Name: Semi-quantitative Analyse von Peptidoglycan mittels Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Bioinformatik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Erfahren Sie die halbquantitative Analyse von Peptidoglycan mittels Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Bioinformatik. Diese Methode ermöglicht detaillierte Einblicke in bakterielle Zellwandstrukturen und deren biologische Variationen.

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Die Autoren danken Dr. Jennifer Geddes-McAlister und Dr. Anthony Clarke für ihre Beiträge zur Verfeinerung dieses Protokolls. Diese Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse des CIHR unterstützt, die an C.M.K. (PJT 156111) vergeben wurden, und durch einen NSERC Alexander Graham Bell CGS D, der an E.M.A. vergeben BioRender.com wurde.

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<li>Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amount+of+peptidoglycan+in+cell+walls+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von Peptidoglykan aus Bakterienkulturen, zum Nachweis von LC-MS und zur Analyse der Zusammensetzung unter Verwendung bioinformatischer Techniken. Hier konzentrieren wir uns auf gramnegative Bakterien und einige geringfügige Modifikationen sind erforderlich, um die Analyse grampositiver Bakterien zu ermöglichen.
Die Herstellung von Muropeptiden ist seit ihrer ersten Herstellung in den 1960er Jahren praktisch gleich geblieben 9,11,15.<sup c...

Peptidoglycan (PG) ist ein charakteristisches Merkmal von Bakterien, das dazu dient, die Zellmorphologie aufrechtzuerhalten und gleichzeitig Proteine und andere zelluläre Komponenten strukturell zu unterstützen 1,2. Das Rückgrat von PG besteht aus abwechselnd β-1,4-verknüpfter N-Acetyl-Muraminsäure (MurNAc) und N-Acetylglucosamin (GlcNAc)1,2. Jedes MurNAc besitzt ein kurzes Peptid, das am ᴅ-Lactylrest gebunden ist und mit benachbarten disaccharidgebundenen Peptiden vernetzt werden kann (Abbildung 1A,B). Durch diese Vernetzung entsteht eine netzartige Struktur, die die gesamte Zelle umfasst und oft als Sacculus bezeichnet wird (Abbildung 1C). Während der PG-Synthese werden Vorläufer im Zytoplasma erzeugt und durch Flippasen durch die zytoplasmatische Membran transportiert. Vorläufer werden anschließend durch Transglykosylase- und Transpeptidase-Enzyme, die die glykosidischen bzw. Peptidbindungen produzieren, in das reife PG eingebaut3. Einmal zusammengesetzt, gibt es jedoch zahlreiche Enzyme, die von den Bakterien produziert werden, die das PG modifizieren und/oder abbauen, um eine Reihe von zellulären Prozessen durchzuführen, einschließlich Wachstum und Teilung. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass verschiedene Modifikationen des PG anpassungsspezifische Anpassungen an den Stamm, die Wachstumsbedingungen und den Umweltstress verleihen, die mit der Zellsignalisierung, der antimikrobiellen Resistenz und der Immunevasion des Wirts in Verbindung gebracht wurden4. Eine häufige Modifikation ist beispielsweise die Hinzufügung einer C6-Acetylgruppe an das MurNAc, die Resistenz verleiht, indem sie den Zugang zu den Glykan-β-1,4-Bindungen an vom Wirt produzierte Lysozymenzyme einschränkt, die PG 4,5,6 abbauen. Bei Enterokokken verleiht die Substitution des terminalen ᴅ-Ala der Peptidseitenkette durch ᴅ-Lac eine größere Resistenz gegen das antimikrobielle Vancomycin 7,8.
Das allgemeine Verfahren zur PG-Isolierung und -Reinigung ist seit seiner Beschreibung in den 1960er Jahren relativ unverändertgeblieben 9. Bakterielle Membranen werden durch Wärmebehandlung mit SDS aufgelöst, gefolgt von enzymatischer Entfernung von gebundenen Proteinen, Glykolipiden und verbleibender DNA. Der gereinigte intakte Sacculus kann anschließend durch Hydrolyse der β-1,4-Bindung zwischen GlcNAc und MurNAc in die einzelnen Bestandteile aufgeschlossen werden. Dieser Aufschluss produziert GlcNAc-MurNAc-Disaccharide mit intakten strukturellen Modifikationen und/oder Vernetzungen, die als Muropeptide bezeichnet werden (Abbildung 1B).
Die Analyse der Zusammensetzung von PG wurde zunächst durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie-Trennung (HPLC) durchgeführt, um jedes Murropeptid zu reinigen, gefolgt von einer manuellen Identifizierung von Muropeptiden10,11. Dies wurde inzwischen durch die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS) abgelöst, die die Nachweisempfindlichkeit erhöht und den manuellen Arbeitsaufwand für die Reinigung jedes einzelnen Murropeptids verringert. Die zeitaufwändige und komplexe Natur der manuellen Identifizierung von Muropeptiden ist jedoch ein limitierender Faktor geblieben, der die Anzahl der durchgeführten Studien reduziert. In den letzten Jahren hat sich mit dem Aufkommen von "omic"-Technologien die automatisierte LC-MS-Merkmalsextraktion zu einem leistungsstarken Werkzeug entwickelt, das eine schnelle Erkennung und Identifizierung einzelner Verbindungen in komplexen Proben aus sehr großen Datensätzen ermöglicht. Sobald die Merkmale identifiziert sind, vergleicht die bioinformatische Software statistisch die Variation zwischen den Proben mithilfe der Differentialanalyse, isoliert selbst minimale Unterschiede zwischen dem komplexen Datensatz und zeigt sie dem Benutzer grafisch an. Die Anwendung von Merkmalsextraktionssoftware für die Analyse der PG-Zusammensetzung wurde gerade erst erforscht 12,13,14 und mit der bioinformatischen Analyse 12 gekoppelt. Im Gegensatz zur Proteomik-Analyse, die von den leicht verfügbaren Proteindatenbanken profitiert, die die Peptidfragmentierung vorhersagen und eine vollautomatische Identifizierung ermöglichen, gibt es derzeit keine Fragmentierungsbibliothek für Peptidoglykomics. Die Merkmalsextraktion kann jedoch mit bekannten und vorhergesagten Strukturdatenbanken gekoppelt werden, um die Identifizierung von Murropeptid12 vorherzusagen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung der LC-MS-basierten Merkmalsextraktion in Kombination mit einer Murropeptidbibliothek zur automatisierten Identifizierung und bioinformatischen Differentialanalyse der PG-Zusammensetzung vor (Abbildung 2).

