Methodenartikel

Kryokonservierung von Eizellen aus dem Eierstockgewebe zur Optimierung der Fertilitätserhaltung bei präpubertären Mädchen und Frauen

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DOI:

10.3791/61777

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23. Oktober 2020

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1Développement Embryonnaire Précoce Humain et Pluripotence, Univ Montpellier, INSERM 1203, 2Département de Biologie de la Reproduction, Biologie de la Reproduction/DPI et CECOS, CHU Montpellier, Univ Montpellier, 3Centre d'AMP-CECOS, CHU Grenoble-Alpes, Univ Grenoble-Alpes

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir schlagen ein Protokoll zur Erhaltung der Fruchtbarkeit bei präpubertären Mädchen und Frauen mit dem Risiko einer vorzeitigen Ovarialinsuffizienz vor. Es kombiniert das Einfrieren von Eierstockgewebe und die Kryokonservierung von Eizellen, die aus Eierstockgewebe entnommen wurden. Diese Strategie verbessert die Sicherheit und optimiert das Fortpflanzungspotenzial der Fruchtbarkeitserhaltung, wodurch die Chance auf eine Geburt maximiert wird.

Zusammenfassung

Die Kryokonservierung des menschlichen Ovarialgewebes (OTC) wird weltweit zunehmend eingesetzt, um die weibliche Fertilität bei präpubertären Mädchen und Frauen mit einem Risiko für eine vorzeitige Ovarialinsuffizienz (POI) im Rahmen dringender gonadotoxischer Behandlungen oder Eierstockoperationen zu erhalten. Die Erhaltung der Fruchtbarkeit ist eine Herausforderung, da es keinen Konsens über das Patientenmanagement, die Strategien zur Erhaltung der Fruchtbarkeit oder sogar die technischen Laborprotokolle gibt, was bedeutet, dass jedes Verfahren an die Merkmale des Patientenprofils und sein eigenes Risiko-Nutzen-Verhältnis angepasst werden muss. Während der OTC können reife/unreife Eizellen direkt aus großen/kleinen Antralfollikeln in Eierstockgewebeproben aspiriert und/oder während der Dissektion von Eierstockgewebe bei präpubertären Mädchen und Frauen aus wachsenden Follikeln in Kulturmedien freigesetzt werden. In diesem Manuskript stellen wir ein Protokoll vor, das das Einfrieren von Eierstockgewebe mit der Kryokonservierung von reifen/unreifen Eizellen aus Eierstockgewebeproben kombiniert, wodurch das Fortpflanzungspotenzial der Fertilitätserhaltung verbessert wird. Die angemessene Entnahme, Handhabung und Lagerung von Eierstockgewebe und Eizellen vor, während und nach der Kryokonservierung wird beschrieben. Die anschließende Verwendung und Sicherheit von kryokonservierten/aufgetauten Ovarialgewebeproben und Eizellen wird ebenfalls diskutiert, ebenso wie der optimale Zeitpunkt für die In-vitro-Reifung unreifer Eizellen. Wir empfehlen die systematische Anwendung dieses Protokolls bei der Fertilitätserhaltung von präpubertären Mädchen und Frauen, da es das gesamte Fortpflanzungspotenzial der Fertilitätserhaltung erhöht (d. h. die Vitrifizierung von Eizellen zusätzlich zu OTC) und auch die Sicherheit und Anwendung der Fertilitätserhaltung verbessert (d. h. Auftauen von Eizellen im Vergleich zu Eierstocktransplantat), wodurch die Chance auf eine erfolgreiche Geburt für die Patientinnen mit POI-Risiko maximiert wird.

