Methodenartikel

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

DOI:

10.3791/61800

⸱

7. Oktober 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedicine, Integrative Physiology and Pharmacology Unit, University of Turku, Turku, Finland, 2Department of Pediatrics, Turku University Hospital, Turku, Finland, 3Centre for Reproductive Health, Hudson Institute of Medical Research, Melbourne, VIC 3168, Australia, 4Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University, Melbourne, VIC 3800, Australia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die transilluminationsunterstützte Mikrodissektion von Segmenten von erwachsenen Mausseminiferous Tubuli, die bestimmte Stadien des seminiferen Epithelzyklus darstellen, und Zelltypen darin und anschließende Immunostainierung von Squashpräparaten und intakten Tubulisegmenten.

Zusammenfassung

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Spermatogenese ist ein einzigartiger Differenzierungsprozess, der letztlich zu einem der unterschiedlichsten Zelltypen des Körpers, dem Sperma, führt. Die Differenzierung von Keimzellen erfolgt in den zytoplasmatischen Taschen somatischer Sertolizellen, die gleichzeitig 4 bis 5 Generationen von Keimzellen beherbergen und ihre Entwicklung koordinieren und synchronisieren. Daher ist die Zusammensetzung der Keimzelltypen innerhalb eines Querschnitts konstant, und diese Zellassoziationen werden auch als Stadien (I–XII) des seminiferen Epithelzyklus bezeichnet. Wichtig ist, dass Stadien auch aus intakten seminiferen Tubuli identifiziert werden können, basierend auf ihren differenziellen Lichtabsorptions-/Streueigenschaften, die durch Transillumination aufgedeckt werden, und der Tatsache, dass die Stufen einander entlang des Tubuli in numerischer Reihenfolge folgen. Dieser Artikel beschreibt eine transilluminationsunterstützte Mikrodissektionsmethode zur Isolierung seminiferöser Tubulensegmente, die bestimmte Stadien des seminiferen Epithelzyklus der Maus darstellen. Das Lichtabsorptionsmuster seminiferöser Tubuli wird zunächst unter einem Seziermikroskop untersucht, und dann werden Tubulensegmente, die bestimmte Stufen darstellen, geschnitten und für nachgelagerte Anwendungen verwendet. Hier beschreiben wir Immunstainierungsprotokolle für stufenspezifische Squashpräparate und für intakte Tubulesegmente. Diese Methode ermöglicht es einem Forscher, sich auf biologische Ereignisse zu konzentrieren, die in bestimmten Phasen der Spermatogenese stattfinden, und bietet so ein einzigartiges Werkzeug für entwicklungstechnische, toxikologische und zytologische Studien der Spermatogenese und der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen.

Einleitung

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Die Differenzierung männlicher Keimzellen von diploiden Spermatogonien zu reifen haploiden Spermatozoen, d.h.Spermatogenese, ist ein komplexer Prozess, der im Epithel von seminiferen Tubuli in den Hoden eines sexuell reifenIndividuums1 stattfindet. Mitotische Nachkommen von A1-Spermatogonien teilen sich zuerst fünfmal, um die differenzierungsgebundene Population zu erweitern, und treten dann als Spermatozyten ein, die letztlich zu haploiden Spermatoiden führen. Die Differenzierung von runden Spermien in Spermatozoen, d.h.Spermiogenese, beinhaltet komplexe Veränderungen in der zellulären Morphologie, einschließlich nuklearer Verdichtung und Konstruktion von spermienspezifischen Strukturen wie dem Akrosom und dem Flagellum. In der Maus dauert der gesamte Prozess der Spermatogenese 35 Tage, um2,3.

An jedem Gebietsschema beherbergt das Seminiferepithel bis zu fünf Kohorten differenzierender Keimzellen sowie der Keimbahnstamm-/Vorläuferzellen und der somatischen Sertolizellen1. Differenzierende Keimzellen bilden konzentrische Schichten, deren Zusammensetzung vorhersagbar ist, und haploide Zellen in einem bestimmten Entwicklungsschritt immer mit bestimmten Arten von Spermatozyten und Spermatogonie4,5assoziieren. Daher beherbergt jeder Querschnitt eines Tubuli Kohorten von Keimzellen mit konstanter Zusammensetzung. Diese spezifischen Zellassoziationen werden als die Stadien des seminiferen Epithels definiert. Stufen an sich stellen keine stagnierenden Kontrollpunkt-ähnlichen Zustände dar, sondern entwickeln sich ständig weiter, wenn die Differenzierung von Keimzellkohorten in Synchron1,2,6fortschreitet. Bei Mäusen gibt es 12 Stufen (I-XII)2, die segmental entlang der Längsachse des seminiferösen Tubuli angeordnet sind, und sie folgen einander in einer logischen Reihenfolge und bilden so die Welle des seminiferösen Epithels oder der spermaatogenen Welle7,8,9 ( Abbildung1). Die Vollendung der Spermatogenese dauert vier Zyklen, und hierarchische Schichten oder Kohorten von differenzierenden Keimzellen innerhalb eines seminiferösen Tubbulenquerschnitts sind zeitlich ein Seminiferzyklus voneinander entfernt. Die Länge des Zyklus ist artabhängig und in der Maus dauert jeder Zyklus 8,6 Tage10.

