufferlösungen für 2 h inkubiert.PL entfernt wurde, und die Proteinkonzentration wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm im verbleibenden Puffer geschätzt. (A) Wirkung der Tris-HCl-Konzentration bei pH 8. (B) Wirkung des pH-Werts (7 bis 9). (C) Wirkung der NaCl-Konzentration. Aus diesen Ergebnissen kamen wir zu dem Schluss, dass der Puffer aus 10 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM NaCl am besten geeignet ist, da er den Proteinverlust begrenzt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung von vier verschiedenen PL-Proben ausgedrückt. Statistische Analysen wurden mit einseitiger ANOVA durchgeführt, gefolgt von einem Tukey-Mehrfachvergleichstest. Der P-Wert <0,05 wurde als signifikant angesehen (ns, nicht signifikant; * p<0.05, *** p<0.001, **** p<0.0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: OPL- und IPL-Funktionen unter einem binokularen Sezierendes Mikroskop. Nach der Trennung erschien IPL (rechts) transluzent und OPL (links) undurchsichtig. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: SDS-PAGE-Analyse von abgetrenntem OPL und IPL aus frisch gelegten unbefruchteten Eizellen. 4%–20% Acrylamid-Gel gefolgt von Coomassie brillante blaue Färbung. Die Masse der Molekulargewichts-Standardbänder ist in kDa angegeben. Das OPL-Profil besteht hauptsächlich aus Proteinen mit einer Molekularmasse >30 kDa, während die hauptamtenbänder, die auf dem IPL-Profil nachgewiesen werden, molekulare Massen <30 kDa aufweisen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Erfolg des vorliegenden Protokolls beruht auf zwei kritischen Schritten, die unabhängig voneinander optimiert wurden: die mechanische Trennung von OPL und IPL, die so wenig destrukturierend wie möglich sein müssen, gefolgt von der vollständigen Proteinlösung jeder Sublayer, die umgekehrt destrukturiert und denaturierend ist. Er hebt auch einige spezifische Punkte hervor, die berücksichtigt werden müssen, um die erfolgreiche Verwirklichung jedes Einzelnen zu gewährleisten.

Das Protokoll hängt nicht von der Eierschalenfarbe, dem Eigewicht, der Art der Produktion oder dem genetischen Stamm der Henne ab. Es hängt jedoch von der Frische des Eis ab. Tatsächlich erfährt das Ei tiefe interne physikalisch-chemische Veränderungen schnell nach dem Legen, obwohl diese Veränderungen verzögert werden können, wenn die Lagerung unter gekühlten Bedingungen14,15durchgeführt wird. Der Verlust von Kohlendioxid durch die Eierschalenporen während der Lagerung führt zu einer Erhöhung des pH-Werts von Eiweiß (von 7,8 auf 9,5), während einige Wasseraustausche zwischen dem Dotter und dem Weißen in der gesamten PL stattfinden. Beide Modifikationen wirken sich negativ auf die molekulare und histologische Struktur der PL aus, die geschwächt und weniger angespannt wird14,15, wahrscheinlich aufgrund physikalisch-chemischer Veränderungen ihres Proteingehalts16,17,18. Es wird davon ausgegangen, dass die Trennung von Sublayern bei gelagerten Eiern sehr schwierig wird, insbesondere wenn die Lagerung über einen längeren Zeitraum bei Raumtemperatur erfolgt. Bis heute wurde das Protokoll mit Eiern durchgeführt, die weniger als 4 Tage bei 4 °C gelagert wurden, und die maximale Lagerdauer für ein Ei zur effizienten Probe von PL-Sublayern ist noch nicht bekannt. Darüber hinaus ist es entscheidend, wenn das Ziel die Analyse jeder Sublayer ist, ist es entscheidend, unbefruchtete Eier zu verwenden. Am Tag der Verlegung ist der Embryo eines befruchteten Eis 23 h alt und seine Entwicklung ist danach sehr schnell, wenn das Ei inkubiert wird. Tatsächlich dehnen sich die embryonale Entwicklung und das Wachstum einiger extraembryonaler Strukturen aus, indem pl als Substrat umbenutzt wird, das dadurch rasch abgebaut und durch den extraembryonalen Dottersack ersetzt wird19.

