Methodenartikel

Visualisierung der Calcitonin Gene-Related Pepact Immunoreactive Innervation der Ratte Cranial Dura Mater mit Immunfluoreszenz und neuronaler Tracing

DOI:

10.3791/61742

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6. Januar 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung der räumlichen Korrelation von Calcitonin-Gen-bezogenen Peptid (CGRP)-immunreaktiven Nervenfasern und Blutgefäßen in der Schädel-Dura-Mater unter Verwendung von Immunfluoreszenz bzw. fluoreszierender Histochemie mit CGRP bzw. Phalloidin vor. Darüber hinaus wurde der Ursprung dieser Nervenfasern mit einem fluoreszierenden neuronalen Tracer retrograd nachverfolgt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ziel dieser Studie war es, die Verteilung und den Ursprung des Calcitonin-Gen-bezogenen Peptids (CGRP)-immunreaktiven sensorischen Nervenfasern der Schädel-Dura-Mater mittels Immunfluoreszenz, dreidimensionaler (3D) Rekonstruktion und retrogradeTracing-Technik zu untersuchen. Hierwurden die Nervenfasern und Blutgefäße mit Immunfluoreszenz- und Histochemietechniken mit CGRP bzw. fluoreszierendem Phalloidin gefärbt. Die räumliche Korrelation von duralen CGRP-immuoreaktiven Nervenfasern und Blutgefäßen wurde durch 3D-Rekonstruktion nachgewiesen. In der Zwischenzeit wurde der Ursprung der CGRP-immunreaktiven Nervenfasern durch neuronale Tracing-Technik mit Fluorgold (FG) aus dem Bereich um die mittlere Meningealarterie (MMA) in der Schädel-Dura-Mater zum trigeminalen Ganglion (TG) und zervikalen (C) dorsalen Wurzelganglien (DRGs) nachgewiesen. Darüber hinaus wurden die chemischen Eigenschaften von FG-markierten Neuronen in den TG und DRGs zusammen mit CGRP mit doppelten Immunfluoreszenzenzen untersucht. Unter Ausnutzung der transparenten Ganzmontageprobe und der 3D-Rekonstruktion wurde gezeigt, dass CGRP-immunreaktive Nervenfasern und phalloidin-markierte Arteriolen zusammenlaufen oder in einer 3D-Ansicht getrennt ein durales neurovaskuläres Netzwerk bilden. während die FG-markierten Neuronen in den ophthalmologischen, kiefer-, unterkiefer- und unterkieferförmigen Zweigen von TG gefunden wurden, sowie die C2-3 DRGs ipsilateral zur Seite der Tracer-Anwendung, in der einige fg-markierte Neuronen mit CGRP-immunreaktiver Expression präsentierten. Mit diesen Ansätzen demonstrierten wir die Verteilungseigenschaften von CGRP-immunreaktiven Nervenfasern um die Blutgefäße in der Schädel-Dura-Mater sowie den Ursprung dieser Nervenfasern aus TG und DRGs. Aus der Perspektive der Methodik kann es eine wertvolle Referenz für das Verständnis der komplizierten neurovaskulären Struktur der Schädel-Dura-Mater unter dem physiologischen oder pathologischen Zustand bieten.

Einleitung

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Die Schädel-Dura-Mater ist die äußerste Schicht von Hirnhäuschen, um das Gehirn zu schützen und enthält reichlich Blutgefäße und verschiedene Arten von Nervenfasern1,2. Viele Studien haben gezeigt, dass sensibilisierte Schädel-Dura mater kann der Schlüsselfaktor, der das Auftreten von Kopfschmerzen, mit der abnormalen Vasodilatation und Innervation3,4,5. Daher ist das Wissen über die neurovaskuläre Struktur in der Schädel-Dura-Mater wichtig für das Verständnis der Pathogenese von Kopfschmerzen, insbesondere bei Migräne.

Obwohl die Dura-Innervation zuvor mit der konventionellen Immunhistochemie untersucht wurde, wurde die räumliche Korrelation von Nervenfasern und Blutgefäßen in der Schädel-Dura-Mater weniger untersucht6,7,8,9. Um die durale neurovaskuläre Struktur genauer zu zeigen, wurden Calcitonin-Gen-bezogenes Peptid (CGRP) und Phalloidin als Marker für die jeweils Färbung der duralen Nervenfasern und Blutgefäße in der vollbepfebten Kranial-Dura-Mater mit Immunfluoreszenz und fluoreszierender Histochemie10ausgewählt. Es kann eine optimale Wahl sein, um eine dreidimensionale (3D) Ansicht der neurovaskulären Struktur zu erhalten. Zusätzlich wurde Fluorgold (FG) auf dem Gebiet um die mittlere Meningealarterie (MMA) in der Schädel-Dura-Mater angewendet, um den Ursprung von CGRP-immunreaktiven Nervenfasern zu bestimmen, und auf das trigeminale Ganglion (TG) und die zervikale (C) dorsale Wurzelganglien (DRGs) zurückverfolgt, während die FG-markierten Neuronen zusammen mit CGRP weiter untersucht wurden.

