Dieses Protokoll umfasst eine detaillierte Analyse der Peptidoglykanzusammensetzung mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie in Verbindung mit fortschrittlicher Merkmalsextraktion und bioinformatischer Analysesoftware.
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Methodenartikel
Semi-quantitative Analyse von Peptidoglycan mittels Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Bioinformatik
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Peptidoglycan ist ein wichtiger Bestandteil bakterieller Zellwände und ein häufiges zelluläres Ziel für antimikrobielle Mittel. Obwohl Aspekte der Peptidoglykanstruktur bei allen Bakterien ziemlich konserviert sind, gibt es auch erhebliche Unterschiede zwischen Gram-Positiven/Negativen und zwischen den Spezies. Darüber hinaus sind zahlreiche Variationen, Modifikationen oder Anpassungen des Peptidoglykans bekannt, die innerhalb einer Bakterienart als Reaktion auf die Wachstumsphase und/oder Umweltreize auftreten können. Diese Variationen erzeugen eine hochdynamische Struktur, von der bekannt ist, dass sie an vielen zellulären Funktionen beteiligt ist, einschließlich Wachstum/Teilung, Antibiotikaresistenz und Vermeidung der Wirtsabwehr. Um die Variation innerhalb des Peptidoglykans zu verstehen, muss die Gesamtstruktur in ihre Bestandteile (sogenannte Muropeptide) zerlegt und auf die gesamte zelluläre Zusammensetzung untersucht werden. Peptidoglycomics verwendet fortschrittliche Massenspektrometrie in Kombination mit einer leistungsstarken bioinformatischen Datenanalyse, um die Peptidoglykanzusammensetzung im Detail zu untersuchen. Das folgende Protokoll beschreibt die Reinigung von Peptidoglykan aus Bakterienkulturen, die Erfassung von Muropeptid-Intensitätsdaten durch ein Flüssigkeitschromatographen-Massenspektrometer und die Differentialanalyse der Peptidoglykanzusammensetzung unter Verwendung der Bioinformatik.
Einleitung
Peptidoglycan (PG) ist ein charakteristisches Merkmal von Bakterien, das dazu dient, die Zellmorphologie aufrechtzuerhalten und gleichzeitig Proteine und andere zelluläre Komponenten strukturell zu unterstützen 1,2. Das Rückgrat von PG besteht aus abwechselnd β-1,4-verknüpfter N-Acetyl-Muraminsäure (MurNAc) und N-Acetylglucosamin (GlcNAc)1,2. Jedes MurNAc besitzt ein kurzes Peptid, das am ᴅ-Lactylrest gebunden ist und mit benachbarten disaccharidgebundenen Peptiden vernetzt werden kann (Abbildung 1
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Protokoll
1. Peptidoglycan Probenvorbereitung
- Wachstum von Bakterienkulturen
HINWEIS: Das Wachstum der Bakterienkulturen variiert je nach Bakterienart und den untersuchten Wachstumsbedingungen. Die zu testenden experimentellen Parameter bestimmen die Wachstumsbedingungen.- Züchten Sie Bakterienkulturen unter Wachstumsbedingungen, die für den Bakterienstamm und das experimentelle Design erforderlich sind. Züchten Sie Bakterien als dreifache Kulturen (biologische Replikate), d.h. drei separate Kolonien pro Stamm oder Wachstumsbedingung.
ANMERKUNG: Es ist bekannt, dass die Wachstumsbedingungen und die Wachstumsphase signifikante Auswirkungen<....
- Züchten Sie Bakterienkulturen unter Wachstumsbedingungen, die für den Bakterienstamm und das experimentelle Design erforderlich sind. Züchten Sie Bakterien als dreifache Kulturen (biologische Replikate), d.h. drei separate Kolonien pro Stamm oder Wachstumsbedingung.
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Ergebnisse
Die erhöhte Nachweisempfindlichkeit von MS-Maschinen in Verbindung mit einer leistungsstarken Peak-Erkennungssoftware hat die Fähigkeit verbessert, die Substanzzusammensetzung komplexer Proben bis ins kleinste Detail zu isolieren, zu überwachen und zu analysieren. Unter Verwendung dieser technologischen Fortschritte haben neuere Studien zur Peptidoglykanzusammensetzung begonnen, automatisierte LC-MS-Merkmalsextraktionstechniken 12,13,14,24 gegenüber älteren HPLC-basierten Methoden zu verwenden
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Diskussion
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von Peptidoglykan aus Bakterienkulturen, zum Nachweis von LC-MS und zur Analyse der Zusammensetzung unter Verwendung bioinformatischer Techniken. Hier konzentrieren wir uns auf gramnegative Bakterien und einige geringfügige Modifikationen sind erforderlich, um die Analyse grampositiver Bakterien zu ermöglichen.
