Methodenartikel

Entfernung und Ersatz endogener Liganden aus lipidgebundenen Proteinen und Allergenen

DOI:

10.3791/61780

⸱

24. Februar 2021

 ,  , 
1Nuclear Magnetic Resonance Group, National Institute of Environmental Health Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt die Entfernung endogener Lipide aus Allergenen und deren Ersatz durch benutzerdefinierte Liganden durch Umkehrphasen-HPLC in Verbindung mit thermischem Glühen. 31 P-NMR und zirkulärer Dichroismus ermöglichen die schnelle Bestätigung der Ligandenentfernung/-belastung und die Wiederherstellung der nativen Allergenstruktur.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viele wichtige Allergene binden an hydrophobe lipidähnliche Moleküle, darunter Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 und Fel d 1. Diese Liganden bleiben stark erhalten und haben das Potenzial, den Sensibilisierungsprozess zu beeinflussen, entweder durch direkte Stimulation des Immunsystems oder durch Veränderung der biophysikalischen Eigenschaften des allergenen Proteins. Um diese Variablen zu kontrollieren, sind Techniken zur Entfernung endogener gebundener Liganden und gegebenenfalls zum Ersatz durch Lipide bekannter Zusammensetzung erforderlich. Das Kakerlakenallergen Bla g 1 umschließt eine große hydrophobe Höhle, die eine heterogene Mischung aus endogenen Lipiden bindet, wenn sie mit traditionellen Techniken gereinigt wird. Hier beschreiben wir eine Methode, mit der diese Lipide mittels Umkehrphasen-HPLC gefolgt von thermischem Glühen entfernt werden, um Bla g 1 entweder in seiner Apo-Form oder mit einer benutzerdefinierten Mischung aus Fettsäure- oder Phospholipidladungen zu erhalten. Die Kopplung dieses Protokolls mit biochemischen Assays zeigt, dass Fettsäureladungen die Thermostabilität und proteolytische Resistenz von Bla g 1 signifikant verändern, mit nachgelagerten Auswirkungen auf die Rate der T-Zell-Epitopbildung und Allergenität. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von Lipidentfernungs- / Nachladeprotokollen wie dem hier beschriebenen bei der Untersuchung von Allergenen aus rekombinanten und natürlichen Quellen. Das Protokoll ist auf andere Allergenfamilien verallgemeinerbar, einschließlich Lipocaline (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) und Uteroglobin (Fel d 1), und bietet ein wertvolles Werkzeug, um die Rolle von Lipiden bei der allergischen Reaktion zu untersuchen.

Einleitung

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Eine Untersuchung der Allergendatenbank zeigt, dass Allergene nur in 2% aller bekannten Proteinfamilien vorkommen, was darauf hindeutet, dass gemeinsame funktionelle und biophysikalische Eigenschaften zur Allergenität beitragen1. Von diesen Eigenschaften scheint die Fähigkeit, Lipidladungen zu binden, unter allergenen stark überrepräsentiert zu sein, was darauf hindeutet, dass diese Ladungen den Sensibilisierungsprozess beeinflussen können1. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass das Paranussallergen Ber e 1 eine gleichzeitige Verabreichung mit seinem endogenen Lipid erfordert, um sein volles sensibilisierendes Potenzialauszuschöpfen 2. Diese Lipide könnten potentiell das Immunsystem direkt stimulieren, wie die Milbenallergene Der p 2 und Der p 7 zeigen, die beide eine starke strukturelle Homologie mit LPS-bindenden Proteinen3,4,5teilen . Basierend auf dieser Beobachtung wurde vorgeschlagen, dass Derp 2 und Der p 7 bakterielle Lipide binden und das Immunsystem des Wirts durch TLR4-vermittelte Signalisierung direkt stimulieren könnten, was den Sensibilisierungsprozess erleichtert5,6. Es ist auch möglich, dass endogen gebundene Lipide die biophysikalischen Eigenschaften allergener Proteine selbst verändern könnten. Zum Beispiel erhöhte die Fähigkeit von Sin a 2 (Senf) und Ara h 1 (Erdnüsse), mit Phospholipidvesikeln zu interagieren, signifikant ihre Resistenz gegen Magen- und Endosomalabbau7, während die Ligandenbindung an das Hauptbirkenpollenallergen Bet v 1 sowohl die Rate der endosomalen Verarbeitung als auch die Vielfalt der resultierenden Peptide veränderte8. Dies ist besonders relevant für die Allergenität angesichts der Korrelation, die zwischen Stabilität, T-Zell-Epitopbildung und Allergenität für Proteine wie Bet v 1 und Bla g 1 beobachtet wurde; Letzteres wird Gegenstand dieser Arbeit sein9,10.