Nach der manuellen Trennung von Eigelb und Eiweiß muss das Eigelb von Eiweißspuren und von Chalazae gereinigt werden, die fest an der PL befestigt blieben. Die Spitze ist, das Eigelb vorsichtig auf ein Filterpapier zu rollen und umfangreiche Einwaschungen des Dotters in gepufferten Lösungen (10 mM Tris-HCl pH 8) durchzuführen. Der für den Puffer verwendete pH-Wert entspricht dem physiologischen pH-Wert des Eiweißes14 und hat gezeigt, dass er den Proteinverlust minimiert (Abbildung 3). Die Verwendung eines kühlten Puffers wird dann helfen, die PL aus dem Eigelb zu entfernen, da bei 4 °C der Puffer die PL-Entfernung erleichtert, wenn sich das Lipidgelb zurückzieht und bei dieser Temperatur weniger flüssig wird. Zusätzliche Wässerungen ermöglichen die Entfernung von Dotterrückständen aus der PL. Es ist auch wichtig, die Zone auszuschneiden, die der Keimscheibe entspricht, da diese Struktur, die weiblichen Vorkern enthält, möglicherweise nicht repräsentativ für die PL ist. Es ist der Ort der Befruchtung und Vermehrung der embryonalen Zellen, wenn das Ei befruchtet wird. Es soll eine bestimmte Zusammensetzung haben, die nicht repräsentativ für die gesamte PL sein kann, was der Grund ist, warum es entfernt wurde. Dieser spezielle Schritt wird stark erleichtert, wenn das Eigelb in einen kalten Puffer getaucht wird. Obwohl diese Keimscheibenstruktur im vorliegenden Protokoll (aus den Zielen) verworfen wird, könnten spezifische Analysen dieses Bereichs in befruchteten Eiern für Wissenschaftler, die an der Untersuchung der Entwicklung des PL-Gehalts (Proteomik und Aktivität) und der Struktur (Elektronenmikroskopie) interessiert sind, in den frühen Stadien der Embryogenese19,20,21nützlich sein. In diesem Stadium ist die gesamte PL strukturell intakt und kann für die weitere Strukturanalyse mittels Elektronenmikroskopie verarbeitet werden (Abbildung 2),zu Schritt 1.2 oder zu Schritt 2.1 (wenn das Ziel darin besteht, die gesamte PL zu analysieren).

Schritt 1.2 muss unter einem binokularen Sezierenmikroskop durchgeführt werden, da die PL sehr dünn und zerbrechlich ist (ca. 10 m dick). Die Trennung von Sublayern ist im Wasser oder im Puffer ohne minimales Salz nahezu unmöglich, und erste Versuche mit diesen Optionen haben zu schweren PL-Schäden geführt. Somit bleibt der für diesen Schritt gewählte Puffer bei physiologischem pH-Wert (pH 8) und enthält 50 mM NaCl. Dieser Schritt ist anstrengend und muss sorgfältig und schonend durchgeführt werden, um PL-Reißen zu verhindern. Nach der Trennung können die beiden Sublayer leicht identifiziert werden, da sie besondere physikalische Merkmale aufweisen (undurchsichtig versus transluzent). Ein Mangel an Homogenität der IPL unter dem Licht des Mikroskops sollte eine unvollständige Trennung und damit das Vorhandensein der verbleibenden OPL-Spots widerspiegeln, die auf IPL vorhanden sind. Darüber hinaus ist es sehr schwierig, die gesamte Membran zu behandeln und die Verwendung von 2 cm x 3 cm Stücken erhöht die Erfolgschancen erheblich. Die resultierende Sublayer erhalten ist für die histologische Untersuchung durch Elektronenmikroskopie geeignet (Abbildung 1). Bemerkenswert ist, dass auf dem Mikrographen(Abbildung 1) eine spezifische lineare Struktur (0,05 bis 1 m dick) mit dem Namen "Kontinuierliche Membran" (CM) sichtbar ist und während des Trennungsprozesses in der Regel an der einen oder anderen Sublayer befestigt bleibt. Es wurde bereits veröffentlicht, dass bei Verwendung einer relativ hohen Salzmolarität für die Trennung (500 mM), die CM an OPL7 befestigt blieb, während die Verwendung von Wasser5 die Befestigung von CM an IPL begünstigt. In diesem Protokoll wird eine niedrige Salzmolarität verwendet, um die spezifischen Ziele zu erreichen (PL Sublayer strukturell intakt und minimaler Verlust von Proteinen), was bedeutet, dass dieser CM wahrscheinlich mit IPL verbunden ist. Eine zusätzliche Analyse von IPL und OPL durch Transmissionselektronenmikroskopie würde diese Hypothese jedoch eindeutig aufzeigen. PL-, OPL- oder IPL-Schichten, die am Ende von Schritt 1 erhalten wurden, können auch für In-vitro-Assays für Spermien-Ei-Bindungsanalysen22 oder zur Analyse der frühen Schritte der embryonalen Entwicklung23,24verwendet werden.