Die Stadien können auf der Grundlage der zellulären Zusammensetzung und Organisation des seminiferen Epithels auf den histologischen Hodenabschnitten5 (Abbildung 1 und Abbildung 2) identifiziert werden. Die histologische Analyse ist jedoch mühsam, zeitaufwändig und erfordert eine Fixierung und Färbung und kann daher nicht auf lebendes Gewebe angewendet werden. Wichtig ist, dass die Inszenierung auch auf lebendem Gewebe unter einem Seziermikroskop durchgeführt werden kann, indem die unterschiedlichen Lichtabsorptions-/Streumuster genutzt werden, die in verschiedenen Stadien des Zyklus dargestellt werden (Abbildung 2). Die Fähigkeit jeder Stufe, Licht zu absorbieren und zu streuen, ist relativ zum Chromatinkondensationsgrad der späten postmeiotischen Spermaatien, die jede bestimmte Stufe Wirt ist, und der Verpackung dieser Zellen in Bündeln7,11. Die Spermadifferenzierung, d.h.Spermiogenese, ist weiter in 16 Entwicklungsschritte unterteilt, darunter 8 Schritte runder Sperma (Schritt 1-8) und 8 Schritte der lästigen Spermatiendifferenzierung (Schritte 9-16)(Abbildung 1). Schritt 9-11 langlängige Spermatoren (Stufe IX-XI) zeigen nur einen niedrigen Chromatinkondensationsgrad, was zu einer geringen Menge an Licht führt, die absorbiert wird. Die Chromatinkondensation beginnt in Schritt 11 Spermaatiden (Stufe XI), und Schritt 15-16 längliche Spermatien (Stufe IV-VIII) enthalten vollständig kondensiertes Chromatin und weisen daher eine maximale Lichtabsorption auf (Abbildung 3). Chromatin muss kondensiert werden, um fest in den Spermienkopf gepackt zu werden. Weitere Faktoren, die zum Lichtabsorptionsmuster beitragen, sind die Lage der länglichen Spermatoide innerhalb des Epithels (Basal vs. apikal) und die Bündelung von länden Spermaatiden (ausgesprochen in den Stadien II-V)11 (Abbildung 3). Bündel werden als Flecken in der Mitte der Tubuli und als Streifen an den Rändern unter einem Seziermikroskop und je kondensierter das Chromatin, desto dunkler der Fleck/Streifen11.

Dieser Artikel beschreibt die Verwendung der transilluminationsunterstützten Mikrodissektionsmethode zur Isolierung seminiferöser Tubulisegmente, die bestimmte Stadien des seminiferen Epithelzyklus darstellen. Einmal isoliert, können inszenierte Tubulesegmente verschiedenen nachgelagerten Analysen unterzogen werden, einschließlich biochemischer RNA- und Proteinanalysen12,13,14,15, Durchflusszytometrie16, ex vivo Tubule-Kultur17 und Immunostaining18. Hier bieten wir auch detaillierte Nachflussprotokolle zur Vorbereitung von gequetschten Monolayern von inszenierten Tubulesegmenten für die morphologische Analyse von Lebenden Zellen und die anschließende Immunfärbung sowie für die ganzmontierte Immunfärbung von Tubulensegmenten. Der Workflow in Abbildung 4auf den Punkt gebracht.

Die transilluminationsunterstützte Mikrodissektionsmethode ermöglicht dank der synchronisierten zellulären Zusammensetzung der Stadien eine genaue Identifizierung und Isolierung von Keimzellen bei bestimmten Differenzierungsschritten. Wichtig ist, es ermöglicht auch die Untersuchung von stadium-abhängigen Ereignissen während der Spermatogenese auf lebendem Gewebe. Angesichts des Fehlens skalierbarer In-vitro-Modelle für die Spermatogenese hat diese Methode auch einen einzigartigen Vorteil, gezielte kurzfristige Entwicklungs- und toxikologische Studien an stufenspezifischen Tubulesegmenten ex vivo12,17zu ermöglichen. Während wir die Methode hier für die Maus beschreiben, kann das gleiche Verfahren auf alle Säugetierarten mit Längs- und Segmentanordnung von seminiferen Epithelstadien angewendet werden, wie die Ratte4,7,15,19,20.

Protokoll

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Die Wartung von Labormäusen und alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften für die Pflege und Verwendung von Labortieren an der Universität Turku durchgeführt.

1. Herstellung von seminiferen Tubuli für die Mikrodissektion

  1. Opfern Sie eine erwachsene männliche Maus (≥8 Wochen alt, Hoden 80–120 mg je nach Stamm und Alter) durch CO 2-Erstickung gefolgt von zervikaler Dislokation.
    HINWEIS: Die Maus sollte geschlechtsreif und vorzugsweise mindestens 8 Wochen alt sein. Transilluminationsmuster von jugendlichen Mäusen unterscheidet sich von Erwachsenen, weil die Welle des seminiferösen Epithels noch nicht vollständig etabliert ist, und das Timing der ersten Welle der Spermatogenese ist deutlich21,22. Der Mangel an länglichen Spermaatiden bei <4 Wochen alten männlichen Mäusen schließt ihre Verwendung für transilluminationsunterstützte Mikrodissektion aus. Alle Mausstämme, die eine normale Spermatogenese haben, können verwendet werden.
  2. Sprühen Sie den ventralen Bauch mit 70% Ethanol. Öffnen Sie die abdominobeckende Kavität mit einer sterilen Schere, wodurch eine V-förmige Öffnung entsteht.
  3. Ziehen Sie das epididymale Fettpolster mit sterilen Zangen, lokalisieren Sie die Hoden, sezieren Sie sie mit einer Schere und legen Sie sie auf eine sterile 100-mm-Petrischale, die PBS enthält.
    HINWEIS: Um die Sterilität aufrechtzuerhalten, stellen Sie sicher, dass alle Laborwaren und chirurgischen Werkzeuge steril sind.
  4. Mit einer feingekippten Schere entkapseln Sie die Hoden, indem Sie einen Schlitz in der Tunika albugineaschneiden, dem dicken Faserblech, das die Hoden einkapselt. Dann reißen Sie die Tunika mit einem Paar Zange auf. Zwingen Sie die Tubuli durch Drücken mit Zangen und entsorgen Sie die Tunika.
    HINWEIS: Beim Wegwerfen der Tunika könnte es für einige nachgelagerte Anwendungen von Vorteil sein, dass arteria hoicularis zusammen mit der Tunika entfernt wird. Vermeiden Sie eine Beschädigung der seminiferous tubulies.
  5. Bewegen Sie die seminiferous Tubuli zu einer neuen Petrischale und gießen Sie genug sterile PBS, um den Boden der Petrischale zu bedecken. Als nächstes ziehen Sie die Tubuli vorsichtig auseinander, vermeiden aber, die Tubuli zu beschädigen.
    HINWEIS: Zu viel mechanische Beanspruchung wirkt sich auf das Transilluminationsmuster aus und beeinträchtigt die Lebensfähigkeit des Gewebes und seiner zellulären Architektur. Die Tubuli können ab diesem Zeitpunkt auch für ganzmontierte Immunostainierungen ohne Inszenierung (3B) verarbeitet werden. Manchmal reicht es aus, das Stadium nachträglich zu definieren, indem Antikörper gegen Proteine, die in differenzierender Spermatogonie exprimiert werden, wie SALL4, c-KIT und DNMT3A18,23,eingeschlossen werden. Die Dichte der Spermatogonie ist ein relativ zuverlässiger Indikator für die Stufe (Abbildung 2).