Einleitung

Der Bereich der Fertilitätserhaltung ist in den letzten zwei Jahrzehnten aufgrund der steigenden Zahl von Patientinnen mit dem Risiko einer vorzeitigen Ovarialinsuffizienz (POI) gewachsen1,2,3. Die derzeit verfügbaren medizinischen Optionen zur Erhaltung der Fruchtbarkeit sind die Kryokonservierung von Eierstockgewebe (OTC)4, das Einfrieren von Eizellen/Embryonen nach Stimulation der Eierstöcke5, die Verabreichung von GnRH-Analoga6 oder die Transposition der Eierstöcke7. OTC ist ein großer Fortschritt für die Erhaltung der Fruchtbarkeit, insbesondere bei präpubertären Mädchen, wo es die einzige derzeit verfügbare Option zur Erhaltung der Fruchtbarkeit ist, und auch bei Frauen, die den Beginn ihrer gonadotoxischen Behandlung nicht hinauszögern können 2,4.

OTC ermöglicht die Erhaltung einer hohen Anzahl von Primordialfollikeln, die sich in den äußeren 1 mm der Ovarialrindebefinden 2. Gefrorenes/aufgetautes Ovarialgewebe kann anschließend durch Transplantat (orthotop oder heterotop, autolog oder Spender) verwendet oder in vitro kultiviert werden, um reife Eizellenzu gewinnen 2. Es wurde gezeigt, dass die Transplantation von gefrorenen und aufgetauten präpubertären Ovarialgewebeproben die Pubertät induziert 8,9. Bei Frauen sind die Fortpflanzungsergebnisse nach orthotoper Autotransplantation der eingefrorenen und aufgetauten Ovarialrinde beruhigend, wobei die Lebendgeburtenraten nach natürlichen Empfängnissen 57,5 % erreichen10 und zwischen 30 % und 70 % nach assistierten Reproduktionstechniken (ART)11 liegen. Seit der ersten Lebendgeburt aus orthotoper Transplantation von eingefrorenem/aufgetautem menschlichem Eierstockgewebe im Jahr 200412 ermöglichte diese Technik die Geburt von mindestens 130 Kindern weltweit2. Die hormonellen und reproduktiven Funktionen des Transplantatgewebes halten in der Regel mehrere Jahre an 11,13,14, was seine langfristige Funktionalität bestätigt.

Die Autotransplantation von Eierstockgewebeproben birgt jedoch bei einigen Patientinnen ein theoretisches Risiko der Wiedereinführung lebensfähiger maligner Zellen 15,16,17,18, insbesondere bei Leukämieüberlebenden19. Bisher wurde bei gesunden Krebsüberlebenden kein Fall von Krebsübertragung über das Transplantat der gefrorenen/aufgetauten Ovarialrinde berichtet11, was darauf hindeutet, dass die fibröse avaskuläre Natur der Ovarialrinde eine unwirtliche Mikroumgebung für die Verbreitung bösartiger Zellen darstellen könnte. Nichtsdestotrotz stellt die Transplantation von Eierstockgewebe nach wie vor eine experimentelle und herausfordernde Technik dar, was darauf hindeutet, dass die Verwendung von Eizellen derzeit als einfacherer und sichererer Ansatz zur Wiederherstellung der Fruchtbarkeit angesehen werden sollte als die Transplantation von Eierstockgewebe. Interessanterweise konnten unreife Eizellen während der OTC sowohl bei präpubertären Mädchen als auch bei Frauen leicht aus dem Eierstockgewebe entnommen werden16, was darauf hindeutet, dass dies eine zuverlässige Quelle darstellen könnte, um das Potenzial zur Wiederherstellung der Fruchtbarkeit zusätzlich zum Einfrieren des ovariellen kortikalen Gewebes zu maximieren. Diese Eizellen könnten manuell ex vivo im ART-Labor aus sichtbaren Antralfollikeln aspiriert oder nach der Dissektion des Ovarialgewebes aus verbrauchten Medien isoliert werden. Die entnommenen Eizellen könnten dann in einem unreifen Stadium direkt vitrifiziert oder vor dem Vitrifikationsschritt mittels In-vitro-Reifung (IVM) gereift werden20,21.