Bla g 1 repräsentiert das prototypische Mitglied der Proteinfamilie des Major Allergen (MA) des Insekts und besitzt eine einzigartige Struktur, die aus 12 amphipathischen Alpha-Helices besteht, die einen ungewöhnlich großen hydrophobenHohlraumumschließen 9,11. Die verfügbare Röntgenkristallstruktur von Bla g 1 zeigt eine Elektronendichte innerhalb dieses Hohlraums, die mit gebundenen Phospholipid- oder Fettsäureliganden übereinstimmt; eine Vermutung, die durch 31P-NMR und Massenspektrometrie bestätigt wird. Diese Ladungen waren heterogener Natur und ihre Zusammensetzung hing stark von der Allergenquelle ab, wobei für rekombinante Bla g 1, ausgedrückt in E. coli und P. pastoris,unterschiedliche Lipidprofile beobachtet wurden. Seltsamerweise enthielt Bla g 1, gereinigt von seiner natürlichen Allergenquelle (Kakerlakenfrass), überwiegend Fettsäuren an seiner Bindungsstelle, wobei eine Mischung aus Palmitat, Oleat und Stearat als seine "natürlichen" Liganden identifiziert wurde9,11. Die Fähigkeit von Bla g 1, Lipide und Fettsäuren nach mehreren Reinigungsschritten zurückzuhalten, behindert die Bemühungen, das Protein isoliert zu untersuchen. Umgekehrt wurde vermutet, dass die natürlichen Palmitat-, Stearat- und Oleatliganden von Bla g 1 (im Folgenden als nMix bezeichnet) eine Schlüsselrolle sowohl bei seiner Allergenität als auch bei seiner nativen biologischen Funktion spielen9. Diese Liganden sind jedoch in Bla g 1, die aus rekombinanten Quellen gewonnen wurden, nicht vorhanden, was es schwierig macht, diese Hypothese zu beurteilen. Ähnliche Probleme wurden für andere lipidbindende Allergene wie Bet v 112,13beobachtet. Um die systematische Untersuchung von Lipid-Allergen-Interaktionen zu erleichtern, haben wir ein Protokoll entwickelt, mit dem Allergene quantitativ von ihren endogen gebundenen Lipiden befreit und entweder in Apo-Form rekonstituiert oder mit spezifischen Liganden beladen werden können.

Allergene werden am häufigsten aus ihren natürlichen oder rekombinanten Quellen mittels Affinitätschromatographie und/oder Größenausschlusschromatographie gereinigt. Hier führen wir einen zusätzlichen Reinigungsschritt in Form der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einer Umkehrphasen-C18-Säule ein, aus der das Allergen in ein organisches Lösungsmittel eluiert wird, ähnlich den protokollierten Protokollen, die für fettsäurebindende Proteine entwickelt wurden14. Das resultierende Protein wird dann in Abwesenheit oder Gegenwart von Fettsäuren und/oder Phospholipiden einem thermischen Glühschritt unterzogen. Zusätzlich zur Rückgewinnung des nativen Bla g 1-fachen erhöhen die erhöhten Temperaturen die Löslichkeit und Zugänglichkeit der Lipidladungen, wodurch Bla g 1 entweder in apo-Form oder gleichmäßig mit dem gewünschten hydrophoben Liganden beladen wird. 31 P-NMR-Spektren von Bla g 1, die auf diese Weise gereinigt wurden, bestätigten die vollständige Entfernung endogener gebundener Liganden und den gleichmäßigen Ersatz durch die gewünschten Verbindungen, während der zirkuläre Dichroismus die erfolgreiche Wiederherstellung der Bla g 1-Falte bestätigte. Der Nutzen dieser Methode wird in einer kürzlich durchgeführten Arbeit hervorgehoben, in der festgestellt wurde, dass die Ladungsbindung die Thermostabilität und proteolytische Resistenz von Bla g 1 verbessert und die Kinetik der T-Zell-Epitoperzeugung mit potenziellen Auswirkungen auf die Sensibilisierung und Allergenität verändert9.