2. Transilluminationsunterstützte Mikrodissektion

  1. Legen Sie die Petrischale unter ein Seziermikroskop fest, indem Sie sie auf die Bühne kleben.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Petrischale gut zu kleben, um ihre Bewegung zu verhindern, die eine Vermischung der gesammelten inszenierten seminiferen Tubulensegmente verursachen könnte.
  2. Um das Lichtabsorptionsmuster von seminiferen Tubuli unter Fokus zu enthüllen, stellen Sie sicher, dass die Probe von unten beleuchtet wird und das Licht durch die Probe geht, d.h.es wird transbeleuchtet.
    ANMERKUNG: Die Menge des absorbierten/gestreuten Lichts ist relativ zum Chromatinkondensationsgrad in länglichen Spermaatiden und ihrer Bündelung im Seminifer-Tubuli: Je kondensierter, desto mehr Licht absorbiert wird, d. h., erscheint dunkler.
  3. Machen Sie sich mit dem Lichtabsorptionsmuster verschiedener Stufen vertraut, wie in Abbildung 2, Abbildung 5A und Abbildung S1 beschrieben, indem Sie Tubulenbündel mit feinen Zangen vorsichtig bewegen.
    HINWEIS: Die Stadien folgen einander immer in einer logischen Reihenfolge und bilden die Welle des seminiferösen Epithels. Es ist jedoch wichtig zu wissen, dass die Richtung der spermatogenen Welle gelegentlich umkehrt und dann wieder zurückkehrt (auch bekannt als Modulationen4,9), was manchmal das Verfahren erschwert. Auch die Länge der einzelnen Stufen, in Bezug auf wie viele mm Tubuli, variiert erheblich.
  4. Heben Sie den Interessent vorsichtig mit Zangen mit einer Hakenspitze an, und schneiden Sie dann ein Segment von geeigneter Länge mit einer Mikrodissektionsschere (siehe Ergänzendes Video 1). Ein Haken an der Spitze der Zange erleichtert das Heben und Halten eines Tubuli und hilft, ein Drücken zu vermeiden.
    HINWEIS: Die Länge der zu schneidenden Segmente hängt von nachgelagerten Anwendungen ab. Für die Sammlung von gepoolten Tubulenstücken eines bestimmten Stadiums für die Protein- oder RNA-Analyse12,13 (II–V, VII–VIII und IX–XI, Abbildung 5B) beträgt die Länge typischerweise 2–5 mm. Bei Verwendung der Standard-Phenol-Chlorform-Extraktion können aus 1 mm Tubuli rund 200 ng RNA abgeleitet werden. Bei der Vollmontage der Färbung von inszenierten Tubulesegmenten sollte die Länge der Segmente >5 mm betragen. Bei Squash-Präparaten sollte die Länge der Segmente 1–2 mm nicht überschreiten, da die Zellen in der Mitte des Segments möglicherweise nicht verlassen werden, wenn sie zu lang sind. Verwenden Sie eine mm-Skala unter der Petrischale für eine genaue Messung der Tubuslänge.