In diesem Manuskript schlagen wir ein Protokoll vor, das die Kryokonservierung von Eierstockgewebe mit der Isolierung und Kryokonservierung von reifen (Eizellen im MII-Stadium) und/oder unreifen Eizellen (d.h. Eizellen im Keimvesikel (GV) und Metaphase I (MI)-Stadium) aus dem Eierstockgewebe kombiniert. Dieses Protokoll beschreibt alle spezifischen Schritte, die erforderlich sind, um das Potenzial zur Erhaltung der Fruchtbarkeit sowohl bei präpubertären Mädchen als auch bei Frauen zu maximieren.

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Protokoll

Alle Frauen (über 18 Jahre) sowie alle minderjährigen Mädchen und ihre Eltern haben eine Einverständniserklärung unterschrieben, um die Fruchtbarkeit der Patientin mit POI-Risiko zu erhalten. Dieses Protokoll gilt in unserem Zentrum für Fruchtbarkeitserhaltung als routinemäßiges ART-Verfahren. Es folgt den Richtlinien der Ethikkommission unserer Institution.

1. Qualitätskontrolle

  1. Umfassen Frauen im Alter ≤ 38 Jahren, die eine zirkulierende Konzentration des Anti-Müller-Hormons >1 ng/ml enthalten und das Vorhandensein eines erhöhten Risikos für POI aufgrund einer gonadotoxischen Behandlung zeigen. Frauen ausschließen, die für eine Vitrifizierung der Eizelle zur Erhaltung der Fruchtbarkeit in Frage kommen, Frauen mit einer Erkrankung, die eine vollständige Einwilligungserklärung verhindert, oder Frauen mit einem hohen Risiko für Komplikationen durch Anästhesie oder Operation.
  2. Vergewissern Sie sich, dass eine unterschriebene Patienteneinwilligung vorliegt, bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen.
  3. Identifizieren Sie zwei freie Standorte innerhalb von zwei verschiedenen Kryokonservierungslagertanks. Die Hälfte der Kryoröhrchen/Halme wird im ersten Lagertank aufbewahrt, während die andere Hälfte der Kryoröhrchen/Halme im anderen Tank aufbewahrt wird, um das Risiko eines Totalverlusts der Proben im Falle eines Tankausfalls zu minimieren.
  4. Prüfen Sie die Verfügbarkeit und Funktionalität aller in diesem Protokoll geforderten Medizinprodukte. Für den Präparierschritt empfiehlt sich eine sterile chirurgische Präparierschere mit scharfen, geraden Klingen und fein geschärften Spitzen sowie eine sterile atraumatische Gewebezange.
  5. Überprüfen, ob alle Qualitätskontrollschritte für alle Medizinprodukte eingehalten wurden (insbesondere Validierung und Routinekontrolle von Sterilisationsprozessen, Überprüfung des Verfalls/der Chargennummer und Verfolgung).
  6. Halten Sie während des gesamten Eingriffs eine aseptische/sterile Umgebung aufrecht und beachten Sie alle Sicherheitsvorkehrungen mit Vorsicht.
  7. Verwenden Sie für jeden Patienten unterschiedliche Schalen, Pipetten und chirurgische Instrumente.

2. Am Tag vor der Konservierung

  1. Bereiten Sie eine sterile 60-mm-IVF-Petrischale vor, die ein mit Mineralöl bedecktes IVF-Medium enthält, und inkubieren Sie die Schale über Nacht bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5 % O2 und 5 % CO2. Verwenden Sie diese Schale, um die Kumulus-Eizell-Komplexe (KOK) zu sammeln, die möglicherweise aus dem Gewebe entnommen werden (siehe Abschnitt 7.2).
  2. Bereiten Sie eine sterile 35-mm-IVF-Petrischale mit IVF-Medium vor und inkubieren Sie die Schale über Nacht bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5 % O2 und 5 % CO2. Verwenden Sie diese Schale für den Schritt der Eizellentblößung (siehe Abschnitt 9.1).
  3. Bereiten Sie eine sterile 35-mm-IVF-Petrischale mit IVF-Medium vor, das mit Mineralöl bedeckt ist, und inkubieren Sie die Schale über Nacht bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5 % O2 und 5 % CO2. Verwenden Sie diese Schale, um die Eizellen nach dem Denudationsschritt zu entnehmen (siehe Abschnitt 9.4).