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 Umkehrphasensäule - AdvanceBio Peptidsäule (100 mm x 2,1 mm 2,7 & Mikro; m)</td><td>Agilent</td><td></td><td>LC-MS Datenerfassungsregler</td></tr> für <tr><td>Heizmantel, Optichem</td><td>Fisher</td><td>50-401-788</td><td>für 4 % SDS-Siede-Heizmantel</td></tr><tr><td>, 1000 mL Halbkugelförmiger</td><td></td><td>Fisher-CG1000008</td><td>für 4 % SDS-Siede-Inkubator</td></tr><tr><td>, 37 μm C</td><td></td><td></td><td>für die Sacculi-Aufreinigung und MS-Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>Leibig-Kondensator, 300MM 24/40,</td> <td>Fisher</td><td>CG121805</td><td>für 4 % SDS-Kochen</td></tr><tr><td>Lyophilisator</td><td>Labconco</td><td></td><td>für die Gefriertrocknung von Sacculi</td></tr><tr><td>Magentic-Rührer</td><td>Fisher</td><td>90-691-18</td><td>für 4 % SDS-Siedemassenspektrometer</td></tr><tr><td>Q-Tof Modell UHD 6530</td><td>Aglient</td><td></td><td>LC-MS Datenerfassung</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenfilter, Nanosep MF 0.2 &micro; m</td><td>Fisher</td><td>50-197-9573</td><td>Reinigung der Probe vor der MS-Injektion</td></tr><tr><td>Retortenständer</td><td>Fisher</td><td>12-000-102</td><td>für 4 % SDS-Siede</td></tr><tr><td>Retortenklemme</td><td>Fisher</td><td>S02629</td><td>für 4 % SDS-Siedekolben</td></tr><tr><td>mit rundem Boden - 1 Liter Pyrex</td><td>Fisher</td><td>07-250-084</td><td>für 4 % SDS-Siede</td></tr><tr><td>Sonicator Modell 120</td><td>Fisher</td><td>FB120</td><td>für die Sacculi-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Ultraschallgerät - Mikrospitze</td><td>Fisher</td><td>FB4422</td><td>für die Sacculi-Reinigung</td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman</td><td></td><td>Sacculi-Waschstufen</td></tr><tr><td>Ultrazentrifugenflaschen, Ti45</td><td>Fisher</td><td>NC9691797</td><td>Sacculi-Waschstufen</td></tr><tr><td>Wasserversorgung</td><td>City</td><td></td><td>für wassergekühlten Kondensator</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemdraw</td><td>Cambridgesoft</td><td></td><td>molekularer Editor für die Vorhersage der Muropeptid-Fragmentierung</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Anzeigelisten von annotierten Muropeptiden, Abundanz, Isotopenmustern, etc.</td></tr><tr><td>MassHunter Acquisition</td><td>Aglient</td><td></td><td>mit QTOF-Instrument</td></tr><tr><td>MassHunter Mass Profiler Professional</td><td>Aglient</td><td></td><td>bioinformatische Differentialanalyse</td></tr><tr><td>MassHunter Personal Compound Database and Library Manager</td><td>Aglient</td><td></td><td>m/z MS-Datenbank</td></tr><tr><td>MassHunter Profinder</td><td>Aglient</td><td></td><td>rekursive Merkmalsextraktion</td></tr><tr><td>MassHunter Qualitative Analyse</td><td>Aglient</td><td></td><td>Betrachtung von MS und MS/MS-Chromatogrammen</td></tr><tr><td>Prism</td><td>Graphpad</td><td></td><td>Graphing Software</td></tr><tr><td>Perseus</td><td>Max Plank Institute of Biochemistry</td><td></td><td>1D-Annotation</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher</td><td>A998-4</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetat</td><td>Fisher</td><td>A637</td><td></td></tr><tr><td>Amylase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6380</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Fisher</td><td>BP168-1</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Fisher</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27001-500ML-R</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS Tuning-Mix - HP0321</td><td>Agilent</td><td>G1969-85000</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolysin aus Streptomyces globisporus ATCC 21553</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>Stickstoffgas (>99% Reinheit)</td><td>Praxair</td><td>NI 5.0UH-T</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorsäure</td><td>Fisher</td><td>A242</td><td></td></tr><tr><td>Pronase E aus Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Fisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Fisher</td><td>S0489</td><td></td></tr><tr><td>Natriumborhydrid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452890</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fisher</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Phosphat (zweibasisch)</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat (einbasisch)</td><td>Fisher</td><td>S369</td><td></td></tr><tr><td>Stains-all</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9379</td><td></td></tr></tbody></table>