3. Immunostainierung verschiedener Präparate

  1. Squash-Vorbereitung: Stufenverifizierung und Immunfärbung
    HINWEIS: Bühnenspezifische Tubulenstücke können auf einem Mikroskopschlitten mit einem Deckglas zerquetscht werden, um morphologische Analysen lebender Zellen durch Phasenkontrastmikroskopie und anschließende Immunfärbung durchzuführen. Ein Anfänger wird empfohlen, diesen Ansatz zu verwenden, um die Stadien zu überprüfen, wenn er mit der transilluminationsunterstützten Mikrodissektionsmethode vertraut wird.
    1. Sammeln Sie das Segment in einem Volumen von 10 l mit einer Pipette und bewegen Sie es auf ein Mikroskopschlitten.
    2. Squash die Tubule durch Legen eines Deckglases (20 mm x 20 mm) vorsichtig auf den Tubuli. Als Ergebnis fließen Zellen aus dem Tubuli und bilden eine Live-Zell-Monoschicht. Legen Sie ein Filterpapier auf den Rand des Deckglases, um die Ausbreitung der Zellen zu erleichtern. Vermeiden Sie es, die Zellen zu sehr zu zerquetschen, um sie am Leben zu erhalten.
    3. Überwachen Sie die Zellausbreitung unter dem Mikroskop. Verwenden Sie ein Phasenkontrastmikroskop mit 40-fachem Ziel, um die Phasenerkennung zu überprüfen, indem Sie die vorhandenen Zelltypen untersuchen (Abbildung 2, Abbildung S2).
    4. Sobald sich die Zellen zu einer runden Monoschicht von beiden Enden des Tubuli ausgebreitet haben, tauchen Sie den Schlitten in einen Behälter, der flüssigen Stickstoff enthält, während Sie ihn mit Zange halten. Halten Sie es 10 s unter Wasser. Alternativ legen Sie die Rutsche zum Einfrieren auf eine Trockeneisplatte.
    5. Entfernen Sie das Deckglas, indem Sie es mit einem Skalpell abdrehen.
    6. Fahren Sie ohne Verzögerung mit der Fixierung fort und legen Sie die Rutsche schnell in einen Behälter mit 90% Ethanol für 2–5 min.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Squash-Zubereitung nicht auftaut, bevor Sie sie auf 90% Ethanol legen. Andere Fixative können auch verwendet werden, wie Aceton, für 10 min.
    7. Lufttrocken und lagern bei Raumtemperatur (RT) (bis zu einigen Tagen) oder bei -80 °C (langfristig).
    8. Zur Immunfärbung die Proben in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 10 min bei RT nachfixieren.
    9. In PBS abspülen und mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 5 min permeabilisieren.
    10. In PBS abspülen und einen Fettring um jede Squashprobe ziehen.
    11. Fügen Sie 50–100 l von 10% BSA (Rinderserumalbumin) in 0,1% Tween in PBS (PBST) in den Fettring und Blockproben für 30 min bei RT hinzu.
    12. Entfernen Sie die BSA-Lösung und inkubieren Sie mit einem primären Antikörper, der in 10% BSA in PBST für 1 h bei RT verdünnt wird.
    13. Waschen Sie 3x für 5 min mit PBST.
    14. Inkubieren Sie mit einem sekundären Antikörper, der in 10% BSA in PBST verdünnt wird.
      HINWEIS: Um die Akrosomen zu färben, können die Proben mit Rhodamine-beschriftetem Erdnuss-Agglutinin-Antikörper (PNA, 1:1000) in 10% BSA in PBST für 1 h bei RT(Abbildung S3) anstelle spezifischer Primär- und Sekundärantikörper inkubiert werden.
    15. Waschen Sie 3x für je 5 min mit PBST, spülen Sie mit PBS und montieren Sie mit einem Mountant, das DAPI enthält.
  2. Ganzer Immunfärbung von seminiferösen Tubuli
    HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt die Vollmontagefärbung für inszenierte (ab Schritt 2.4) Tubulesegmente. Wenn ein Forscher eine vollwertige Färbung ohne Inszenierung durchführen möchte (ab Schritt 1.5), achten Sie auf Noten in 3.2.1 und 3.2.7.
    1. Mit einer Pipette die Tubulesegmente (ab Schritt 2.4) in eiskaltem PBS in ein 15 ml kegelförmiges Rohr übertragen und auf Eis sedimentieren lassen.
      HINWEIS: Wenn Sie nicht inszenierte Tubuli von 1.5. verwenden, trennen Sie die Tubuli in einer Petrischale, indem Sie mehrmals auf eine gekippte Schale pfeifen und zurückpfeifen. Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette mit einer geschnittenen Spitze. Dieser Schritt soll die Struktur des Gewebes öffnen. Vermeiden Sie jedoch zu viel Pipettierung, da es die Tubuli beschädigen könnte. Die Sedimentation von Tubuli wird einige Dutzend Sekunden dauern. Kleine Tubulenfragmente, interstitielle Zellen und Zellablagerungen bleiben im Überstand.
    2. Entfernen Sie den Überstand (SN) vorsichtig durch Pipettieren oder mit einem Aspirator. 10 ml eiskaltes PBS hinzufügen und durch Inversion mischen.
    3. Lassen Sie Sediment eimt und dann entfernen SN wie zuvor.
    4. 5 ml 4% PFA hinzufügen und für 5 h auf einem rotierenden Tisch (20–30 Umdrehungen pro Minute) bei +4 °C fixieren.
      HINWEIS: Die Fixationszeit hängt von den Proteinen von Interesse und ihrer subzellulären Lokalisierung ab. Für kern- und zytoplasmatische Proteine ist eine 2-h-Fixierung in der Regel ausreichend, jedoch Membranmarker, wie z. B. GFR1 (GDNF-Familienrezeptor alpha 1; Abbildung 6A,B), profitieren von einer längeren Fixierung, bis zu 6 h.
    5. Sedimentieren zulassen, SN (PFA) wie bisher entfernen und kurz abspülen, indem 10 ml PBS hinzugefügt und das Rohr invertieren.
    6. Sedimentieren, SN wie bisher entfernen und den PBS-Waschschritt dreimal für jeweils mindestens 10 min auf einem rotierenden Tisch bei +4 °C wiederholen und bei +4 °C färben oder lagern.
      HINWEIS: Wenn die Arbeitsbedingungen steril sind und die Proben gereinigt werden können, können sie mindestens einige Wochen gelagert und verwendet werden. Alternativ können Sie Natriumazid zu einer Endkonzentration von 0,02% (w/v) aus einer 2%igen Stofflösung hinzufügen, um die Tubuli vor der Lagerung bei +4 °C zu erhalten.
    7. Mit einer 1-ml-Pipette 10–20 feste Tubulisegmente in ein 2-ml-Rundbodenrohr verschieben. SN sedimentieren und entfernen lassen.
      HINWEIS: Wenn Sie mit langen Tubuli arbeiten, die nicht inszeniert wurden, gießen Sie die Tubuli auf eine Petrischale und schneiden Sie mit Mikrodissektionsschere und Zangen Segmente von etwa 5–20 mm. Zu lange Segmente verwickeln sich während des Färbevorgangs, während zu kurze Segmente leicht verloren gehen.
    8. Fügen Sie 1 ml von 2% BSA + 10% FBS (fetales Rinderserum) in 0,3% Triton X-100 in PBS (PBSX) hinzu. Block für mindestens 1 h auf einem rotierenden Tisch (20–30 Rpm) bei RT.
    9. Spülen Sie mit 1 ml PBSX, entfernen Sie SN durch Pipettieren und fügen Sie 250 L primären Antikörper in 1% BSA in PBSX verdünnt (1:100–1:2000 Verdünnung) hinzu. 2 h bei RT oder über Nacht bei +4 °C auf einem rotierenden Tisch (20–30 Rpm) inkubieren.
    10. Entfernen Sie die Antikörperlösung durch Pipettieren und spülen Sie die Tubuli mit 1 ml PBSX wie oben beschrieben. Dreimal für 1 h in PBSX auf einem rotierenden Tisch (20–30 Umdrehungen pro Minute) bei RT waschen.
      HINWEIS: Nach diesem ersten Waschen kann die Probe bei Bedarf bei +4 °C über Nacht gelassen werden.
    11. Entfernen Sie SN, und fügen Sie 250 L sekundären Antikörpers hinzu, der in 1% BSA in PBSX verdünnt wird (typischerweise 1:500 Verdünnung eines fluoreszierenden Antikörpers). In Folie abdecken und auf einem rotierenden Tisch (20–30 Umdrehungen pro Minute) bei RT für 1 h inkubieren.
    12. Wiederholen Sie 3.2.10.
    13. Entfernen Sie schließlich SN und gießen Sie die Tubuli auf ein Mikroskopschlitten. Mit Gel-Ladespitzen können Sie Tubuli in Linearstreifen sanft trennen und anordnen. Überschüssigen Puffer abtropfen lassen und Montagemedium und Einen Deckelschlupf hinzufügen.
      HINWEIS: Vermeiden Sie das Trocknen der Tubuli, während Sie sie arrangieren. Eine Gegenfärbung der Kerne mit DAPI ist in den meisten Fällen nicht notwendig. Versiegeln Sie die Kante des Deckels mit Nagellack, um Probentrocknung und Verschlechterung zu verhindern. Dias können vor der Bildgebung 1–2 Wochen lang bei +4 °C gelagert werden.