Ziel dieser Studie war es, ein wirksames Instrument zur Untersuchung der neurovaskulären Struktur im Schädel-Dura-Mater für die CGRP-immunreaktive Innervation und ihren Ursprung bereitzustellen. Durch die Nutzung des transparenten Vollmontage-Dura-Maters und die Kombination von Immunfluoreszenz, retrogradetracing, konfokalen Techniken und 3D-Rekonstruktion, erwarteten wir, eine neuartige 3D-Ansicht der neurovaskulären Struktur in der Schädel-Dura-Mater zu präsentieren. Diese methodischen Ansätze können weiter zur Erforschung der Pathogenese verschiedener Kopfschmerzen dienen.

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Protokoll

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Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Instituts für Akupunktur und Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (Referenznummer D2018-09-29-1) genehmigt. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996) durchgeführt. Zwölf erwachsene Sprague-Dawley männliche Ratten (Gewicht 220 ± 20 g) wurden in dieser Studie verwendet. Tiere [Lizenznummer SCXK (JING) 2017-0005] wurden von den National Institutes for Food and Drug Control zur Verfügung gestellt.

1. Innervation der Ratte cranial dura mater

  1. Perfusionen
    1. Intraperitoneal injizieren Sie eine Überdosierung von Tribromethanollösung (250 mg/kg) bei der Ratte, um Euthanasie zu induzieren.
    2. Sobald der Atem aufhört, durchlässig mit 100 ml mit 0,9% normaler Saline, gefolgt von 250-300 ml 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (PB, pH 7,4).
    3. Nach der Perfusion, entfernen Sie die Kopfhaut und öffnen Sie den Schädel, um die Dura mater und dorsale Seite des Gehirns auszusetzen. Dann sezieren Sie die Schädel-Dura-Mater entlang des Hirnstamms auf die Olfaktor-Lampe im ganzen Montagemuster (Abbildung 1). Führen Sie die Postfixierung in 4% Paraformaldehyd für 2 h durch und kryoprotekten Sie dann bei 25% Saccharose in 0,1 M PB für mehr als 24 h bei 4 °C.
  2. Fluoreszenz-Immunhistochemie zur CGRP- und Phalloidin-Etikettierung
    HINWEIS: Eine Kombination aus fluoreszierender Färbung von CGRP und Phalloidin wurde angewendet, um die räumliche Korrelation von duralen Nervenfasern und Blutgefäßen in der Ratte Cranial Dura mater im ganzen Mount-Muster zu offenbaren.
    1. Spülen Sie die Schädel-Dura-Mater in 0,1 M PB für ca. 1 min.
    2. Inkubieren Sie die Dura mater in einer Blockierenden Lösung, die 3% normales Eselsserum und 0,5% Triton X-100 in 0,1 M PB für 30 min enthält.
    3. Den Dura mater in mausanti-CGRP Antikörper (1:1000) in 0,1 M PB mit 1% normalem Eselsserum und 0,5% Triton X-100 über Nacht bei 4 °C11übertragen.
    4. Waschen Sie die Dura mater am nächsten Tag dreimal in 0,1 M PB.
    5. Inkubieren Sie den Dura mater in einer gemischten Lösung von Esel-Anti-Maus Alexa Fluor 488 Sekundärantikörper (1:500) und Phalloidin 568 (1:1000) in 0,1 M PB mit 1% normalem Eselserum und 0,5% Triton X-100 für 1,5 h bei Raumtemperatur (26 °C).
    6. Waschen Sie die Dura mater dreimal in 0,1 M PB.
    7. Schneiden Sie die Kanten und montieren Sie sie auf Mikroskopschlitten (siehe Tabelle der Materialien).
    8. Vor der Beobachtung auf Deckellips mit 50% Glycerin setzen.
  3. Beobachtung und Aufzeichnung
    1. Beobachten Sie die fluoreszierenden Proben unter einem Fluoreszenzmikroskop oder einem konfokalen Bildgebungssystem.
    2. Nehmen Sie die Bilder der Vollmontage-Dura mater mit einem Fluoreszenzmikroskop mit digitaler Kamera (4x, NA: 0,13) auf und verwenden Sie eine Belichtungszeit von 500 ms. Die Bildmosaiken der Dura mater wurden mit einer Software des Fluoreszenzmikroskops vervollständigt (siehe Tabelle der Materialien).
    3. Nehmen Sie Bilder der CGRP-immunreaktiven Nervenfasern und phalloidin-markierten Blutgefäße in der Dura mater mit einem konfokalen Mikroskop auf. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen waren 488 nm (grün) und 594 nm (rot). Das konfokale Loch ist 110 (20x) und 105 m (40x). Die Auflösung der Bildaufnahme beträgt 640 x 640 Pixel.
    4. Erfassen Sie 20 Bilder in 2 'm-Frames von jedem 40 m dicken Abschnitt und führen Sie eine einzige In-Fokus-Bildintegration mit einem konfokalen Bildverarbeitungs-Softwaresystem für die 3D-Analyse wie folgt durch: Set Start Focal Plane | Set End-Fokusebene | Festlegen der Schrittgröße | Wählen Sie Tiefenmuster | Bildaufnahme | Z-Serie.
    5. Verwenden Sie eine Fotobearbeitungssoftware, um die Helligkeit und den Kontrast von Bildern anzupassen, um die Visualisierung zu optimieren. Achten Sie darauf, keine Daten aus den Bildern zu entfernen.