3. Entnahme und Transport von Eierstockgewebe

  1. Führen Sie die laparoskopische Operation unter Vollnarkose mit einem 10-mm-Port am Nabel und zwei 5-mm-Ports durch, einer im link-unteren Quadranten und ein weiterer im rechten Quadranten.
  2. Führen Sie eine partielle oder vollständige einseitige Oophorektomie gemäß der Konsensentscheidung des Onkologen, des Chirurgen und des medizinischen Personals der ART-Einheit auf der Grundlage der ovariellen Reserve, der Größe und des makroskopischen Aspekts beider Eierstöcke (Abbildung 1, A1–B1) und des geplanten gonadotoxischen Protokolls durch. Führen Sie die Oophorektomie mit einer scharfen Schere oder einer chirurgischen Klammer durch. Verwenden Sie keine Präpariergeräte, die kollaterale, elektrische oder thermische Verletzungen des zu erhaltenden Eierstockgewebes hervorrufen könnten.
    HINWEIS: Eine vollständige unilaterale Oophorektomie wird in der Regel bei präpubertären Mädchen durchgeführt16,22, während eine partielle unilaterale Oophorektomie häufig bei erwachsenen Patientinnen mit großen Eierstöcken und/oder einer hohen ovariellen Reserve durchgeführt werden kann.

Prozess der Präparierung und Teilung der Eierstöcke; Bilder zeigen Eierstock, SAF-Stücke, Kortex, Medulla, CL.
Abbildung 1: Kryokonservierung von Ovarialgewebe. Kryokonservierung des Ovarialgewebes bei einem präpubertären Mädchen (A, 7-jährige Patientin) und bei einer Frau (B, 28-jährige Patientin), die beide an akuter myeloischer Leukämie leiden. (A1–B1) Laparoskopische Ansicht des Eierstocks. (A2–B2–B3) Dissektion von Eierstockgewebe. (B4) Kortikales Ovarialgewebe. CL: Corpus luteum. SAF: kleiner Antralfollikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Führen Sie die Evakuierung des Eierstockgewebes mit einem handgefertigten oder kommerziellen laparoskopischen Probenentnahmebeutel durch.
  2. Legen Sie das Eierstockgewebe in ein steriles Röhrchen mit Kulturmedium bei 4 °C. Das Gewebe muss vollständig in das Kulturmedium eingetaucht werden.
  3. Transportieren Sie das Eierstockgewebe sofort in einem isolierten Beutel bei 4 °C zum ART-Labor, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
    HINWEIS: Falls erforderlich, kann das Eierstockgewebe bei kalten Temperaturen (ca. 4 °C) bis zu 26 Stunden nach der Entnahme ins Labor transportiert werden, ohne die Qualität des Gewebes zu gefährden23.

4. Vorbereitung des Eierstockgewebes

  1. Übertragen Sie das Eierstockgewebe in eine sterile 90-mm-IVF-Petrischale mit 20 ml vorgekühltem Kulturmedium bei 4 °C.
  2. Stellen Sie die Petrischale mit dem Eierstockgewebe auf eine Kühlplatte (bei 4 °C) und stellen Sie sie auf eine vertikale Laminar-Flow-Reinbank, um das Risiko einer Kontamination mit Mikroorganismen zu minimieren.