Ergebnisse

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Eine erfolgreiche transilluminationsunterstützte Inszenierung und Mikrodissektion von Mausseminiferous Tubuli hängt in erster Linie davon ab, die richtigen Lichtverhältnisse und ein geeignetes Seziermikroskop zu finden und spezifische Merkmale zu erkennen, die jede Stufe charakterisieren. Die Stufen VII-VIII erscheinen homogen dunkel, da sie eine hohe Anzahl vollständig kondensierter, dehnungsseitig liegender Spermaatien enthalten, die an der apikalen Oberfläche des Epithels ausgerichtet sind (Abbildung 5A und Abbildung S1). Nachdem reife Spermatozoen in das Lumen in der Spermien freigesetzt werden, erscheint der Tubuli in den Stadien IX–XI aufgrund des Fehlens von kondensierten länglichen Spermaatiden im Epithel sehr blass. Das einfachste Merkmal, das man an transbeleuchteten Tubuli identifizieren kann, ist der Punkt der Spermien (Sternchen in Abbildung 5A und Abbildung S1), d. h. der plötzliche Übergang von der dunklen Zone (VII–VIII) zur blassen Zone (IX–XI). Auf die blasse Zone folgt die Schwachpunktzone (XII–I). Das fleckige Aussehen stammt aus der Organisation von länder Spermaatiden mit kondensiertem Chromatin in Bündeln. Die Bündel werden in der folgenden starken Punktzone (II–V) sehr prominent. Darüber hinaus wandern Spermatienbündel in Richtung Sertoli-Zellkerne, die sich in der Nähe der Basallamina befinden, die bei Transbeleuchtung als gestreiftes Erscheinungsbild von Stufe II–V-Tubule reflektiert wird (Abbildung 2, Abbildung 5A,B und Abbildung S1). Bündel zerstreuen sich schließlich in Stufe VI und kondensierende lästende Spermaatiden bewegen sich in der Nähe des Lumens, um in Stadium VIII aus dem Epithel freigesetzt zu werden.

Die genaue Phase des Tubulisegments kann durch Phasenkontrastmikroskopie von Squashpräparaten genau überprüft werden (Abbildung 2 und Abbildung S2). Die spezifischen Stadien der Squash-Präparate werden auf der Grundlage der akrosomalen Entwicklung von Schritt 1-8 runden Spermatien, dem Status der Chromatinkondensation in länden Spermaatiden und dem Vorhandensein von Spermabündeln16 (Abbildung 3 und Abbildung S2) anerkannt. Darüber hinaus kann das Vorhandensein früherer Zelltypen, wie Typ-B-Spermatogonie natogonie und Leptotene oder Zygoten-Spermatozyten, die anhand ihrer morphologischen Merkmale erkannt werden können, zur Unterstützung der Stadiumerkennung verwendet werden. Die Größe von Pachyten-Spermatozytenkernen nimmt in der Phase VI zu, was auch zusätzliche Hilfe bei der Inszenierung bieten kann.