semi-quantitative analyse von peptidoglycan mittels flüssigkeitschromatographie, massenspektrometrie und bioinformatik

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglycan ist ein wichtiger Bestandteil bakterieller Zellwände und ein häufiges zelluläres Ziel für antimikrobielle Mittel. Obwohl Aspekte der Peptidoglykanstruktur bei allen Bakterien ziemlich konserviert sind, gibt es auch erhebliche Unterschiede zwischen Gram-Positiven/Negativen und zwischen den Spezies. Darüber hinaus sind zahlreiche Variationen, Modifikationen oder Anpassungen des Peptidoglykans bekannt, die innerhalb einer Bakterienart als Reaktion auf die Wachstumsphase und/oder Umweltreize auftreten können. Diese Variationen erzeugen eine hochdynamische Struktur, von der bekannt ist, dass sie an vielen zellulären Funktionen beteiligt ist, einschließlich Wachstum/Teilung, Antibiotikaresistenz und Vermeidung der Wirtsabwehr. Um die Variation innerhalb des Peptidoglykans zu verstehen, muss die Gesamtstruktur in ihre Bestandteile (sogenannte Muropeptide) zerlegt und auf die gesamte zelluläre Zusammensetzung untersucht werden. Peptidoglycomics verwendet fortschrittliche Massenspektrometrie in Kombination mit einer leistungsstarken bioinformatischen Datenanalyse, um die Peptidoglykanzusammensetzung im Detail zu untersuchen. Das folgende Protokoll beschreibt die Reinigung von Peptidoglykan aus Bakterienkulturen, die Erfassung von Muropeptid-Intensitätsdaten durch ein Flüssigkeitschromatographen-Massenspektrometer und die Differentialanalyse der Peptidoglykanzusammensetzung unter Verwendung der Bioinformatik.