2. Retrograde Tracing-Studie mit FG

  1. Chirurgische Eingriffe
    1. Bestimmen Sie den Koordinatenbereich von Interesse in Ratte Cranial dura mater.
    2. Bereiten Sie eine 10-L-Mikrospritze vor und testen Sie sie mit flüssigem Paraffin.
    3. Anästhetisieren Sie die Ratten mit Tribromoethanollösung (150 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion. Überprüfen Sie die Tiefe in der Anästhesie durch die fehlende Reaktion auf Zehenkneifung.
    4. Rasieren Sie den Kopf der Ratte mit einem elektrischen Rasiermesser.
    5. Legen Sie stumpfe Ohrstangen auf die Ratte und legen Sie sie auf das stereotaxic Gerät. Dann den Mundhalter setzen und ophthalmologische Salbe auf die Augen auftragen.
    6. Reinigen Sie die chirurgische Stelle der Kopfhaut mit 10% Povidon-Jod gefolgt von 75% Ethanol.
    7. Machen Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie der Kopfhaut.
    8. Entfernen Sie das Periost- und Muskelgewebe mit sterilen Baumwoll-Applikatoren(Abbildung 1A) stumpf vom Schädel.
    9. Bohren Sie ein kleines Loch (ca. 5-7 mm) mit einem Gratbohrer mit einem Rundspitzenbit (#106) auf den linken parietalen und zeitlichen Knochen über dem MMA12, und stellen Sie sicher, dass die Schädel-Dura-Matte intakt gehalten wurde (Abbildung 1B).
    10. Bauen Sie eine Bank um das Loch mit Zahnsilikatzement, um die Ausbreitung des Tracers zu begrenzen (Abbildung 1C).
    11. Fügen Sie mit einer 10-L-Mikrospritze 2 l von 2 % FG in das Loch um MMA ein(Abbildung 1D).
    12. Bedecken Sie das Loch mit einem kleinen Stück hämostatischen Schwamm.
    13. Legen Sie ein Stück Paraffinfolie auf das Loch und versiegeln Sie die Ränder mit Knochenwachs, um das Auslaufen des Tracers zu verhindern und eine Kontamination des umgebenden Gewebes zu vermeiden.
    14. Die Wunde mit sterilem Faden besonieren.
    15. Halten Sie die Ratten in einem warmen Bereich, bis sie vollständig erholt sind.
    16. Bringen Sie die Ratten in ihre Käfige zurück und fügen Sie ein Antibiotikum und Schmerzmittel in das Trinkwasser ein.
  2. Perfusionen und Abschnitte
    1. Nach 7 Überlebenstagen diese Ratten, wie oben in den Verfahren in Abschnitt 1.1 erwähnt, durchdringen.
    2. Sezieren Sie die TG- und C1-4-DRGs, dann post-fix und kryoprotect sie wie oben in Abschnitt 1.1.3 (Abbildung 1F) erwähnt.
    3. Schneiden Sie die TG und DRGs in der Dicke von 30 m auf einem Kryostat-Mikrotom-System in sagittaler Richtung und montiert auf silanbeschichteten Glasschlitten.
  3. Doppelte Immunfluoreszenzenzen zensiert für fg- und CGRP-Kennzeichnung in TG und DRGs
    HINWEIS: Obwohl die FG-Kennzeichnung direkt mit UV-Beleuchtung unter Quecksilberlampe ohne zusätzliche Färbung13,14,15,16beobachtet werden kann, wurden die markierten Neuronen mit FG weiter in TG und Zervix-DRGs unter Verwendung von doppelimmunfluoreszenzenzen mit FG und CGRP untersucht, um die Ursprünge der duralen CGRP-immunaktiven Nervenfasern in der TG und DRGs aufzudecken.
    1. Kreisen Sie die Abschnitte mit dem histochemischen Stift ein.
    2. Inkubieren Sie die Abschnitte für 30 min in einer Blockierenden Lösung, die 3% normales Eselsserum und 0,5% Triton X-100 in 0,1 M PB enthält.
    3. Übertragen Sie die Proben in die Lösung von Kaninchen Antifluorogold (1:1000) und Maus Anti-CGRP Antikörper (1:1000) in 0,1 M PB mit 1% normalem Eselsserum und 0,5% Triton X-100 über Nacht bei 4 °C.
    4. Waschen Sie die Abschnitte am nächsten Tag dreimal in 0,1 M PB.
    5. Inkubieren Sie in einer gemischten Lösung von Esel Anti-Kaninchen Alexa Fluor 594 (1:500) und Esel Anti-Maus Alexa Fluor 488 (1:500) Sekundärantikörper in 0,1 M PB enthält 1% normales Eselsserum und 0,5% Triton X-100 für 1,5 h bei Raumtemperatur.
    6. Waschen und tragen Sie Deckel auf die Abschnitte als Verfahren in den Schritten 1.2.6 und 1.2.8 auf.
  4. Beobachtung und Aufzeichnung
    1. Nehmen Sie Bilder der FG-markierten Neuronen in TG und DRGs unter UV-Beleuchtung durch ein Fluoreszenzmikroskop mit Digitalkamera auf.
    2. Erfassen Sie Bilder der FG- und CGRP-markierten Neuronen in TG und DRGs unter einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist.
    3. Verwenden Sie die Bearbeitungssoftware, um die Helligkeit und den Kontrast von Bildern anzupassen und Beschriftungen in den Bildern hinzuzufügen.