Inszenierte Squashpräparate können verwendet werden, um die Expression und Lokalisierung von Proteinen von Interesse im seminiferen Epithel mittels Immunostainierung zu untersuchen. Dies ermöglicht eine sehr genaue Analyse der zelltypspezifischen Expression aufgrund der genau definierten Zellzusammensetzung in jeder Phase. Die bühnenspezifische Expression kann durch die Ko-Färbung des Akrosomen(z.B.mit PNA) weiter verstärkt werden, was die Visualisierung unterschiedlicher Schritte der runden Spermiendifferenzierung ermöglicht. Repräsentative Bilder von PNA-gefärbten Akrosomen in verschiedenen Stadien sind in Abbildung S3dargestellt. Die akrosomale Färbung kann auch verwendet werden, um die Bühne nachträglich zu definieren. Die transilluminationsunterstützte Inszenierung ist jedoch eine wesentlich einfachere und schnellere Methode, um die gewünschte Bühne zu finden, als uninszenierte Fragmente planlos zu verwenden.

Seminiferous tubbule Vollkornfärbung wird in der Regel verwendet, um die Zelltypen zu untersuchen, die in Kontakt mit der Kellermembran des seminiferösen Epithels sind, entweder auf der röhrenförmigen Seite (Spermatogonie, Preleptotene Spermatozyten und Sertoli-Zellen; Abbildung 6A,B) oder die interstitielle Seite (peritubuläre myoide Zellen und peritubuläre Makrophagen; Abbildung 6C und Abbildung S4A)24. Die Methode kann jedoch auch verwendet werden, um Zellen oder Strukturen zu untersuchen, die sich tiefer im Epithel befinden, wie die Bluttestis-Barriere (Espin, Abbildung S4B) oder postmeiotische Keimzellen (Akrosomenmarker PNA, Abbildung S4C). Bei Verwendung nicht inszenierter Tubulensegmente ist es möglich, ein bestimmtes Stadium rückwirkend mit einem Antikörper gegen ein Protein abzuschätzen, das in differenzierender Spermatogonie (A1, A2, A3, A4, In und B; zusammen Adiff) exprimiert wird (Abbildung 2). Die Inszenierung stützt sich dann auf die Dichte der synzytialen Adiff, die sechs mitotische Teilungen in einer stufenabhängigen Weise während des ersten Zyklus der spermatogenen Differenzierung1durchlaufen, daher verdoppelt die Anzahl der Adiff Spermatogonie in Synzytia nach jeder Division1,25. Die retrospektive Inszenierung ist jedoch weniger genau als die transilluminationsunterstützte Inszenierung, da es keine spezifischen Marker für verschiedene Generationen von Adiff gibt und die Bewertung derA-Diff-Dichte möglicherweise fehleranfällig ist.