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Protokoll

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1. Bla g 1 Klonen

  1. Erhalten Sie das Gen für das Kakerlakenallergen Bla g 1.0101 (Rückstände 34-216), das eine einzige Wiederholung der MA-Domäne darstellt. Der Einfachheit halber wird Bla g 1 während des gesamten Werks verwendet, um diese einzelne Wiederholung darzustellen, und nicht das gesamte Bla g 1.0101-Transkript.
  2. Subklonieren Sie das Bla g 1 Gen in den gewünschten Vektor. In dieser Studie wurde das Gen, das ein N-terminales Glutathion-S-Transferase-Tag (GST) enthält, das an eine Protease-Spaltungsstelle des Tabakätzvirus (TEV) gekoppelt ist, zur Expression in einen pGEX-Vektor eingefügt, wie zuvor beschrieben11.
  3. Wandeln Sie den Bla g 1 pGEX-Vektor in BL21 DE3 E. coli-Zellen um.
    1. Bereiten Sie einen 10 ng/μL-Bestand des gewünschten Vektors vor.
    2. Kombinieren Sie 1 μL 10 ng/μL DNA-Stamm mit 50 μL BL21 DE3-Zellen, wie vom Hersteller angegeben.
    3. BL21 DE3-DNA-Mischung für 30 min auf Eis inkubieren. Für 1 min in ein 42 °C wassergünstchen Wasserbad geben, dann sofort wieder auf Eis für weitere 1 min Inkubation umlegen.
    4. 200 μL LB-Medien in die Zellen geben und weitere 1 h bei 37 °C inkubieren.
    5. Die transformierten Zellen werden auf LB-Agarplatten mit 100 mg/L Ampicillin plattiert und wachsen über Nacht bei 37 °C.

2. Anfängliche Expression und Reinigung

  1. Impfen Sie 1 L LB-Medium mit 100 mg/L Ampicillin mit einer einzigen Kolonie von BL21 DE3-Zellen, die mit dem Bla g 1-Vektor transformiert wurden, wie in 1.3 beschrieben. Über Nacht bei 37 °C wachsen.
  2. Am nächsten Tag die Zellen (OD600 ~1,5) durch Zentrifugation bei 6.000 x g für 10 min ernten und in 2 L 2x YT-Medien mit 100 mg/L Ampicillin wieder aufschnuspendieren. Lassen Sie die Zellen für weitere 1 h bei 37 °C zu einem OD600 > 0,6 wachsen.
  3. Induzieren Sie die Proteinexpression durch Zugabe von 0,5 mM IPTG. Zellen auf 18 °C übertragen und über Nacht inkubieren.
  4. Am nächsten Tag ernten Sie zellen wie in 2.2 beschrieben. Das resultierende Zellpellet kann eingefroren und bei -20 °C gelagert werden.
  5. Resuspend-Pellet erhalten aus 1 L Kultur in 50 ml Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,5, 100 mM NaCl) mit 1 Proteasehemmertablette (oder gleichwertig) und 1 μL Benzonase-Nuklease.
  6. Lyse-Zellen mit einem Sondenschallator (500 W, 20 kHz), die für 4 minuten bei einer Einschaltdauer von 50 % auf 30–50 % Leistung eingestellt sind. Halten Sie das Lysat während der Beschallung in einem Eisbad
  7. Zentrifugenlysat bei 45.000 x g für 20 min. Entsorgen Sie unlösliche Fraktion (Pellet).
    1. Entfernen Sie 28 μL lösliches Protein. Kombinieren Sie mit 7 μL 5x SDS-PAGE Puffer und speichern Sie für die SDS-PAGE Analyse. Wiederholen Sie diesen Schritt für die Durchfluss-, Wasch- und Elutionsfraktionen der GST-Säule vor und nach der Inkubation mit TEV.
  8. Tragen Sie lösliche Proteine (Überstand) auf eine Glutathionharzsäule (~ 10 ml Gesamtbettvolumen) auf, die in PBS pH 7,4 ausgeglichen ist.
  9. Waschen Sie alle ungebundenen Proteine mit 50 ml PBS aus.
  10. Elute GST-Bla g 1 unter Verwendung von 50 ml PBS mit 10 mM reduziertem Glutathion.
  11. Inkubieren Sie eluiertes Protein mit 0,2 kU TEV-Protease über Nacht bei 4 °C oder Raumtemperatur für 6 h, um das GST-Tag zu entfernen.