Die Herstellung von Muropeptiden ist seit ihrer ersten Herstellung in den 1960er Jahren praktisch gleich geblieben 9,11,15.
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Die Autoren danken Dr. Jennifer Geddes-McAlister und Dr. Anthony Clarke für ihre Beiträge zur Verfeinerung dieses Protokolls. Diese Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse des CIHR unterstützt, die an C.M.K. (PJT 156111) vergeben wurden, und durch einen NSERC Alexander Graham Bell CGS D, der an E.M.A. vergeben BioRender.com wurde.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| C18 Umkehrphasensäule - AdvanceBio Peptidsäule (100 mm x 2,1 mm 2,7 & Mikro; m) | Agilent | LC-MS Datenerfassungsregler | |
| Heizmantel, Optichem | Fisher | 50-401-788 | für 4 % SDS-Siede-Heizmantel |
| , 1000 mL Halbkugelförmiger | Fisher-CG1000008 | für 4 % SDS-Siede-Inkubator | |
| , 37 μm C | für die Sacculi-Aufreinigung und MS-Probenvorbereitung | ||
| Leibig-Kondensator, 300MM 24/40, | Fisher | CG121805 | für 4 % SDS-Kochen |
| Lyophilisator | Labconco | für die Gefriertrocknung von Sacculi | |
| Magentic-Rührer | Fisher | 90-691-18 | für 4 % SDS-Siedemassenspektrometer |
| Q-Tof Modell UHD 6530 | Aglient | LC-MS Datenerfassung | |
| Mikrozentrifugenfilter, Nanosep MF 0.2 µ m | Fisher | 50-197-9573 | Reinigung der Probe vor der MS-Injektion |
| Retortenständer | Fisher | 12-000-102 | für 4 % SDS-Siede |
| Retortenklemme | Fisher | S02629 | für 4 % SDS-Siedekolben |
| mit rundem Boden - 1 Liter Pyrex | Fisher | 07-250-084 | für 4 % SDS-Siede |
| Sonicator Modell 120 | Fisher | FB120 | für die Sacculi-Aufreinigung |
| Ultraschallgerät - Mikrospitze | Fisher | FB4422 | für die Sacculi-Reinigung |
| Ultrazentrifuge | Beckman | Sacculi-Waschstufen | |
| Ultrazentrifugenflaschen, Ti45 | Fisher | NC9691797 | Sacculi-Waschstufen |
| Wasserversorgung | City | für wassergekühlten Kondensator | |
| Software | |||
| Chemdraw | Cambridgesoft | molekularer Editor für die Vorhersage der Muropeptid-Fragmentierung | |
| Excel | Microsoft | Anzeigelisten von annotierten Muropeptiden, Abundanz, Isotopenmustern, etc. | |
| MassHunter Acquisition | Aglient | mit QTOF-Instrument | |
| MassHunter Mass Profiler Professional | Aglient | bioinformatische Differentialanalyse | |
| MassHunter Personal Compound Database and Library Manager | Aglient | m/z MS-Datenbank | |
| MassHunter Profinder | Aglient | rekursive Merkmalsextraktion | |
| MassHunter Qualitative Analyse | Aglient | Betrachtung von MS und MS/MS-Chromatogrammen | |
| Prism | Graphpad | Graphing Software | |
| Perseus | Max Plank Institute of Biochemistry | 1D-Annotation | |
| Material | |||
| Acetonitril | Fisher | A998-4 | |
| Ammoniumacetat | Fisher | A637 | |
| Amylase | Sigma-Aldrich | A6380 | |
| Borsäure | Fisher | BP168-1 | |
| DNase | Fisher | EN0521 | |
| Ameisensäure | Sigma-Aldrich | 27001-500ML-R | |
| LC-MS Tuning-Mix - HP0321 | Agilent | G1969-85000 | |
| Magnesiumchlorid | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesiumsulfat | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Mutanolysin aus Streptomyces globisporus ATCC 21553 | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Stickstoffgas (>99% Reinheit) | Praxair | NI 5.0UH-T | |
| Phosphorsäure | Fisher | A242 | |
| Pronase E aus Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| RNase | Fisher | EN0531 | |
| Natriumazid | Fisher | S0489 | |
| Natriumborhydrid | Sigma-Aldrich | 452890 | |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | Fisher | BP166 | |
| Natriumhydroxid | Fisher | S318 | |
| Natrium Phosphat (zweibasisch) | Fisher | S373 | |
| Natriumphosphat (einbasisch) | Fisher | S369 | |
| Stains-all | Sigma-Aldrich | E9379 |
Referenzen
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).
- Pazos, M., Peters, K. Peptidoglycan. Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W.
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Nachdrucke und Genehmigungen