Maus-Spermatogenese-Diagramm mit den Zellstadien I-XII; Prozess der Samenzellentwicklung.
Abbildung 1: Seminiferous epitheliale Zykluskarte für die Inszenierung der Maus-Spermatogenese. Vertikale Säulen zeigen Zellassoziationen in verschiedenen Stadien des seminiferen Epithelzyklus (markiert mit römischen Ziffern I–XII). Die unreifsten Keimzellen befinden sich am unteren Rand, während die am differenziertesten an der Spitze liegen. Um den Fortschritt der Keimzelldifferenzierung zu verfolgen, muss man sich von links nach rechts und von unten nach oben bewegen. Ein Zyklus des seminiferen Epithels ist eine vollständige Reihe von Stadien, die einander in numerischer Reihenfolge folgen. Eineund, undifferenzierte Spermatogonie; A1–4, Typ A1–A4 Spermatogonie; In, Intermediär-Spermatogonie; B, Typ B Spermatogonie; Pl, preleptotene spermatozyten; L, leptotene Spermatozyten; Z, zygoten Spermatozyten; P, pachytene spermatozyten; D, Diploten-Spermatozyten; 2°, sekundäre Spermatozyten plus meiotische Teilungen. Arabische Ziffern 1-16 beziehen sich auf Schritte der postmeiotischen Spermatienreifung (Spermiogenese). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Schematische Darstellung der Spermatogenese; Ergebnisse der Mikroskopie; Phasen IX-XI; Analyse über Squash, Querschnitt.
Abbildung 2: Zellassoziationen in Stadien des seminiferen Epithelzyklus der Maus. Stadien des seminiferen Epithelzyklus folgen einander in logischer Reihenfolge und bilden so die spermatogene Welle entlang der Längsachse eines seminiferösen Tubulis. Das obere Panel zeigt die Keimzellassoziationen in verschiedenen Stadien und die Position der Zelltypen innerhalb der zytoplasmatischen Taschen von Sertoli-Zellen (hellgrau) im Seminiferepithel. Die Abbildung des seminiferous tubbule visualisiert die spermaatogene Welle und spezifische Transilluminationsmuster der blassen, schwachen Stelle, starken Fleck und dunkle Zonen. Aus jeder angegebenen Phase werden repräsentative lebende Zellphasenkontrastbilder von Squashpräparaten und periodischen Säure-Schiff-gefärbten Hodenquerschnitten gezeigt. Unter den unteren beiden Tafeln zeigen Segmente der seminiferous tubulie nach Transillumination (oben) oder Färbung mit Antikörpern (unten) gegen SALL4 (rot, ein pan-spermatogonialMarker) und DNMT3A (grün, ein Adiff Marker). Die Transilluminationsmuster für die Stufen IX-XI, XII und VI werden mit geschachtelten Bereichen hervorgehoben. Sowohl das Lichtabsorptionsmuster (oben) als auch die Dichte der DNMT3A-positiven Differenzierungs-Spermatogonie (unten) können verwendet werden, um das (ungefähre) Stadium des Seminiferzyklus zu definieren. Aufeinanderfolgende Generationen von Adiff werden als Typ A1–A4, Zwischen-(In) und Typ-B-Spermatogonie bezeichnet. Die Aufteilung der einzelnen Ergebnisse führt zu einer Verdoppelung der Spermatogonialzelldichte. Die höchste Zelldichte auf der Kellermembran des seminiferösen Epithels wird in den Stadien VI–VIII beobachtet, wenn meiotische präleptotene Spermatozyten (Pl) beobachtet werden. Skalenstäbe: Squash-Vorbereitung. 10 m, andere 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diagramm der Spermatidenentwicklung, Stadien I-XVI, akrosomale und nukleäre Veränderungen mit Schrittdetails.
Abbildung 3: Schritte der Spermiogenese. Unterscheidungsmerkmale von Spermatoren bei verschiedenen Schritten der Spermiogenese. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diagramm zur Vorbereitung des Hodens der Maus für die RNA-/Proteomik-Analyse; Färbeprozess für Objektträger.
Abbildung 4: Workflow dieser Studie. Transilluminationsmuster wurde bei einer Erwachsenenmaus (>8 Wochen alt) vollständig etabliert. Opfern Sie die Maus und fahren Sie mit Testis-Sektion und Entkapselung ohne Verzögerung fort. Ziehen Sie die Tubuli vorsichtig auf einer Petrischale auseinander. Befestigen Sie Tubuli für Vollmontagefärbungen oder fahren Sie mit der Transillumination fort. Unter Transillumination 1) geschnittene kurze Tubulesegmente bestimmter Stufen für Squashpräparate (Qualitätskontrolle oder Immunfärbung) oder 2) schneiden längere Segmente, um Stufenpools für RNA- und Proteomikanalysen, Gewebekultur oder für Vollfärbungen zu sammeln. Übertragen Sie kurze Tubulesegmente auf ein Mikroskopschlitten in 10 L PbS-Volumen. Platzieren Sie einen Abdeckungsbeleg auf dem Segment, um die Zellen zu erzwingen und eine Live-Zell-Monolayer zu bilden. Beobachten Sie die Zelltypen unter dem Mikroskop, dann fixieren und färben. WMS, Vollmontagefärbung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diagramm der segmentierten Wurmanatomie; schwache, starke Stellen; Helle, dunkle Zonen, die in Abschnitten beschriftet sind.
Abbildung 5: Seminiferous tubuli e einer erwachsenen Maus, wie unter Transilluminationsmikroskopie zu sehen. (A) Ein langes Segment seminiferöser Tubuli, wie sie unter der Transillumination zu sehen sind und die Welle des seminiferösen Epithels zeigen. Vier verschiedene Zonen können anhand der Chromatinverdichtung in Spermatien und ihrer Lokalisierung innerhalb des Epithels identifiziert werden: dunkle Zone (Stufen VII–VIII), Blasszone (Stufen IX-XI), Schwachpunktzone (Stufen XII–I) und starke Punktzone (Stufen II–VI). Sternchen, Spermienpunkt. Pfeile zeigen zwei kurze Segmente innerhalb der Schwachpunktzone an, die aufgrund der mechanischen Beanspruchung des Tubulis ein blasses Aussehen haben. Maßstabsleiste: 500 m. Einschnitte 1–5 sind höhere Vergrößerungen aus ausgewählten Tubulesegmenten. (B) Gepoolte Segmente seminiferöser Tubuli, die die Stufen II–V (starke Punktzone), VII–VIII (dunkle Zone) und IX–XI (helle Zone) darstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Immunfluoreszenzmikroskopie mit Expression von GFRa1, SALL4, DNMT3B, USF1, SOX9, F4/80, DNA, MHCII.