Schritt 2 bezieht sich auf die Löslichkeit des Proteingehalts, teilweise (Schritt 2.1) oder vollständig (Schritt 2.2). PL und/oder OPL werden zuerst lyophilisiert, um Wassermoleküle zu entfernen und präzise Gewichtsmessungen zu ermöglichen. Tatsächlich besteht PL hauptsächlich aus Wasser (88%)7, während die Trockenmasse im Wesentlichen Proteine (80% bis 90% je nach Studien), Kohlenhydrate, Fette und Mineralien2,7,25enthält. Wenn man bedenkt, dass das in PL enthaltene Wasser durch Gefriertrocknung entfernt wird, dass Kohlenhydrate im Wesentlichen in PL-Glykoproteinen gewonnen werden und dass Fett und Mineralien aus Dotter stammen, die im Wesentlichen durch umfangreiche Wäschen verworfen werden, wird davon ausgegangen, dass die resultierende PL fast ausschließlich aus Proteinen besteht. Daher sollte der gewichtswert, der nach vollständiger Lyophilisierung ermittelt wird, hauptsächlich Proteinen entsprechen. Die gleiche Menge pl, OPL und/oder IPL werden dann im Puffer mit 0,5 M NaCl verdünnt. Die hohe Salzmolarität, die mit der mechanischen Zerstörung des Fasernetzes durch Schleifen kombiniert wird, erleichtert die Proteinlöslichkeit unter nicht-denaturierenden Bedingungen erheblich. Diesem Schritt folgt die vollständige Löslichkeit mit Siede-, SDS-Waschmittel und dem Reduktionsmittel Beta-Mercaptoethanol (Schritt 2.2). Tatsächlich sind einige IPL-Proteine SDS-lösliche Glykoproteine25,26,27 und die Hauptbestandteile von OPL sind NaCl-löslich1,11. Mit diesem Protokoll haben wir nach der Zentrifugation kein verbleibendes Pellet unlöslicher Proteine gesehen, was darauf hindeutet, dass die Löslichkeit wahrscheinlich abgeschlossen war. Proteine aus PL, OPL und/oder IPL wurden dann von SDS-PAGE analysiert. Die resultierenden Proteinprofile stimmen mit der veröffentlichten Literatur2,4,11,16, aber die Auflösung und Intensität des Signals ist stark verbessert und viel homogener zwischen verschiedenen IPL- und OPL-unabhängigen Proben.

Darüber hinaus wird ein quantitativer Vergleich zwischen OPL und IPL durch die Genauigkeit des Gewichts ermöglicht, das wir für die jeweiligen Sublayer2,7abgeleitet haben. Darüber hinaus sind sowohl OPL- als auch IPL-Profile sehr unterschiedlich und mit Ausnahme eines schwachen Bandes bei 14 kDa und 75 kDa teilen sich beide PL-Sublayer nicht sichtbar Bänder mit dem gleichen Molekulargewicht. Diese Beobachtung bestätigt die Effizienz der Sublayer-Trennung ohne signifikante Kreuzkontamination. Nach der einzigen PL-proteomischenAnalyse,die 1 veröffentlicht wurde, sollten die intensivsten Bänder in OPL (<30 kDa) Lysozym (14 kDa), Vitelline-Membran-Außenschichtprotein 1 (17 kDa), Aviärebeta-Defensin entsprechen. 11 (scheinbares Molekulargewicht von 12 kDa), während die intensiven Bänder von IPL (>30 kDa) wahrscheinlich Zona-Pellucida-Protein 1 (102 kDa) und Zona-Pellucida-Protein 3 (47 kDa) sind. Die Verteilung der sehr reichlich vorhandenen PL-Proteine Ovotransferrin (78 kDa), ovalbumin-bezogenes Protein X (45 kDa), Ovalbumin (43 kDa)1 zwischen Sublayern muss noch aufgeklärt werden. Tatsächlich deutet das hohe Molekulargewicht dieser Proteine (>30 kDa) darauf hin, dass es sich um IPL-Proteine handelt, die auf dem SDS-PAGE-Profil basieren, aber ihre Gewebespezifität (oviduct-expressed proteins) würde diese Proteine lieber OPL28,29zuordnen. Darüber hinaus haben einige eine mögliche Kontamination von PL-Proben durch Eiweiß- und Eigelbproteine aufgrund unzureichender Waschungen vorgeschlagen1. Diese fehlenden Informationen sind die Grundlage für die Entwicklung des vorliegenden Protokolls, das weiter für die eingehende quantitative Proteomik von PL, OPL und IPL verwendet werden soll.