3. Endogene Lipidentfernung mittels Umkehrphasen-HPLC

  1. Sammeln Sie das gespaltene Bla g 1 und konzentrieren Sie es auf ~ 2 ml mit einer Zentrifugalfiltereinheit mit einer molekulargewichtsabschaltung von <10 kDa.
    1. Fügen Sie <12 ml Probe auf die Oberseite des Konzentrators hinzu und drehen Sie sich bei 5.000 x g für 10-15 minuten in einem Schaufelrotor.
      HINWEIS: Probenvolumen und Schleudergeschwindigkeit variieren je nach spezifischem Filter und Art des verwendeten Rotors. Konsultieren Sie vor der Verwendung die Dokumentation des Herstellers.
  2. Laden Sie das Konzentrat auf ein 250 x 10 mm HPLC-System, das mit einer C18-Umkehrphasenchromatographiesäule ausgestattet ist, die mit 97% Puffer A (Wasser, 0,1% Trifluoressigsäure) und 3% Puffer B (Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure) ausgeglichen ist.
    HINWEIS: Kleinere Säulen können verwendet werden, aber Protein muss möglicherweise mit mehreren Zyklen geladen und eluiert werden, um die reduzierte Bindungskapazität aufzunehmen. Achten Sie bei der Auswahl einer Säule darauf, dass die Harzperlen eine Partikelgröße von < 5 μm und eine Porengröße von >200 Å aufweisen, um eine effektive Trennung von proteingroßen Molekülen zu ermöglichen
    VORSICHT: Trifluoressigsäure ist stark korrosiv und sollte mit geeigneter PSA (z. B. Nitrilhandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille) in einem Abzug abgegeben werden. Acetonitril ist sowohl mäßig giftig, flüchtig als auch leicht entzündlich, sollte verwendet und in einem Abzug mit geeigneten PSA (z. B. Nitrilhandschuhen, Laborkittel und Schutzbrille) abgegeben werden.
  3. Elute Bla g 1 unter Verwendung des in Tabelle 1 gezeigten Protokolls bei einer Durchflussrate von 1,5–4,0 ml/min. Überwachen Sie den Elutionsprozess mit der Fluoreszenzabsorption bei 280 nm.
    1. Sammeln und poolen Sie Bla g 1 Fraktionen. Bla g 1 eluiert normalerweise bei >74% Puffer B oder ~34–40 min.
      HINWEIS: Die Elutionszeit variiert je nach Durchflussrate oder Säulengröße leicht. Sammeln Sie Fraktionen basierend auf A280 für beste Ergebnisse.
Zeit (Min)Puffer A (%)Puffer B (%)
0973
10973
253565
55595
65595
70973

Tabelle 1: Elutionsprotokoll für Bla g 1. Tabelle, die den Elutionsgradienten veranschaulicht, der bei der Isolierung von Bla g 1 mit einer C18 HPLC-Säule verwendet wurde.

  1. Aliquotieren Sie die Probe in Glasreagenzgläser und füllen Sie kein Reagenzglas mehr als zur Hälfte (~ 4 ml). Decken Sie Rohre mit Paraffinfolie ab und perforieren Sie die Abdeckung mit zwei Löchern, um eine Entlüftung zu ermöglichen.
    1. Bereiten Sie ein separates 1 ml Aliquot vor (Test aliquot). Dies wird verwendet, um den erwarteten Ertrag zu bestimmen.
  2. Gefrieren Sie die Proben ein und testen Sie das Aliquot, indem Sie sie für 1 h in einen Gefrierschrank mit -80 °C legen oder in flüssigen Stickstoff eintauchen. Im späteren Fall muss das Rohr kontinuierlich gedreht werden, um einen Reagenzglasbruch durch Ausdehnung der flüssigen Phase beim Einfrieren zu vermeiden.
  3. Trocknen Sie die resultierenden entpidalten Proteinproben mit einem Lyophilisator. Getrocknetes Protein kann bei 4 °C für mehrere Monate in einem verschlossenen Behälter gelagert werden.