5. Manuelle Follikelaspiration aus Eierstockgewebeproben

  1. Aspirieren Sie sichtbare Antralfollikel (falls auf der Oberfläche des Eierstockgewebes vorhanden) mit einer 21-g-Spritzennadel, die mit einer 1-ml-Einwegspritze verbunden ist.
    HINWEIS: Dieser Schritt kann schwierig sein. Eine Alternative kann darin bestehen, jeden sichtbaren Antralfollikel vorsichtig mit einem Skalpell zu öffnen und das Innere jedes Follikels mit IVF-Medien zu spülen, um die KOK im Dissektionsmedium sanft freizusetzen.
  2. Spülen Sie die gesammelten Follikelflüssigkeiten in eine sterile 60 mm IVF-Petrischale mit 5 ml IVF-Kulturmedium bei Raumtemperatur.
  3. Spülen Sie die Spritze mit 1 ml IVF-Kulturmedium bei Raumtemperatur aus und spülen Sie die Flüssigkeit in dieselbe IVF-Petrischale. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
  4. Identifizieren und isolieren Sie die KOKs unter einem inversen Mikroskop (50- bis 200-fache Vergrößerung).
  5. Übertragen Sie die gesunden KOK mit einer Pipette in eine neue sterile 60-mm-IVF-Petrischale mit voräquilibriertem IVF-Medium, das bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5 % O2 und 5 % CO2 mit Öl bedeckt ist.
    HINWEIS: Gesunde KOK enthalten eine durchscheinende Eizelle. Die atretischen KOK, die eine braun gefärbte Eizelle aufweisen, sind zu verwerfen.
  6. Lagern Sie die IVF-Petrischale im Inkubator bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5 % O2 und 5 % CO2 bis zum Entblößungsschritt (siehe Schritt 9).

6. Dissektion von Eierstockgewebe

  1. Bereiten Sie die frische Gefrierlösung in einem sterilen 50-ml-Röhrchen vor. Die Gefrierlösung enthält 1,5 M Dimethylsulfoxid (DMSO) und 10 % humanes Serumalbumin in IVF-Kulturmedium. Sanft vortexen.
    HINWEIS: Es sollte kurz vor dem Gebrauch zubereitet werden.
  2. Schneiden Sie das Eierstockgewebe ab und entfernen Sie das Mark so weit wie möglich (Abbildung 1, B4).
  3. Schneiden Sie die Ovarialrinde in Scheiben mit den Maßen 10 mm x 10 mm x 1 mm bzw. 0,5 mm x 0,5 mm x 1 mm bei vollständiger bzw. teilweiser einseitiger Oophorektomie (Abbildung 1, A2–B2–B3). Der Schnitt erfolgt mit einer sterilen chirurgischen scharfen Schere und einer atraumatischen Pinzette.
    HINWEIS: Eine Scheibe des Eierstockgewebes wird sowohl mit der Ovarialrinde als auch mit der Medulla für die weitere histologische Analyse intakt gehalten (siehe Schritt 8).
  4. Führen Sie nach der Dissektion zwei Waschschritte (oder mehr, falls erforderlich) für jede Probe der Ovarialrinde in 1 ml IVF-Kulturmedium durch, um Blut zu entfernen. Übertragen Sie nach dem Waschen alle Gewebeproben in eine neue 60-mm-Petrischale mit frischem IVF-Kulturmedium.
  5. Geben Sie jede Probe der Ovarialrinde in ein Kryoröhrchen mit 1 ml Gefrierlösung.
    HINWEIS: Mischen ist nicht erforderlich. Das Stück Eierstockgewebe, das für die weitere histologische Analyse aufbewahrt wird, ist nicht kryokonserviert (siehe Schritt 8).
  6. Die Proben werden 30 Minuten lang bei 4 °C aufbewahrt, um sie mit der Gefrierlösung auszugleichen.
  7. Kryokonservieren Sie alle Proben mit einer langsamen Einfriertechnik. Die Abkühlgeschwindigkeit beträgt -2 °C/min von +4 °C bis -9 °C, -50 °C/min bis -30 °C; 1 min, +4 °C/min bis -15 °C, -2 °C/min bis -40 °C; und schließlich -25 °C/min bis -150 °C mit einem programmierbaren Gefrierschrank.
  8. Entfernen Sie die Kryoröhrchen sofort und tauchen Sie sie in flüssigen Stickstoff bei -196 °C.
  9. Legen Sie die Hälfte der Kryoröhrchen in einen ersten Lagertank für flüssigen Stickstoff und die andere Hälfte der Kryoröhrchen in einen zweiten Flüssigstickstofftank.

