Visualisierung der Calcitonin Gene-Related Pepact Immunoreactive Innervation der Ratte Cranial Dura Mater mit Immunfluoreszenz und neuronaler Tracing

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung der räumlichen Korrelation von Calcitonin-Gen-bezogenen Peptid (CGRP)-immunreaktiven Nervenfasern und Blutgefäßen in der Schädel-Dura-Mater unter Verwendung von Immunfluoreszenz bzw. fluoreszierender Histochemie mit CGRP bzw. Phalloidin vor. Darüber hinaus wurde der Ursprung dieser Nervenfasern mit einem fluoreszierenden neuronalen Tracer retrograd nachverfolgt.

Zusammenfassung

Ziel dieser Studie war es, die Verteilung und den Ursprung des Calcitonin-Gen-bezogenen Peptids (CGRP)-immunreaktiven sensorischen Nervenfasern der Schädel-Dura-Mater mittels Immunfluoreszenz, dreidimensionaler (3D) Rekonstruktion und retrogradeTracing-Technik zu untersuchen. Hierwurden die Nervenfasern und Blutgefäße mit Immunfluoreszenz- und Histochemietechniken mit CGRP bzw. fluoreszierendem Phalloidin gefärbt. Die räumliche Korrelation von duralen CGRP-immuoreaktiven Nervenfasern und Blutgefäßen wurde durch 3D-Rekonstruktion nachgewiesen. In der Zwischenzeit wurde der Ursprung der CGRP-immunreaktiven Nervenfasern durch neuronale Tracing-Technik mit Fluorgold (FG) aus dem Bereich um die mittlere Meningealarterie (MMA) in der Schädel-Dura-Mater zum trigeminalen Ganglion (TG) und zervikalen (C) dorsalen Wurzelganglien (DRGs) nachgewiesen. Darüber hinaus wurden die chemischen Eigenschaften von FG-markierten Neuronen in den TG und DRGs zusammen mit CGRP mit doppelten Immunfluoreszenzenzen untersucht. Unter Ausnutzung der transparenten Ganzmontageprobe und der 3D-Rekonstruktion wurde gezeigt, dass CGRP-immunreaktive Nervenfasern und phalloidin-markierte Arteriolen zusammenlaufen oder in einer 3D-Ansicht getrennt ein durales neurovaskuläres Netzwerk bilden. während die FG-markierten Neuronen in den ophthalmologischen, kiefer-, unterkiefer- und unterkieferförmigen Zweigen von TG gefunden wurden, sowie die C2-3 DRGs ipsilateral zur Seite der Tracer-Anwendung, in der einige fg-markierte Neuronen mit CGRP-immunreaktiver Expression präsentierten. Mit diesen Ansätzen demonstrierten wir die Verteilungseigenschaften von CGRP-immunreaktiven Nervenfasern um die Blutgefäße in der Schädel-Dura-Mater sowie den Ursprung dieser Nervenfasern aus TG und DRGs. Aus der Perspektive der Methodik kann es eine wertvolle Referenz für das Verständnis der komplizierten neurovaskulären Struktur der Schädel-Dura-Mater unter dem physiologischen oder pathologischen Zustand bieten.

Einleitung

Die Schädel-Dura-Mater ist die äußerste Schicht von Hirnhäuschen, um das Gehirn zu schützen und enthält reichlich Blutgefäße und verschiedene Arten von Nervenfasern^1,2. Viele Studien haben gezeigt, dass sensibilisierte Schädel-Dura mater kann der Schlüsselfaktor, der das Auftreten von Kopfschmerzen, mit der abnormalen Vasodilatation und Innervation^3,4,5. Daher ist das Wissen über die neurovaskuläre Struktur in der Schädel-Dura-Mater wichtig für das Verständnis der Pathogenese von Kopfschmerzen, insbesondere bei Migrän....

Protokoll

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Instituts für Akupunktur und Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (Referenznummer D2018-09-29-1) genehmigt. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996) durchgeführt. Zwölf erwachsene Sprague-Dawley männliche Ratten (Gewicht 220 ± 20 g) wurden in dieser Studie verwendet. Tiere [Lizenznummer SCXK (JING) 2017-0005] wurden von den National Institutes for Food and Drug Control zur Verfügung gestellt.

1. Innervation der Ratte cranial dura mater

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Ergebnisse

Neurovaskuläre Struktur der Schädel-Dura-Mater
Nach immunfluoreszierenden und fluoreszierenden histochemischen Färbungen mit CGRP und Phalloidin wurden CGRP-immunreaktive Nervenfasern und phalloidin-markierte Duralarteriolen und Bindegewebe in der gesamten Cranial-Dura-Mater in einem 3D-Muster deutlich vorgeführt ( Abbildung2C,D,E,F). Es wurde gezeigt, dass sowohl dicke als auch dünne CGRP-immunreaktive Nervenfasern parall.......

Diskussion

In dieser Studie haben wir erfolgreich die Verteilung und den Ursprung von CGRP-immunreaktiven Nervenfasern in der Schädel-Dura-Mater unter Verwendung von Immunfluoreszenz, 3D-Rekonstruktion und neuronalen Tracing-Ansätzen mit CGRP-Antikörper und FG-neuralem Tracer nachgewiesen, was die histologischen und chemischen Beweise liefert, um das durale neurovaskuläre Netzwerk besser zu verstehen.

Bekanntlich spielt CGRP eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Migräne⁴

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Alexa Fluor 488 Esel Anti-Maus IgG (H+L)	Invitrogen von Thermo Fisher Scientific	A21202	Vor Licht schützen; RRID: AB_141607
Brain Stereotaxis Instrument	Narishige	SR-50
CellSens Dimension	Olympus	Version 1.1	Software des Fluoreszenzmikroskops
Konfokales Bildgebungssystem	Olympus	FV1200
Fluorogold (FG)	Fluorochrom	52-9400	Vor Licht schützen
Fluoreszierendes Bildgebungssystem	Olympus	BX53
Gefriermikrotom	Thermo	Microm International GmbH
Olympus FV10-ASW 4.2a	Olympus	Version 4.2	Konfokales Bildverarbeitungssoftwaresystem
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Maus anti-CGRP	Abcam	ab81887	RRID: AB_1658411
Normales Eselsserum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin 568	Molekular& nbsp; Sonden	A12380	Schutz vor Licht,
Photoshop und  Abbildung	Adobe	CS6	Fotobearbeitungssoftware
Kaninchen Anti-Fluorgold	Abcam	ab153	RRID: AB_90738
Sprague Dawley	National Institutes for Food and Drug Control	SCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus Objektträger	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm