Summary

T- und B-Zell-Rezeptor-Immunrepertoireanalyse mittels Next-Generation-Sequencing

Published: January 12, 2021
doi:

Summary

Das aktuelle Protokoll beschreibt eine Methode zur DNA-Isolierung aus Blutproben und Darmbiopsien, die Generierung von TCRβ- und IGH-PCR-Bibliotheken für die Sequenzierung der nächsten Generation, die Durchführung eines NGS-Laufs und die grundlegende Datenanalyse.

Abstract

Das immunologische Gedächtnis, das Kennzeichen der adaptiven Immunität, wird durch T- und B-Lymphozyten orchestriert. Im Kreislauf und in verschiedenen Organen gibt es Milliarden von einzigartigen T- und B-Zellklonen, und jeder kann ein spezifisches Antigen binden, was zu Proliferation, Differenzierung und / oder Zytokinsekretion führt. Die enorme Heterogenität in T- und B-Zellen wird durch zufällige Rekombination verschiedener genetischer Segmente erzeugt. Next-Generation-Sequencing-Technologien (NGS), die in den letzten zehn Jahren entwickelt wurden, ermöglichen einen beispiellosen detaillierten Einblick in das Immunrepertoire der T- und B-Zellrezeptoren. Studien zu verschiedenen entzündlichen Erkrankungen, Immundefekten, Infektionen und Malignomen zeigten deutliche Veränderungen der Klonalität, der Gennutzung und der biophysikalischen Eigenschaften des Immunrepertoires und lieferten wichtige Erkenntnisse über die Rolle adaptiver Immunantworten bei verschiedenen Erkrankungen.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für NGS des Immunrepertoires von T- und B-Zellen aus Blut und Gewebe zur Verfügung. Wir präsentieren eine Pipeline, die von der DNA-Isolierung über die Bibliotheksvorbereitung, die Sequenzierung auf NGS-Sequenzierern bis hin zu grundlegenden Analysen beginnt. Diese Methode ermöglicht die Erforschung spezifischer T- und B-Zellen auf Nukleotid- oder Aminosäureebene und kann so dynamische Veränderungen in Lymphozytenpopulationen und Diversitätsparametern bei verschiedenen Erkrankungen identifizieren. Diese Technik kommt langsam in die klinische Praxis und hat das Potenzial für die Identifizierung neuartiger Biomarker, Risikostratifizierung und Präzisionsmedizin.

Introduction

Das adaptive Immunsystem, bestehend aus T- und B-Lymphozyten, nutzt das immunologische Gedächtnis, um ein zuvor angetroffenes Antigen zu erkennen und eine schnelle Reaktion einzuleiten. Lymphozyten werden im Knochenmark erzeugt und reifen im Thymus (T-Zellen) oder Knochenmark (B-Zellen). Sowohl der T-Zell-Rezeptor (TCR) als auch der B-Zell-Rezeptor (BCR) weisen einzigartige Konfigurationen auf, die die Erkennung spezifischer Antigene ermöglichen. In der Homöostase zirkulieren T- und B-Zellen ständig und untersuchen die Billionen verschiedener Peptide, die auf Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert werden. Die TCR- oder BCR-Ligatur eines spezifischen Antigens mit hoher Affinität führt zusammen mit einer geeigneten Co-Stimulation zur Zellaktivierung, was im Falle von B-Zellen zu Zytokinsekretion, klonaler Expansion und Generierung von Antikörpern führt.

Die enorme Vielfalt der verschiedenen T- oder B-Zellen wird zusammenfassend als Immunrepertoire bezeichnet und ermöglicht das Erkennen unzähliger verschiedener Epitope. Um ein so großes Repertoire zu generieren, findet ein komplexer Prozess der zufälligen Anordnung verschiedener Gensegmente statt, wodurch nahezu endlose Kombinationen von Rezeptoren entstehen, die einzigartige Antigene binden können1. Dieser Prozess, der als V(D)J-Rekombination bezeichnet wird, umfasst Umlagerungen verschiedener variabler (V), Diversität (D) und verbindende (J) Gene, begleitet von zufälligen Deletionen und Insertionen von Nukleotiden in den Verbindungen2.

Die Architektur des adaptiven Immunsystems interessiert Wissenschaftler in verschiedenen Bereichen seit vielen Jahrzehnten. In der Vergangenheit wurden Sanger-Sequenzierung, komplementär bestimmende Region 3 (CDR3) Spektrentypisierung und Durchflusszytometrie verwendet, um das Immunrepertoire zu charakterisieren, lieferten jedoch eine niedrige Auflösung. In den letzten zehn Jahren ermöglichten Fortschritte bei Next-Generation-Sequencing-Methoden (NGS) einen tiefen Einblick in die Eigenschaften und die Zusammensetzung der TCR- und BCR-Repertoires eines Individuums3,4. Diese Hochdurchsatzsysteme (HTS) sequenzieren und verarbeiten Millionen von neu angeordneten TCR- oder BCR-Produkten gleichzeitig und ermöglichen eine hochauflösende Analyse spezifischer T- und B-Zellen auf Nukleotid- oder Aminosäureebene. NGS bietet eine neue Strategie, um das Immunrepertoire sowohl in den Bereichen Gesundheit als auch Krankheit zu untersuchen. Studien mit HTS zeigten veränderte TCR- und BCR-Repertoires bei Autoimmunerkrankungen5, primären Immundefekten6,7und Malignomen, wie z. B. bei akuter myeloischer Leukämie8. Mit NGS haben wir und andere eine oligoklonale Expansion spezifischer T- und B-Zellklone bei Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen (IBD), einschließlich Colitis ulcerosa und Morbus Crohn,gezeigt 9,10,11,12,13,14. Insgesamt deuten Studien aus verschiedenen Bereichen darauf hin, dass Veränderungen im Repertoire eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese immunvermittelter Störungen spielen.

Das aktuelle Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von DNA aus Darmbiopsien und Blut, die Generierung von TCRβ- und IGH-PCR-Bibliotheken für NGS und die Durchführung des Sequenzierungslaufs. Wir bieten auch grundlegende Schritte in der Immunrepertoire-Datenanalyse. Dieses Protokoll kann auch für die Generierung von TCRα-, TCRγ- und IGL-Bibliotheken angewendet werden. Die Methode ist auch mit anderen Organen (z.B. Lymphknoten, Tumoren, Synovialflüssigkeit, Fettgewebe etc.) kompatibel, sofern gewebespezifische Verdauungsprotokolle verwendet werden.

Protocol

Diese Studie wurde vom institutionellen Prüfungsausschuss des Sheba Medical Center genehmigt und die schriftliche Zustimmung aller teilnehmenden Probanden wurde eingeholt. 1. DNA-Isolierung und Quantifizierung Verdauung und Zelllyse von Darmbiopsien Rufen Sie Darmbiopsien ab, die entweder frisch gesammelt oder bei -20 °C oder -80 °C gelagert werden. Wenn Sie gefrorene Biopsien verwenden, tauen Sie auf Eis auf. 600 μL Kernlyselösung in ein steriles 1,7 ml Mikr…

Representative Results

Hier beschreiben wir eine Methode zur DNA-Isolierung aus Darmgewebe und Blut, die Vorbereitung von Bibliotheken für NGS und grundlegende Schritte eines Sequenzierungslaufs zur Immunrepertoire-Sequenzierung. Der Lauf generiert fastq-Dateien, die weiter in fasta-Dateien für die Verwendung in der internationalen ImMunoGeneTics (IMGT) / HighV-QUEST-Plattform konvertiert werden können. Dieses HTS führt viele Analysen von Zehntausenden von neu angeordneten TCRβ- und IGH-Sequenzen auf der Nukleotidebene15…

Discussion

Veränderungen in Der Häufigkeit und Funktion von B- und T-Lymphozyten treten häufig bei verschiedenen Malignomenauf 18, chronisch entzündlichen Erkrankungen (z. B. Colitis ulcerosa und rheumatoide Arthritis)10,19und in verschiedenen Immundefekten17,20. Die aktuelle Methode nutzt NGS, um einen detaillierten Überblick über TCR- und BCR-Repertoires zu ermöglichen, was den Nachw…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

nichts.

Materials

2-propanol Sigma I9516-500ML
1.7 mL micro-centrifuge tubes Axygen 8187631104051
15 mL centrifuge tubes Greiner 188261
Absolute ethanol Merck 1.08543.0250
Amplitaq Gold Thermo Fisher N8080241
AMPure XP Beads Beckman Coulter A63881
Heat block Bioer Not applicable
High Sensitivity D1000 Sample Buffer Agilent 5067-5603 For Tapestation
High Sensitivity D1000 ScreenTape Agilent 5067-5584 For Tapestation. Tubes sold seperately
Lymphotrack Assay kit Invivoscribe TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 Each includes 24 indexes
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) Illumina MS-102-2003 Includes standard flow cell type and all reagents required
MiSeq Sequencer Illumina SY-410-1003
PCR strips 4titude 4ti-0792
Proteinase K Invitrogen EO0491
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Q33226
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32854 Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes
Shaker Biosan Not applicable
Tapestation 2100 Bioanalyzer Agilent G2940CA
ultra pure water Bio-lab 7501
Wizard DNA isolation kit Promega A1120 Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Werner, L., Dor, C., Salamon, N., Nagar, M., Shouval, D. S. T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing. J. Vis. Exp. (167), e61792, doi:10.3791/61792 (2021).

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