7. Manuelle COC-Isolierung aus dem dissektionierten verbrauchten Medium

  1. Identifizieren Sie COCs aus dem disparierten verbrauchten Medium unter einem Mikroskop (50- bis 200-fache Vergrößerung) (Abbildung 2).

Reifungsstadien der Eizellen; Mikroskopische Aufnahmen mit markierten Kumulus, Corona radiata, atretischen Eizellen.
Abbildung 2: Reife und unreife KOK, die aus dem Eierstockgewebe gewonnen wurden. Reife (A) und unreife (B1–B3,C1–C2) KOKs, die aus dem Eierstockgewebe entnommen wurden. (A) Reifes KOK, das eine reife Eizelle enthält (Vorhandensein des ersten Polkörpers, Eizelle im Metaphase-II-Stadium). (B1) Gesundes, unreifes COC, das eine unreife Eizelle enthält (kein Polkörper, Eizelle im Metaphase-I-Stadium). (B2–B3) Gesunde, unreife KOK, die unreife Eizellen im Keimvesikelstadium enthalten (keine Polkörperchen, Eizellen im Prophase-I-Stadium). (C1–C2) Ungesunde KOK, die eine atretische braun gefärbte Eizelle enthalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Übertragen Sie die gesunden KOK mit einer Pipette in eine neue sterile 60-mm-IVF-Petrischale, die voräquilibriertes IVF-Medium enthält, das bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5 % O2 und 5 % CO2 mit Öl bedeckt ist (siehe Schritt 2.1).
    HINWEIS: Entsorgen Sie die atretischen KOK.
  2. Lagern Sie die IVF-Petrischale im Inkubator bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5 % O2 und 5 % CO2 bis zum Entblößungsschritt (siehe Schritt 9).

8. Histologische Analyse des Eierstockgewebes

  1. Fixieren Sie die verbleibende Scheibe des Eierstockgewebes (die sowohl die Ovarialrinde als auch die Medulla enthält) in einer 3%igen Formalinlösung in einer chemisch sauberen Bank für die histologische Untersuchung.
    HINWEIS: Sie sollte erst durchgeführt werden, wenn die kortikalen Proben erfolgreich eingefroren und gelagert wurden.
    ACHTUNG: Die Formalinlösung ist reizend, ätzend und giftig. Dieser Schritt sollte sorgfältig und außerhalb des IVF-Labors durchgeführt werden.
  2. Verschreiben Sie eine vollständige histologische Analyse dieser Ovarialgewebeprobe mit einer Bewertung des potenziellen Vorhandenseins bösartiger Zellen sowie einer Beschreibung der Anzahl und Art der Ovarialfollikel (d. h. primordiale, primäre, sekundäre und antrale Follikel).

9. Entblößung und Selektion von Eizellen

  1. Führen Sie eine Eizellentblößung durch. Die KOK mit einer Pipettenspitze mit großem Durchmesser (Volumen 0,1–20 μl, Länge: 40,5 mm, Arbeitskegel: 6 mm, Durchmesser der Öffnung: 0,36 mm) für 30 s kurz einer Hyaluronidase-Lösung (80 I.E./ml oder Endkonzentration 0,1 mg/ml) aussetzen (wiederholtes Ansaugen und Ausstoßen der KOK in die Denudationslösung), unmittelbar danach zwei Waschschritte in vorausgeglichenem Medium, das mit Mineralöl bedeckt ist, zur Entfernung des überschüssigen Enzyms (siehe Schritt 2.1).
  2. Optimieren Sie die Entnahme von Kumulus- und Corona radiata-Zellen durch schonendes Pipettieren mit einer 150 μm Pipettenspitze in voräquilibriertem IVF-Medium (siehe Schritt 2.1).
  3. Führen Sie einen Auswahlschritt gesunder Eizellen mit einem inversen Mikroskop (200-400-fache Vergrößerung) durch. Das Reifungsstadium gesunder Eizellen kann GV-, MI- oder MII-Stadium-Eizellen sein (Abbildung 3). Gesunde Eizellen haben folgende morphologische Merkmale: ein intaktes und rundes Zytoplasma, eine Größe zwischen 100 und 150 μm und eine blasse Farbe.
    HINWEIS: Atretische und ungesunde Eizellen sind zu verwerfen (Abbildung 3, D1–D3).