Alternativ ist es ab Schritt 2.1 und nach der Zentrifugation möglich, die unlösliche Materie zu entfernen, einige spezifische Proteine für eine weitere biochemische und biologische Charakterisierung zu extrahieren. Ein solcher Ansatz wurde vor kurzem angewendet, um die biologischen Aktivitäten und/oder die 3D-Struktur der beiden Hauptkomponenten der OPL, des Vitelline-Membran-Außenschichtproteins 1 (VMO1) und des Aviären Beta-Defensins 11 (AvBD11)30,31zucharakterisieren. Die Verfügbarkeit dieser Proteine als gereinigte Moleküle kann auch dazu beitragen, spezifische Antikörper für zusätzliche Experimente wie Immunhistochemie oder für die Entwicklung von quantitativen Assays, einschließlich Enzym-Linked Immunosorbent Assays, zu produzieren.

Die beiden Haupteinschränkungen dieses Protokolls sind (1) die Herausforderung bei der Sublayer-Trennung, insbesondere wenn Eier mehr als 4 Tage bei 4°C gelagert wurden und (2) die Tatsache, dass die vollständige Proteinlösung eine Verringerung und Denaturierung von Puffern erfordert, die die intrinsische biologische Aktivität der resultierenden Proben beeinträchtigen. Was die erste Einschränkung betrifft, so erfordert die mechanische Trennung technische Fähigkeiten, die jedoch nach 2 oder 3 experimentellen Trainings leicht erreicht werden können. Einige IPL-Kleinteile bleiben an der OPL befestigt und umgekehrt, da beide Sublayer eng miteinander verbunden sind. Die Kontamination einer Sublayer durch die andere sollte jedoch minimal sein, wenn die mechanische Trennung vorsichtig durchgeführt wird. Typische IPL- und OPL-SDS-PAGE-Profile nach optimaler Sublayer-Trennung sind in Abbildung 5dargestellt. Was die zweite Einschränkung betrifft, so wurden die in diesem Artikel vorgestellten experimentellen Schritte für proteomische Analysen optimiert, um eine erschöpfende Liste der Proteine zu liefern, die jede Subschicht bilden. Für die weitere Charakterisierung der biologischen Aktivitäten jedes Proteins ist es notwendig, bei Schritt 2.1.2 zu stoppen, bevor denaturierende Bedingungen verwendet werden (Schritt 2.2.1, Verwendung von Puffer mit SDS und Beta-Mercaptoethanol gefolgt vom Kochen). Bemerkenswert ist jedoch, dass Proteine, die aus Schritt 2.1.2 resultieren, nur salzlösliche Proteine sind, während salzunlösliche Proteine Aggregate bilden. Eine Möglichkeit zur weiteren Bewertung ihrer jeweiligen Aktivität kann darin bestehen, salzunlösliche Proteine als rekombinante Proteine unter Verwendung heterologer Systeme(E. coli, Baculovirus, Hefe usw.) zu produzieren.

Dieses Protokoll kann für vergleichende Studien an andere Aviäre Eier angepasst werden, um die Originalität jeder Art besser zu schätzen. Tatsächlich zeigt PL einige Vogelspezifitäten sowohl strukturell als auch in Bezug auf die Proteinzusammensetzung, wahrscheinlich aufgrund der Anpassung an neue Umgebungen, aber auch auf Entwicklungsspezifitäten2,6,9,32. Die Entwicklung dieses Protokolls, das maßvolle Technik und klassische Ausrüstung/Materialien erfordert, eröffnet neue Forschungswege auf dem Gebiet der Vogelreproduktions- und -speziationsstudien.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Philippe Didier und Karine Anger (INRAE, PEAT, 37380, Nouzilly, Frankreich, https://doi.org/10.15454/1.5572326250887292E12) für die Bereitstellung unbefruchteter Isa-brauner Eier. Wir danken auch der Universität Tours, Frankreich für die Finanzierung der Promotion von M. Bregeon. Diese Arbeit wurde von der französischen Nationalen Forschungsagentur (EQLIPSE, ANR-19-CE21-0006) finanziell unterstützt.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Binokulares PräpariermikroskopVision Engineering, FrankreichModell Mantis Elite
LyophilizerCryotec, FrankreichModell Cosmos 80
Mini-Protean II ElektrophoresezelleBiorad, Hercules, USA1652960Alle für Proteinelektrophorese angepassten Geräte
Mischmühle MM400Retsch, Hann, Deutschland20.745.0001Mischmühle geeignet für die Trocken-, Nass- und Kryovermahlung von kleinen Probenmengen
Ultrafeine Sezierschere aus Edelstahl Länge 12 cmDutscher, Brumath5066
Ultrapräzise Pinzette antimagnetisch Edelstahl 9,5x 109,3 mmDutscher, Brumath327005

References

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