Die erhöhte Nachweisempfindlichkeit von MS-Maschinen in Verbindung mit einer leistungsstarken Peak-Erkennungssoftware hat die Fähigkeit verbessert, die Substanzzusammensetzung komplexer Proben bis ins kleinste Detail zu isolieren, zu überwachen und zu analysieren. Unter Verwendung dieser technologischen Fortschritte haben neuere Studien zur Peptidoglykanzusammensetzung begonnen, automatisierte LC-MS-Merkmalsextraktionstechniken 12,13,14,24 gegenüber älteren HPLC-basierten Methoden zu verwenden<sup...

Dieses Protokoll umfasst eine detaillierte Analyse der Peptidoglykanzusammensetzung mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie in Verbindung mit fortschrittlicher Merkmalsextraktion und bioinformatischer Analysesoftware.

Semi-quantitative Analyse von Peptidoglycan mittels Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Bioinformatik

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Peptoglycomics nutzt fortschrittliche Massenspektrometrie in Kombination mit einer leistungsstarken bioinformatischen Datenanalyse, um die Zusammensetzung von Peptidoglykanen im Detail zu untersuchen. Die Verwendung bioinformatischer Algorithmen ermöglicht die gleichzeitige Analyse, Extraktion und den Vergleich von Massenspektrometriedaten in einer Sammlung von Datendateien, wodurch der Arbeitsaufwand verringert und die Genauigkeit erhöht wird. Das Verständnis der vielfältigen Variationen und Modifikationen von Peptidoglycan hat Auswirkungen auf das Verständnis zellulärer Prozesse, einschließlich Wachstum und Teilung, Immunevasion des Wirts und antimikrobielle Resistenz.Wir empfehlen, zunächst eine kleine Teilmenge von Proben vorzubereiten und zu analysieren, um sich mit dem Protokoll vertraut zu machen und als Pilotprojekt zur Bewertung der experimentellen Parameter zu fungieren. Da sich die Datenanalysesoftware für die Massenspektrometrie oft in den Definitionen unterscheidet, die bei der Beschreibung von Merkmalen und Funktionen verwendet werden, hilft eine visuelle Demonstration den Benutzern bei der plattformübergreifenden Anwendung dieses Protokolls. Für die Peptidoglycan-Sacculi-Extraktion werden gefrorene Zellpellets bei etwa einem bis 10 des ursprünglichen Kulturvolumens in 20 Millimolar Natriumphosphat bei vier Grad Celsius resuspendiert, bevor die Zellsuspension tropfenweise zu siedendem 8 %-SDS in 20 Millimolar Natriumphosphat zu einem endgültigen Eins-zu-Eins-Volumen hinzugefügt wird.Lassen Sie es 30 Minuten bis drei Stunden lang unter Rühren leicht kochen, um eine vollständige Membrandissoziation zu gewährleisten. Die resultierende Mischung sollte völlig klar sein und keine verbleibenden Zellklumpen oder Viskosität aufweisen. Wenn die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt ist, sammeln Sie das Sacculi durch Ultrazentrifugation, gefolgt von fünf bis sieben Wäschen in etwa 50 Millilitern Raumtemperatur 20 Millimolar Natriumphosphat pro Waschgang, bis der Waschpuffer eine SDS-Konzentration von etwa 0,001 % aufweist, wie durch kolorimetrischen Farbstoff bestimmt.Nach dem letzten Waschen resuspendieren Sie die Sacculi in 5 bis 10 Millilitern 20 Millimolar-Natriumphosphat bei Raumtemperatur und ergänzen Sie die Probe mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Amylase, DNase und RNase in 10 Millimolar Magnesiumsulfat für eine einstündige Inkubation mit Rühren oder Nutation bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation wird die