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Ergebnisse

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Neurovaskuläre Struktur der Schädel-Dura-Mater
Nach immunfluoreszierenden und fluoreszierenden histochemischen Färbungen mit CGRP und Phalloidin wurden CGRP-immunreaktive Nervenfasern und phalloidin-markierte Duralarteriolen und Bindegewebe in der gesamten Cranial-Dura-Mater in einem 3D-Muster deutlich vorgeführt ( Abbildung2C,D,E,F). Es wurde gezeigt, dass sowohl dicke als auch dünne CGRP-immunreaktive Nervenfasern parall...

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Diskussion

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In dieser Studie haben wir erfolgreich die Verteilung und den Ursprung von CGRP-immunreaktiven Nervenfasern in der Schädel-Dura-Mater unter Verwendung von Immunfluoreszenz, 3D-Rekonstruktion und neuronalen Tracing-Ansätzen mit CGRP-Antikörper und FG-neuralem Tracer nachgewiesen, was die histologischen und chemischen Beweise liefert, um das durale neurovaskuläre Netzwerk besser zu verstehen.

Bekanntlich spielt CGRP eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Migräne4

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde durch das Projekt des National Key F&D Program of China (Projektcode-Nr. 2019YFC1709103; Nr. 2018YFC1707804) und der National Natural Science Foundation of China (Projektcode-Nr. 81774211; Nr. 81774432; Nr. 81801561) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Alexa Fluor 488 Esel Anti-Maus IgG (H+L)Invitrogen von Thermo Fisher ScientificA21202Vor Licht schützen; RRID: AB_141607
Brain Stereotaxis InstrumentNarishigeSR-50
CellSens DimensionOlympusVersion 1.1Software des Fluoreszenzmikroskops
Konfokales BildgebungssystemOlympusFV1200
Fluorogold (FG)Fluorochrom52-9400Vor Licht schützen
Fluoreszierendes BildgebungssystemOlympusBX53
GefriermikrotomThermoMicrom International GmbH
Olympus FV10-ASW 4.2aOlympusVersion 4.2Konfokales Bildverarbeitungssoftwaresystem
Micro DrillSaeyang MicrotechMarathon-N7
Maus anti-CGRPAbcamab81887RRID: AB_1658411
Normales EselsserumJackson ImmunoResearch017-000-121
Phalloidin 568Molekular& nbsp; SondenA12380Schutz vor Licht,
Photoshop und  AbbildungAdobeCS6Fotobearbeitungssoftware
Kaninchen Anti-FluorgoldAbcamab153RRID: AB_90738
Sprague DawleyNational Institutes for Food and Drug ControlSCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus ObjektträgerThermo#4951PLUS-00125x75x1mm

Referenzen

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Immunfluoreszenzf rbungNeural Tracing TechnikFluorogold RetrogradmarkierungKonfokalmikroskopische BildgebungTrigeminusganglionzervikale Spinalganglien3D RekonstruktionWhole Mount Pr paration

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