4. Rekonstitution von apo- und ladungsbeladenen Bla g 1

  1. Bestimmen Sie den erwarteten Bla g 1 Ertrag.
    1. Resuspend lyophilisiertes, entspeihtes (post-HPLC) Test aliquot in 5 mL Umfaltungspuffer, (50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 2% DMSO).
    2. Die Mischung in einem Wasserbad (500 mL Becher mit 250 mL Wasser und Rührstab über einer Kochplatte) auf 95 °C erhitzen. Wirbellösungen intermittierend und bei 95 °C für 0,5–1 h inkubieren.
    3. Wärme ablassen und das Wasserbad langsam auf Raumtemperatur (~1 h) ausgleichen lassen. Geglühtes Protein kann in dieser Form bei Bedarf über Nacht bei 4 °C gelagert werden.
    4. Geglühte Bla g 1-Lipidmischung durch einen 0,22 μM Spritzenfilter leiten, um Partikel zu entfernen.
    5. Pufferaustausch des gefilterten Proteins 3x in PBS pH 7,4 unter Verwendung eines Zentrifugalfilters mit 10 kDa Cutoff wie in 3.1 beschrieben, um restfreie Fettsäuren und organische Lösungsmittel zu entfernen.
    6. Beurteilen Sie die Proteinkonzentration mit dem BCA-Assay oder einer anderen bevorzugten Methode wie der UV-Absorption. Verwenden Sie dies, um den erwarteten Ertrag für die verbleibenden Bla g 1 Aliquoten zu bestimmen.
  2. Rekonstituierte Apo- oder ladungsbeladene Bla g 1
    1. Resuspend Bla g 1 Aliquoten im Refolding Buffer wie in 4.1.1 beschrieben.
    2. Um Apo-Bla g 1 zu erzeugen, wiederholen Sie die Schritte 4.1.2–4.1.6, um die gewünschte Ausbeute zu erzielen.
    3. Um Bla g 1 mit Fettsäuren zu beladen, bereiten Sie 20 mM Stammlösungen der gewünschten Fettsäureladung in Methanol oder DMSO vor.  Fahren Sie dann mit Schritt 4.2.5 fort.
    4. Um Bla g 1 mit Phospholipiden zu beladen, bereiten Sie einen 10 mg/ ml Vorrat der gewünschten Ladung in Chloroform in einem Glasreagenzglas vor.
      1. Verdampfen Sie das Chloroform, um einen Lipidfilm zu erzeugen. Fügen Sie PBS in das Reagenzglas ein, um eine endgültige Phospholipidkonzentration von 20 mM zu erzeugen.
        ACHTUNG: Chloroform ist schädlich, wenn es eingeatmet oder verschluckt wird. Verwenden Sie in einem chemischen Abzug oder verwenden Sie ein Atemschutzgerät, wenn eine unzureichende Belüftung verfügbar ist. Verwenden Sie bei der Handhabung Nitrilhandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille. Konsultieren Sie msDS vor der Verwendung.
      2. Rehydrieren Sie den Lipidfilm, indem Sie ihn über die Phasenübergangstemperatur der Lipidladung erhitzen und wirbeln, bis die Lösung trüb wird. Beachten Sie, dass eine Beschallung erforderlich sein kann, um einige Ladungen vollständig wieder aufzuziehen und zu rehydrieren.
      3. Wenn eine Beschallung erforderlich ist, legen Sie das Reagenzglas in den Badbeschallungsator (100 W, 42 kHz) und beschallen Sie mit maximaler Leistung, bis die Ladung wieder aufgewärmt ist. Alternativ kann ein Sondenschallator (beschrieben in 2.6) mit einer Leistung von 10–20 % bei einer Einschaltdauer von 50 % verwendet werden.
        VORSICHT: Die Beschallung verwendet hochfrequente Schallwellen, die das Gehör schädigen können. Verwenden Sie geräuschunterdrückende PSA (Ohrstöpsel oder Schalldämpfer). Wenn möglich, platzieren Sie den Ultraschallator in einem schalldämpfenden Schrank oder einer Kammer.
    5. Fügen Sie die gewünschte Fettsäure- oder Phospholipidladung hinzu, um einen 20-fachen molaren Überschuss an Liganden relativ zu Bla g 1 zu erzeugen, basierend auf der erwarteten Ausbeute, die in 4.1 bestimmt wird. Das Gesamtvolumen des in diesem Schritt zugesetzten organischen Lösungsmittels sollte 2% nicht überschreiten. Wirbel zum Mischen.
      HINWEIS: 1 L bl 21 DE3-Zellen ergibt typischerweise ~ 0,25-0,4 nmol Protein, was ~ 400 μM Ligand pro Röhrchen entspricht.
    6. Das Protein wird wie in 4.1 beschrieben anneren.