Reaktion über Nacht mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Pronase bei 37 Grad Celsius verdaut. Am nächsten Morgen nach der Ultrazentrifugation wird die Probe eine Stunde lang in 25 Millilitern 2 % SDS und 20 Millimolar Natriumphosphat in einem Dampfgarer gekocht.Am Ende der Inkubation waschen Sie die Probe fünf- bis siebenmal mit 50 Millilitern doppelt destilliertem Wasser bei Raumtemperatur, wie gezeigt. Wenn die SDS-Konzentration ca. 0,001 % erreicht, resuspendieren Sie das Pellet in einer ausreichenden Menge doppelt destilliertem Wasser, um eine Sacculi-Suspension zu erhalten, und waschen Sie den Behälter. Nach der Lagerung über Nacht bei minus 80 Grad Celsius wird die gefrorene Probe lyophilisiert, bevor die Sacculi auf eine Konzentration von 10 Milligramm Peptidoglykan pro Milliliter doppelt destilliertem Wasser verdünnt werden.Starten Sie für die LC-MS-Analyse ein neues Projekt in der Gerätesoftware und weisen Sie die entsprechenden LC-MS QTOF-Datendateien der gewünschten experimentellen Bedingung zu. Führen Sie den rekursiven Merkmalsextraktionsassistenten des Datenverarbeitungsassistenten aus und stellen Sie die Datenverarbeitungsfilter so ein, dass sie den Parametern der LC-MS-Bedingungen und der Instrumentierung entsprechen, um Masse-Ladungs-Peaks, die einzelne Muropeptide repräsentieren, genau zu identifizieren, zu gruppieren und zu verifizieren. Überprüfen Sie die Ergebnisse am Ende der Merkmalsextraktion.Wenn eine beträchtliche Anzahl von Features in einer Gruppe nicht ausgerichtet werden konnte, passen Sie die Parameter für die rekursive Filterung an, um das Erkennungsfenster nach Bedarf zu erweitern oder einzuschränken. Exportieren Sie dann die Daten als zusammengesetzte Austauschdatei. Für die differentielle spektrale Merkmalsanalyse starten Sie ein neues Projekt in der Systemsoftware und folgen Sie den Anweisungen zum Datenimport.Wählen Sie während der Datenanalyse die Signifikanz- und Faltungsänderung für die Differenzialanalyse aus, und legen Sie die Basisdaten auf die mittlere Intensität in allen Datendateien fest. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, untersuchen Sie die resultierenden grafischen und statistischen Analysen, um Muropeptide zu identifizieren, die eine signifikante Änderung der Häufigkeit zwischen den getesteten Versuchsbedingungen zeigen. Klicken Sie im Projekt-Navigator mit der rechten Maustaste auf die verschiedenen Analysen, und wählen Sie eine Exportoption aus, um die Feature-Details als TSV-Datei zu speichern.Stellen Sie sicher, dass Sie mehrere Analysen speichern, um alle relevanten Daten zu erhalten. Wählen Sie in der Differentialanalysesoftware unter Ergebnisinterpretation die Option ID-Browser aus, fügen Sie eine Bibliothek der erwarteten Muropeptidstrukturen hinzu und wählen Sie ähnliche Parameter aus, die für die Merkmalsextraktion demonstriert wurden, um eine vorhergesagte Muropeptid-Annotation für jedes identifizierte Merkmal zu erstellen. Um die vorhergesagte Muropeptid-Annotation manuell zu bestätigen, vergleichen Sie die Peaks des Massen-Ladungs-Verhältnisses des Tandem-Massenspektrometrie-Chromatogramms mit dem vorhergesagten Masse-Ladungs-Verhältnis aller möglichen Fragmentierungen einer bekannten Muropeptidstruktur.Verwenden Sie einen molekularen Editor, um die vorhergesagte Muropeptidstruktur mit dem Massenfragmentierungswerkzeug zu zeichnen, um das Massen-Ladungs-Verhältnis der