Mikroskopische Aufnahmen der Reifungsstadien der Eizellen; Keimbläschen (GV), die in einigen Zellen identifiziert wurden.
Abbildung 3: Reife und unreife Eizellen, die aus dem Ovarialgewebe entnommen wurden. (A) Reife Eizelle (Eizelle im Metaphase-II-Stadium: Vorhandensein des ersten Polkörpers (PB, Pfeil), kein sichtbarer Zellkern), (B1–B2) Unreife Eizellen (Eizelle im Metaphase-I-Stadium: kein Polkörper, kein sichtbarer Zellkern), (C1–C3) Unreife Eizellen (Eizellen im Keimgefäßstadium (VG): kein Polkörper, Vorhandensein eines großen Halos mit Nukleolen im Zytoplasma (Pfeil)). In C1 weisen die Eizellen im Keimvesikelstadium eine heterogene Größe auf. (D1–D3) Atretische Eizellen. PB: Polkörper. GV: Keimgefäß. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Inkubieren Sie gesunde Eizellen im Inkubator bei 37 °C, 5 % O2 und 5 % CO2 bis zum Vitrifikationsschritt (siehe Schritt 2.1).

10. Vitrifizierung von Eizellen

  1. Bestätigung der Patienten-/Probenidentifikation.
  2. Führen Sie einen neuen Auswahlschritt gesunder Eizellen mit einem inversen Mikroskop (200- bis 400-fache Vergrößerung) durch.
    HINWEIS: Atretische und ungesunde Eizellen entsorgen.
  3. Machen Sie ein Foto von jeder gesunden Eizelle mit einem inversen Mikroskop kurz vor dem Vitrifikationsschritt. Notieren Sie das Reifestadium jeder Eizelle.
    HINWEIS: Hängen Sie alle diese Daten (Bild, Größe, Reifestadium) an die Datei des Patienten an.
  4. Verwenden Sie unterschiedliche Identifikationsnummern pro Strohhalm, um sie zu unterscheiden, wenn Sie mehr als einen Strohhalm pro Patient kryokonservieren.
  5. Kryokonservieren Sie eine oder zwei Eizellen pro Strohhalm.
    HINWEIS: Reife und unreife lebensfähige Eizellen müssen getrennt kryokonserviert werden. Bei der Kryokonservierung von zwei Eizellen zusammen im selben Strohhalm wird empfohlen, Eizellen mit ähnlichen morphologischen Eigenschaften auszuwählen.
  6. Kryokonservieren Sie gesunde Eizellen mit einem Vitrifikationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
  7. Laden Sie die Cryopreserve Eizellen auf ein geeignetes Gerät für die Kryolagerung in flüssigem Stickstoff gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
  8. Legen Sie die Hälfte der Halme in einen ersten Flüssigstickstoff-Vorratsbehälter und die andere Hälfte der Halme in einen zweiten Flüssigstickstoff-Tank.

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Ergebnisse

Zwischen 2007 und 2020 wurden insgesamt 81 OTC von 81 Patientinnen durchgeführt, darunter 43 präpubertäre Mädchen und 38 Frauen. Das Durchschnittsalter der weiblichen Patientinnen (präpubertäre Mädchen und Frauen) betrug 14,21 ± 9,61 Jahre (mittlerer ± Standardfehler). Der jüngste Patient war 5 Monate alt, der älteste 33,6 Jahre alt (Tabelle 1). Das mittlere Alter der präpubertären Mädchen und Frauen betrug 6,84 ± 4,81 Jahre (min–max: 0,5–15,1) bzw. 22,76 ± 5,92 Jahre (min–max: 14,2–33,6) (Mann-Whitney, ...

