Semi-quantitative Analyse von Peptidoglycan mittels Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Bioinformatik

Peptoglycomics nutzt fortschrittliche Massenspektrometrie in Kombination mit einer leistungsstarken bioinformatischen Datenanalyse, um die Zusammensetzung von Peptidoglykanen im Detail zu untersuchen. Die Verwendung bioinformatischer Algorithmen ermöglicht die gleichzeitige Analyse, Extraktion und den Vergleich von Massenspektrometriedaten in einer Sammlung von Datendateien, wodurch der Arbeitsaufwand verringert und die Genauigkeit erhöht wird. Das Verständnis der vielfältigen Variationen und Modifikationen von Peptidoglycan hat Auswirkungen auf das Verständnis zellulärer Prozesse, einschließlich Wachstum und Teilung, Immunevasion des Wirts und antimikrobielle Resistenz.

Wir empfehlen, zunächst eine kleine Teilmenge von Proben vorzubereiten und zu analysieren, um sich mit dem Protokoll vertraut zu machen und als Pilotprojekt zur Bewertung der experimentellen Parameter zu fungieren. Da sich die Datenanalysesoftware für die Massenspektrometrie oft in den Definitionen unterscheidet, die bei der Beschreibung von Merkmalen und Funktionen verwendet werden, hilft eine visuelle Demonstration den Benutzern bei der plattformübergreifenden Anwendung dieses Protokolls. Für die Peptidoglycan-Sacculi-Extraktion werden gefrorene Zellpellets bei etwa einem bis 10 des ursprünglichen Kulturvolumens in 20 Millimolar Natriumphosphat bei vier Grad Celsius resuspendiert, bevor die Zellsuspension tropfenweise zu siedendem 8 %-SDS in 20 Millimolar Natriumphosphat zu einem endgültigen Eins-zu-Eins-Volumen hinzugefügt wird.

Lassen Sie es 30 Minuten bis drei Stunden lang unter Rühren leicht kochen, um eine vollständige Membrandissoziation zu gewährleisten. Die resultierende Mischung sollte völlig klar sein und keine verbleibenden Zellklumpen oder Viskosität aufweisen. Wenn die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt ist, sammeln Sie das Sacculi durch Ultrazentrifugation, gefolgt von fünf bis sieben Wäschen in etwa 50 Millilitern Raumtemperatur 20 Millimolar Natriumphosphat pro Waschgang, bis der Waschpuffer eine SDS-Konzentration von etwa 0,001 % aufweist, wie durch kolorimetrischen Farbstoff bestimmt.

Nach dem letzten Waschen resuspendieren Sie die Sacculi in 5 bis 10 Millilitern 20 Millimolar-Natriumphosphat bei Raumtemperatur und ergänzen Sie die Probe mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Amylase, DNase und RNase in 10 Millimolar Magnesiumsulfat für eine einstündige Inkubation mit Rühren oder Nutation bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation wird die Reaktion über Nacht mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Pronase bei 37 Grad Celsius verdaut. Am nächsten Morgen nach der Ultrazentrifugation wird die Probe eine Stunde lang in 25 Millilitern 2 % SDS und 20 Millimolar Natriumphosphat in einem Dampfgarer gekocht.

Am Ende der Inkubation waschen Sie die Probe fünf- bis siebenmal mit 50 Millilitern doppelt destilliertem Wasser bei Raumtemperatur, wie gezeigt. Wenn die SDS-Konzentration ca. 0,001 % erreicht, resuspendieren Sie das Pellet in einer ausreichenden Menge doppelt destilliertem Wasser, um eine Sacculi-Suspension zu erhalten, und waschen Sie den Behälter. Nach der Lagerung über Nacht bei minus 80 Grad Celsius wird die gefrorene Probe lyophilisiert, bevor die Sacculi auf eine Konzentration von 10 Milligramm Peptidoglykan pro Milliliter doppelt destilliertem Wasser verdünnt werden.

Starten Sie für die LC-MS-Analyse ein neues Projekt in der Gerätesoftware und weisen Sie die entsprechenden LC-MS QTOF-Datendateien der gewünschten experimentellen Bedingung zu. Führen Sie den rekursiven Merkmalsextraktionsassistenten des Datenverarbeitungsassistenten aus und stellen Sie die Datenverarbeitungsfilter so ein, dass sie den Parametern der LC-MS-Bedingungen und der Instrumentierung entsprechen, um Masse-Ladungs-Peaks, die einzelne Muropeptide repräsentieren, genau zu identifizieren, zu gruppieren und zu verifizieren. Überprüfen Sie die Ergebnisse am Ende der Merkmalsextraktion.

Wenn eine beträchtliche Anzahl von Features in einer Gruppe nicht ausgerichtet werden konnte, passen Sie die Parameter für die rekursive Filterung an, um das Erkennungsfenster nach Bedarf zu erweitern oder einzuschränken. Exportieren Sie dann die Daten als zusammengesetzte Austauschdatei. Für die differentielle spektrale Merkmalsanalyse starten Sie ein neues Projekt in der Systemsoftware und folgen Sie den Anweisungen zum Datenimport.