5. Bestätigung der Entnahme/Verladung von Phospholipidladung über 31P-NMR

  1. Konzentrieren Sie Proben von Apo- oder ladungsbeladenen Bla g 1 bis >100 μM unter Verwendung einer Zentrifugalfiltereinheit wie in 3.1 beschrieben.
  2. Rehydratisieren Sie Referenzphospholipid im PBS-Puffer auf Endkonzentrationen von 2, 1,5, 1, 0,5 und 0,25 mM.
  3. Verdünnen Sie die Proben 1:1 mit Cholatpuffer (100 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% w/v Cholat) auf ein Gesamtvolumen von ~600 μL.
    HINWEIS: Cholat wird in diesem Schritt verwendet, um Lipide vollständig aus der hydrophoben Bla g 1-Höhle zu extrahieren und zu solösen. Dies stellt sicher, dass die chemische Umgebung, die die Phospholipid-Kopfgruppen umgibt, zwischen verschiedenen Proben konsistent ist, was eine quantitative Bewertung mit 31P-NMR ermöglicht. Die Verwendung von Cholat kann durch Chloroform/Methanol ersetzt werden, wie zuvor beschrieben15.
  4. Erfassen Sie 1D 31P-NMR-Spektren der cholatlöslichen Bla g 1-Proben und Referenzphospholipidstandards mit einer Breitbandsonde.
    HINWEIS: Die in dieser Arbeit vorgestellten 31P-NMR-Spektren wurden mit einem 600-MHz-Spektrometer erhalten. Frühere Studien, die ähnliche Techniken verwenden, deuten jedoch darauf hin, dass eine akzeptable Empfindlichkeit bei Feldstärken von nur 150-200 MHz15erreicht werden kann.
  5. Verarbeiten Sie die resultierenden Daten mit geeigneter Software16.
  6. Erhalten Sie Spitzendichten mit bevorzugter NMR-Anzeigesoftware17.
  7. Vergleichen Sie die Bla g 1 31P-NMR-Spektren mit denen, die für die Phospholipid-Referenzproben erhalten wurden, um die Entfernung endogener gebundener Liganden und/oder die Bindung gewünschter Liganden basierend auf den chemischen Verschiebungen der sichtbaren Peaks (oder deren Fehlen) zu bestätigen.
    1. Bestätigen Sie die vollständige Bindungsstöchiometrie, indem Sie die Spitzenintensität des Bla g 1-Spektrums mit der der Phospholipid-Referenzstandards vergleichen.