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Diskussion

Das vorliegende Manuskript enthält ein Protokoll, das das Einfrieren von Eierstockgewebe und die Kryokonservierung von Eizellen aus dem Eierstockgewebe kombiniert und so das Fertilitätspotenzial bei präpubertären Mädchen und Frauen mit POI-Risiko erhöht. Wir empfehlen dringend, dieses Protokoll vor Beginn einer gonadotoxischen Therapie durchzuführen, um die Menge (d. h. die Anzahl der lebensfähigen Eizellen) sowie die Qualität (d. h. DNA-Integrität und Zytoplasma-Kompetenz) der konservie...

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Offenlegungen

Keiner der Autoren hat konkurrierende Interessen.

Danksagungen

Wir danken allen Mitgliedern unserer Zentren, die an der Erhaltung der Fruchtbarkeit beteiligt sind (Gynäkologen, Biologen, Onkologen und Anatomopathologen). Die Studie wurde im Rahmen der Routineverfahren zur Erhaltung der Fruchtbarkeit durchgeführt. Es wurden keine Fördermittel erhalten.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 ml EinwegspritzeCDD1323101/7002655Andere Materialien und Größen können auch geeignet sein
21-Gauge-SpritzennadelMerckZ192481Andere Materialien und Größen können auch geeignet sein
35 mm IVF PetrischaleNunc150255Andere Materialien und Größen können auch geeignet sein
60 mm IVF PetrischaleNunc150270Andere Materialien und Größen können auch geeignet sein geeignet sein
90 mm IVF PetrischaleNunc150360Anderes Material und Größen können ebenfalls geeignet sein
Atraumatische PinzetteMedlanePI 299 04Anderes Material und andere Größen können ebenfalls geeignet sein
Kontinuierliche Einzelkultur Komplett mit HSAIrvine Scientific90165IVF-Kulturmedium für die Entnahme von Follikelflüssigkeit, die Inkubation von KOKs, die Entblößung von Eizellen und die Inkubation von Eizellen bis zum Schritt der Vitrifikation.
KryoröhrchenThermo Scientific368632Andere Produkte können ebenfalls geeignet sein
Dimethylsulfoxid (DMSO)MILTENYI BIOTEC SAS170-076-303CryoMACS DMSO 10 (EP)
GT40Air Liquide1,13,517Lagertank
HSV Hochsicherheits-VitrifikationshalmIrvine Scientific25251Vitrifikationshalme
HumanserumalbuminVitrolife10064Andere Produkte können ebenfalls geeignet sein
Leibovitz L15 MediumEurobioCM1L15000UNährmedium für die Entnahme, den Transport und die Dissektion von Eierstockgewebe
Leibovitz L15 MediumEurobioCM1L15000UNährmedium zum Einfrieren von Lösung
Mars-IVF Class II Workstation/L126 IVF DualCooperSurgicalWM1500/6-133-911-121Workstation
Programmierbarer GefrierschrankPlaner KRYO 500Kryo 560-16Andere Geräte könnten auch geeignet sein
Schere mit scharfen, geraden Klingen und fein geschärften SpitzenMedlaneCI 034 03Andere Materialien und Größen könnten auch geeignet sein
CooperSurgicalMXL3-STR-CGRAndere Produkte könnten auch geeignet
sein Tipps (150µ m) fürCooperSurgicalMXL3-150Andere Produkte können ebenfalls geeignet sein
VitrifikationskitIrvine Scientific90133Protokolle sind unter http://www.irvinesci.com/products/90133-so-vitrification-freeze-solutions erhältlich. Es können auch andere Produkte geeignet sein

Referenzen

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  2. Rivas Leonel, E. C., Lucci, C. M., Amorim, C. A. Cryopreservation of human ovarian tissue: a review. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 46 (3), 173-181 (2019).
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