Wählen Sie während der Datenanalyse die Signifikanz- und Faltungsänderung für die Differenzialanalyse aus, und legen Sie die Basisdaten auf die mittlere Intensität in allen Datendateien fest. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, untersuchen Sie die resultierenden grafischen und statistischen Analysen, um Muropeptide zu identifizieren, die eine signifikante Änderung der Häufigkeit zwischen den getesteten Versuchsbedingungen zeigen. Klicken Sie im Projekt-Navigator mit der rechten Maustaste auf die verschiedenen Analysen, und wählen Sie eine Exportoption aus, um die Feature-Details als TSV-Datei zu speichern.

Stellen Sie sicher, dass Sie mehrere Analysen speichern, um alle relevanten Daten zu erhalten. Wählen Sie in der Differentialanalysesoftware unter Ergebnisinterpretation die Option ID-Browser aus, fügen Sie eine Bibliothek der erwarteten Muropeptidstrukturen hinzu und wählen Sie ähnliche Parameter aus, die für die Merkmalsextraktion demonstriert wurden, um eine vorhergesagte Muropeptid-Annotation für jedes identifizierte Merkmal zu erstellen. Um die vorhergesagte Muropeptid-Annotation manuell zu bestätigen, vergleichen Sie die Peaks des Massen-Ladungs-Verhältnisses des Tandem-Massenspektrometrie-Chromatogramms mit dem vorhergesagten Masse-Ladungs-Verhältnis aller möglichen Fragmentierungen einer bekannten Muropeptidstruktur.

Verwenden Sie einen molekularen Editor, um die vorhergesagte Muropeptidstruktur mit dem Massenfragmentierungswerkzeug zu zeichnen, um das Massen-Ladungs-Verhältnis der Massenspektrometrie-Fragmente zu zeigen, wenn jede Bindung entweder einzeln oder in Kombination gebrochen wird, und vergleichen Sie dann alle möglichen Fragmentierungen der Muropeptidstruktur mit dem Tandem-Massenspektrometrie-Chromatogramm. Um die Muropeptid-Annotation zu bestätigen, sollten die Peaks des Massen-Ladungs-Verhältnisses mehrerer Fragmente im Tandem-Massenspektrometrie-Chromatogramm mit einem sehr minimalen Ausrichtungsfenster für das Massen-Ladungs-Verhältnis gefunden werden. Um die globalen Veränderungen bei Muropeptidmodifikationen zu bewerten, bearbeiten Sie die tsv-Datei der statistisch signifikanten Muropeptide mit hochgefalteter Änderung, um eine einzelne Spalte für jede Muropeptidmodifikation einzuschließen.

Füllen Sie diese Spalte mit einer Bezeichnung für jedes annotierte Muropeptid und laden Sie die modifizierte tsv-Datei in Perseus hoch. Klicken Sie unter Zeilen mit Anmerkungen versehen auf Zeilen kategorisch annotieren, und fügen Sie jedem experimentellen Parameter Datendateien hinzu. Klicken Sie dann unter Test auf zwei Beispieltests, um den T-Test eines Schülers durchzuführen, und klicken Sie auf 1D, um eine 1D-Annotation durchzuführen.

Eine erhöhte Nachweisempfindlichkeit von Massenspektrometriemaschinen in Verbindung mit einer leistungsstarken Peak-Erkennungssoftware hat die Fähigkeit verbessert, die Substanzzusammensetzungen komplexer Proben bis ins kleinste Detail zu isolieren, zu überwachen und zu analysieren. Die Zuordnung jedes aus den Massenspektrometriedaten extrahierten Masse-zu-Ladungs-Peaks zu einem bestimmten Muropeptid wird durch Querverweise mit einer Datenbank bekannter und vorhergesagter Muropeptidstrukturen erleichtert. Das Fragmentierungs-Tandem-Massenspektrometrie-Chromatogramm für jedes extrahierte Merkmal kann mit dem Fragmentierungsprofil des Muropeptids verglichen werden, das unter Verwendung der Datenbank vorgeschlagen wird.

Vulkandiagramme können verwendet werden, um Muropeptide hervorzuheben, die eine statistisch signifikante Änderung der Abundanz zwischen den getesteten Bedingungen aufweisen. Wenn sie zusammen untersucht werden, können mehrere Muropeptide, die die gleiche Modifikation besitzen, auf einen Trend zu einer experimentellen Bedingung untersucht werden, und die gesamte Gruppe kann auf Signifikanz untersucht werden. Die Verfolgung einer Muropeptid-Modifikation auf diese Weise kann eine bestimmte enzymatische Aktivität identifizieren, die durch den experimentellen Parameter beeinflusst wird.

Darüber hinaus können Ausreißer aus diesem Trend enzymatische Aktivitäten mit einer bestimmten Spezifität oder biologischen Funktion aufzeigen. Dieses Verfahren untersucht biochemische Veränderungen und biologische Variationen in Polymeren und gibt so Einblick in die enzymatische Aktivität von PG in vivo. Die Untersuchung der PG-Zusammensetzung im Detail wird zum Verständnis komplexer zellulärer Strukturen beitragen, die Auswirkungen auf viele kritische physiologische Prozesse haben.