Massenspektrometrie-Fragmente zu zeigen, wenn jede Bindung entweder einzeln oder in Kombination gebrochen wird, und vergleichen Sie dann alle möglichen Fragmentierungen der Muropeptidstruktur mit dem Tandem-Massenspektrometrie-Chromatogramm. Um die Muropeptid-Annotation zu bestätigen, sollten die Peaks des Massen-Ladungs-Verhältnisses mehrerer Fragmente im Tandem-Massenspektrometrie-Chromatogramm mit einem sehr minimalen Ausrichtungsfenster für das Massen-Ladungs-Verhältnis gefunden werden. Um die globalen Veränderungen bei Muropeptidmodifikationen zu bewerten, bearbeiten Sie die tsv-Datei der statistisch signifikanten Muropeptide mit hochgefalteter Änderung, um eine einzelne Spalte für jede Muropeptidmodifikation einzuschließen.Füllen Sie diese Spalte mit einer Bezeichnung für jedes annotierte Muropeptid und laden Sie die modifizierte tsv-Datei in Perseus hoch. Klicken Sie unter Zeilen mit Anmerkungen versehen auf Zeilen kategorisch annotieren, und fügen Sie jedem experimentellen Parameter Datendateien hinzu. Klicken Sie dann unter Test auf zwei Beispieltests, um den T-Test eines Schülers durchzuführen, und klicken Sie auf 1D, um eine 1D-Annotation durchzuführen.Eine erhöhte Nachweisempfindlichkeit von Massenspektrometriemaschinen in Verbindung mit einer leistungsstarken Peak-Erkennungssoftware hat die Fähigkeit verbessert, die Substanzzusammensetzungen komplexer Proben bis ins kleinste Detail zu isolieren, zu überwachen und zu analysieren. Die Zuordnung jedes aus den Massenspektrometriedaten extrahierten Masse-zu-Ladungs-Peaks zu einem bestimmten Muropeptid wird durch Querverweise mit einer Datenbank bekannter und vorhergesagter Muropeptidstrukturen erleichtert. Das Fragmentierungs-Tandem-Massenspektrometrie-Chromatogramm für jedes extrahierte Merkmal kann mit dem Fragmentierungsprofil des Muropeptids verglichen werden, das unter Verwendung der Datenbank vorgeschlagen wird.Vulkandiagramme können verwendet werden, um Muropeptide hervorzuheben, die eine statistisch signifikante Änderung der Abundanz zwischen den getesteten Bedingungen aufweisen. Wenn sie zusammen untersucht werden, können mehrere Muropeptide, die die gleiche Modifikation besitzen, auf einen Trend zu einer experimentellen Bedingung untersucht werden, und die gesamte Gruppe kann auf Signifikanz untersucht werden. Die Verfolgung einer Muropeptid-Modifikation auf diese Weise kann eine bestimmte enzymatische Aktivität identifizieren, die durch den experimentellen Parameter beeinflusst wird.Darüber hinaus können Ausreißer aus diesem Trend enzymatische Aktivitäten mit einer bestimmten Spezifität oder biologischen Funktion aufzeigen. Dieses Verfahren untersucht biochemische Veränderungen und biologische Variationen in Polymeren und gibt so Einblick in die enzymatische Aktivität von PG in vivo. Die Untersuchung der PG-Zusammensetzung im Detail wird zum Verständnis komplexer zellulärer Strukturen beitragen, die Auswirkungen auf viele kritische physiologische Prozesse haben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Angesichts Speichel Probenahme für zukünftige klinische Anwendung wurde ein Lollipop-ähnliche Ultrafiltration (LLUF) Sonde hergestellt, um in die menschliche Mundhöhle passen. Direkte Analyse von unverdauten Speichel mit nanoLC-LTQ Massenspektrometrie zeigten die Fähigkeit von LLUF Sonden, um große Proteine ​​und hohe Abundanz Proteine ​​zu entfernen, und machen Low-reiche Peptide mehr nachweisbar.