6. Bla g 1 Falten bestätigen

  1. 0,5 μM Proben von Bla g 1 in CD-Puffer (100 mM KH2PO4,Puffer pH 7,5) vorbereiten. 2 mL der Probe in eine 10 mm CD-Küvette mit magnetischem Rührstab laden.
  2. Messen Sie das CD-Spektrum von Bla g 1, um die Rekonstitution der Sekundärstruktur zu bestätigen. Stellen Sie sicher, dass die Photomultiplierspannung (PMT) die Herstellerempfehlungen (in der Regel 1 kV) nicht überschreitet.
    1. Messen Sie das CD-Signal von 260–200 nm bei 25 °C mit einem Datenabstand von 0,2 nm und einer Scanrate von 20 nm/s bei einer Datenintegrationszeit von 1 s.
  3. Erhöhen Sie die Temperatur in der CD-Zelle von 25 °C bis 95 °C mit einer Rate von 0,5 °C/min. Aktivieren Sie den magnetischen Rührbalken, um sicherzustellen, dass die Temperatur in der gesamten Probe gleichmäßig ist.
  4. Überwachen Sie die CD bei 222 nm und nehmen Sie alle 2 °C Messwerte auf.
  5. Passen Sie die resultierenden Daten an eine Boltzman-Kurve mit 2 Angaben an, um die Schmelztemperatur zu bestimmen. Aufgrund der hohen Stabilität von Bla g 1 wurde die Schmelztemperatur (MT25)als die Temperatur definiert, bei der das Protein bei 222 nm 25% seiner ursprünglichen CD verloren hat.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mit Hilfe der Affinitätschromatographie wurde rekombinantes GST-Bla g 1 leicht auf einen hohen Reinheitsgrad isoliert (Abbildung 1A), wodurch eine Ausbeute von ~ 2-4 mg / L Zellkultur erzeugt wurde. Die Inkubation über Nacht mit TEV-Protease bei 4 °C reicht aus, um das GST-Tag zu entfernen, wodurch das Endprodukt bei ~ 24 kDa entsteht. Beachten Sie, dass in diesem Fall eine signifikante Menge an GST-Bla g 1 in den Durchfluss- und Waschfraktionen vorhanden ist, was darauf hindeutet, dass die Bindungskapaz...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll wurde erfolgreich angewendet, um die Lipidbindungseigenschaften von Bla g 1 systematisch zu untersuchen. Dies zeigte eine Korrelation zwischen Ladungsbindung, Thermostabilität und endosomaler Verarbeitung, von denen letztere mit einer Abnahme der Erzeugung eines bekannten T-Zell-Epitops mit möglichen Auswirkungen auf die Immunogenität korrelierte9,18. Zusätzlich zu Bla g 1 haben andere Allergene wie Pru p 3 und Bet v 1 ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Dr. Tom Kirby, Scott Gabel und Dr. Robert London für ihre Hilfe und Unterstützung während dieser Arbeit, zusammen mit Dr. Bob Petrovich und Lori Edwards für die Verwendung ihrer Instrumentierung und ihre Unterstützung bei der Erstellung der bla g 1-Konstrukte, die in dieser Studie verwendet werden. Wir danken Andrea Adams für die Unterstützung bei der Massenspektrometrie und Dr. Eugene DeRose für die Unterstützung bei der NMR-Instrumentierung. Diese Forschung wurde vom Intramural Research Program des NIH, National Institute of Environmental Health Sciences, Z01-ES102906 (GAM) unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des National Institute of Environmental Health Sciences dar.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Bla g 1 Gen GenescriptN/aKundenspezifischer Gensynthese-Service. GenBank Beitrittsnummer AF072219 Rückstände 34-216
Affinität gereinigt natürliches Bla g 1 (nBla g 1)Biotechnologien für den InnenbereichN/aSonderanfertigung
Agilent 1100 Serie HPLC-SystemAgilentG1315B, G1311A, G1322AUV-Detektor, Pumpe und Entgaser
Agilent DD2 600 MHz SpektrometerAgilentN/a
Amicon Ultra-15 ZentrifugalfiltereinheitAmiconUFC-1008
AmpicillinFisher ScientificBP1760-5
BenzonaseSigma-AldrichE1014-5KU
Breitband-5-mm-Z-GradientensondeVarianN/a
ChemStation für LC (Software)AgilentN/a
cOmplete Mini Protease Inhibitor CocktailRoche11836153001
Distearoylphosphatidylcholin (18:0 PC)Avanti Polar Lipids850365C
E. Coli BL21 DE3 ZellenNew England BiolabsC2530H
Freezone 4.5 Freeze Dry SystemLabconco7750000
GlutathionharzGenescriptL00206
Glutathion, reduziertFisher Scientific BP25211
Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG)Fisher Scientific34060
Jasco  CD-SpektropolarimeterJascoJ-815
Millex SpritzenfiltereinheitEMD MilliporeSLGS033SS
NMRPipe (Software)Delaglio et al. N/aDelaglio, F. et al. Nmrpipe - ein mehrdimensionales spektrales Verarbeitungssystem auf Basis von Unix-Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277– 293 (1995).
NMRViewJ (Software)Johnson et al. N/aJohnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: Ein Computerprogramm zur Visualisierung und Analyse von NMR-Daten. J. Biomol. NMR 4, 603– 614 (1994).
ÖlsäureSigma-AldrichO1008
Pierce BCA Protein AssaySigma-AldrichBCA1-1KT
Polaris 5 C18-A 250x10,0 mm HPLC-SäuleAgilentArtikelnummer: A2000250X100
SD-200 VakuumpumpeVarianVP-195
NatriumcholathydratSigma-AldrichC6445
NatriumpalmitatSigma-AldrichP9767
NatriumstearatSigma-AldrichS3381
VnmrJ (Software)VarianN/A

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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