Probenahme menschliche Speichel Indigene Peptidoms Mit einem Lollipop-Like Ultrafiltration Sonde: vereinfachen und erweitern Peptid-Erkennung für Klinische Massenspektrometrie

Die bakterielle Zellwand besteht aus Peptidoglycan, einem makromolekularen Netzwerk von Zuckersträngen, die durch Peptide vernetzt sind. Ultra Performance Liquid Chromatography bietet eine hohe Auflösung und Durchsatz für neuartige Entdeckungen der Peptidoglykan-Zusammensetzung. Wir präsentieren ein Verfahren zur Isolierung von Zellwänden (Sacculi) und deren anschließender Vorbereitung auf die Analyse über UPLC.

Isolierung und Vorbereitung von bakteriellen Zellwänden für die Kompositionsanalyse durch Ultra Performance Liquid Chromatographie

Der allgegenwärtige Botenstoff c-di-GMP steuert das Wachstum und Verhalten vieler Bakterien. Wir haben eine neuartige, auf der Capture Compound-Massenspektrometrie basierende Technologie entwickelt, um c-di-GMP-bindende Proteine in praktisch jeder Bakterienspezies biochemisch zu identifizieren und zu charakterisieren.

Capture Compound Mass Spectrometry - Ein leistungsfähiges Tool zum Identifizieren Novel c-di-GMP Effektorproteinen

Es wurde ein Hochdurchsatzprotokoll für die kombinierte Proteomik- und Glykomik-Aufreinigung und die LC-MS/MS-Quantifizierung im Plasma entwickelt. Die Deamidierungsanalyse von N-verknüpften Glykosylierungsmotiven war spezifisch für deglykosylierte Stellen. Eine genaue Quantifizierung der N-Glykane wurde durch die Kopplung der filtergestützten N-Glykan-Trennung an die Individualitätsnormalisierung bei der Markierung mit der Glykanhydrazid-Tag-Strategie erreicht.

Eine quantitative Glycomics und Proteomics Kombinierte Reinigungsstrategie

Die Massenspektrometrie-basierte phyloproteomics (MSPP) wurde verwendet , um eine Sammlung von Campylobacter jejuni ssp geben. Doylei isoliert auf Stammebene im Vergleich zu multilocus Sequenz Typisierung (MLST).

Subtyping von<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Massen Isolaten Spectrometry-basierte PhyloProteomics (MSPP)

Hier stellen wir Protokolle für die Affinitätsreinigung von Proteinkomplexen und deren Trennung durch blaue native PAGE, gefolgt von Proteinkorrelationsprofilierungs freie quantitative Massenspektrometrie Label. Diese Methode ist nützlich Interaktom in verschiedene Proteinkomplexe zu lösen.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Ein Protokoll wird für die manuelle Synthese von Oligo-Peptoids gefolgt von Sequenzanalyse durch Massenspektrometrie beschrieben.

Synthese- und Massenspektrometrie der Oligo-peptoids

Die Anreicherung von bakterielle Lipoproteine mit einem nichtionischen Tensid Phase Partitionierung Methode wird für die direkte Verwendung in TLR-Tests oder andere Anwendungen beschrieben. Weitere Schritte sind detailliert, um strukturelle Charakterisierung N-terminalen tryptic Lipopeptide Vorbereitung durch Massenspektrometrie.

Bereicherung der bakterielle Lipoproteine und Vorbereitung der N-terminalen Lipopeptide Strukturaufklärung durch Massenspektrometrie

Hier präsentieren wir objektive Quantifizierung der standortspezifischen Protein Acetylierung und/oder Succinylation Belegung (Stöchiometrie) eine gesamte Proteoms durch eine ratiometrischen Analyse der endogenen Modifikationen, Änderungen, die nach quantitativen chemische Acylation mit stabilen Isotopen-Label Anhydride. In Kombination mit sensiblen Daten-unabhängige Übernahme Massenspektrometrie erhalten Sie genaue Website Belegung Messungen.

Quantifizierung der standortspezifischen Protein Lysin Acetylierung und Succinylation Stöchiometrie mittels Massenspektrometrie Daten-unabhängige Übernahme

Wir präsentieren ein Protokoll mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie, um wichtige zelluläre Lipide in Saccharomyces cerevisiaezu identifizieren und zu quantifizieren. Die beschriebene Methode zur quantitativen Bewertung wichtiger Lipidklassen innerhalb einer Hefezelle ist vielseitig, robust und empfindlich.

Quantitative Analyse des Zelllipidoms von Saccharomyces Cerevisiae mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Die offene Suche ermöglicht die Identifizierung von Glykopeptiden, die mit bisher unbekannten Glykanzusammensetzungen verziert sind. In diesem Artikel wird ein optimierter Ansatz für die Durchführung einer offenen Suche und anschließende Glykan-fokussierte Glykopeptidsuche für Bakterienproben unter Verwendung von Acinetobacter baumannii als Modell vorgestellt.

Die Anwendung offener suchbasierter Ansätze zur Identifizierung von Acinetobacter baumannii O-verknüpften Glykopeptiden

Erfahren Sie die halbquantitative Analyse von Peptidoglycan mittels Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Bioinformatik. Diese Methode ermöglicht detaillierte Einblicke in bakterielle Zellwandstrukturen und deren biologische Variationen.

Semi-quantitative Analyse von Peptidoglycan mittels Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Bioinformatik

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