Abbildung 6: Ganzwertige Immunfärbungen mit Spermatogonien, Sertoli-Zellen und peritubären Makrophagenmarkern. (A) Vollmontagefärbung für ein Segment, das Stufe XI–II darstellt, mit Antikörpern gegen GFR1 (rot), SALL4 (grün) und DNMT3B (blau). Die Färbung zeigt drei verschiedene Populationen von Spermatogonien: singly-isolated (As) oder gepaart (Apr) undifferenzierte Stammspermatogonie (GFR-1+/SALL4+/DNMT3B-; weiß gepunktete Bereiche), kurze synzytial (hier 4 ausgerichtete Zellen; Aal4) Vorläuferspermatogonie (GFR-1-/SALL4+/DNMT3B-; gelb gepunktete Bereiche) und differenzierende Spermatogonie (GFR-1-/SALL4+/DNMT3B+). SALL4+/DNMT3B+ Zellen sind Typ A3–A4 Spermatogonie. (B) Vollmonton-Seminifer-Tubule-Färbung mit Antikörpern gegen GFR1 (rot), USF1 (grün) und SOX9 (blau). GFR-1 färbt die Stammuntermenge der Spermatogonie. USF1 wird sowohl durch Spermatogonie als auch durch SOX9+ Sertoli-Zellen exprimiert. (C) Peritubuläre Makrophagen bei erwachsenen Mäusen sind sowohl für F4/80 (rot) als auch für MHCII (blau) positiv. DAPI färbt DNA (grün). Helle große Kerne sind peritubuläre myoide Zellkerne. Skalenbalken: 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung S1: Ein langes Segment von seminiferous tubulie, wie unter Transillumination gesehen, die die Welle des seminiferen Epithels zeigt. Vier verschiedene Zonen können anhand der Chromatinverdichtung in Spermatien und ihrer Lokalisierung innerhalb des Epithels identifiziert werden: Schwachpunktzone (Stufen XII–I), starke Punktzone (Stufen II–VI), Dunkle Zone (Stufen VII–VIII) und blasse Zone (Stufen IX–XI). Spermiationspunkt (Sternchen) kann erkannt werden, da die dunkle Zone abrupt in die blasse Zone übergeht. Maßstabsleiste: 500 m. Einschnitte 1–4 sind höhere Vergrößerungen aus ausgewählten Tubulesegmenten. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Abbildung S2: Phasenkontrastmikroskopie von Lebenzellmonolayern verschiedener Stadien des seminiferen Epithelzyklus. (A) Stufe I. Schritt 1 Runde Spermien fehlt noch die akrosomale Struktur. Sie zeichnen sich durch einen kleinen runden Kern (rote Kreise) mit einem markanten Einzelchromocenter (weiße Pfeile) aus. Der chromatoide Körper ist im Zytoplasma als dunkles Granulat in engem Kontakt mit der Kernmembran (blaue Pfeile) sichtbar. Sertoli-Zellkern (weißer Kreis) enthält drei dunkle Brennpunkte: einen großen Nukleolus mit zwei Satellitenchromozentren. Sertoli-Zellen sind in Squashpräparaten nicht selten zu sehen, fließen aber gelegentlich zusammen mit Keimzellen aus dem Tubuli. (B) Stufe II–IV. In Schritt 4 runde Spermataden (rote Kreise) erscheint die akrosomale Struktur (rote Pfeile) als weißes, leicht abgeflachtes Vesikel, das an der Kernhülle befestigt ist. Längliche Spermatoren bilden Bündel und haben bereits ein dickes Flagellum (weiße Pfeile), das auf das Vorhandensein von mitochondrialen Mantel im Mittelteil des Spermienschwanzes hinweist. Die Kerne von Pachyten-Spermatozyten (PSpc) sind etwa doppelt so groß wie die von runden Spermatoren und zeichnen sich durch dunkle Chromatin-Regionen aus, die im gesamten Kern verteilt sind. (C) Stufe V–VI. In Schritt 5-6 runde Spermataden (roter Kreis) wird das Akrosom weiter abgeflacht und breitet sich über den Kern (rote Pfeile) aus. Der Bereich der Kernhülle, die dem Akrosom zugewandt ist, erscheint aufgrund des Vorhandenseins des Akrolaxoms, einer proteinreichen Platte zwischen der akrosomalen Membran und der Kernmembran, dunkel. Länder Spermaatien werden aus Bündeln (weiße Pfeile) freigesetzt. Pachytene Spermatozyten (PSpc) werden häufig im Epithel beobachtet. (D) Stufe VII-VIII. Das Akrosom (rote Pfeile), ein dunkles Futter auf der Kernhülle mit weißen Schatten, ist vollständig verlängert und bedeckt fast die gesamte apikale Seite von Schritt 7-8 runde Sperma (rote Kreise). Dieses Stadium ist durch reife Spermatoren (weiße Pfeile) gekennzeichnet, die an vielen Teilen der Squash-Vorbereitung reichlich vorhanden sein können. Der Kern der Pachyten-Spermatozyten (PSpc) wächst während der Entwicklung und erscheint im Stadium VII–VIII größer als in früheren Stadien. Die dunklen Chromatinbereiche im Kern von Pachyten-Spermatozyten (PSpc) erscheinen aufgrund hoher Transkriptionsaktivität und meiotischer Ereignisse unscharf. (E) Stufe X. Schritt 10 Spermakerne (weiße Pfeile) haben eine Dehnung eingeleitet, aber das Chromatin hat sich noch nicht verdichtet. Akrosomen beginnen, einen Haken an der Kernspitze zu bilden (roter Pfeil). Die Kerne von Pachyten-Spermatozyten (PSpc) erscheinen sehr groß, da sie sich auf meiotische Teilungen vorbereiten. (F) Stufe XII. Stufe XII ist durch das Vorhandensein von meiotischen Metaphasenplatten (weiße gestrichelte Kreise) gekennzeichnet. Kleine runde Zellen mit typischem kondensiertem Chromatinmuster sind zygoten Spermatozyten (ZSpc), in denen sich die Schwesterchromosomen ausrichten, um eine synaptonemale komplexe Bildung zu initiieren. Skalenbalken: 10 m. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Abbildung S3: Identifizierung des Stadiums des seminiferen Epithelzyklus auf der Grundlage akrosomaler und nuklearer Färbung. Acetonfixierte Squashpräparate wurden mit Rhodamine-konjugierten PNA und DAPI gefärbt. Stufe I: Während in Schritt 1 kein Akrosom existiert, kann ein voll entwickeltes Akrosom in länglichen Spermaatiden nachgewiesen werden. Stadien II–IV: Die akrosomale Entwicklung beginnt mit dem Auftreten von proakrosomalen/akrosomalen Granulaten in runden Spermataden. Das akrosomale Vesikel auf der Kernoberfläche erscheint rund bis Schritt 3 Spermien, und flacht dann in Schritt 4 Spermatade. Stufe V: Der durch das Akrosom untergeordnete Winkel erstreckt sich von 40 Grad bis maximal 95°. Stufen VI–VII: Der durch das Akrosom untergeordnete Winkel erstreckt sich von 95 Grad bis 120 Grad. Stadien VIII-IX: Das Akrosom wird in Schritt 8 Spermataden (Stufe VIII) vollständig verlängert, und Kerne polarisieren auf der apikalen Seite der Zelle und stellen Kontakt mit der Plasmamembran her (nicht gezeigt). Ab Stufe IX verformt sich der Spermakern; dorsale und ventrale Oberflächen werden zuerst gesehen. Stufen X-XI: Spermatien zeigen den Dorsalwinkel. Stufe XII: Diese Stufe zeichnet sich am besten durch das Auftreten meiotischer Divisionen aus; Metaphasenplatten sind mit weißen Pfeilen gekennzeichnet. Auch längliche Spermaatien mit ihren Akrosomen sind zu sehen. Skalenbalken: 10 m. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Abbildung S4: Vollwertfärbung für unkonventionelle Marker. (A) Alpha glatter Muskelaktin (aSMA) wird durch peritubuläre Myoidzellen exprimiert. (B) Espin lokalisiert enge Verbindungen der Sertoli-Zelle und trägt zur Bluttestis-Barriere bei. (C) PNA lokalisiert zu Akrosomen von Spermaiden. Skalenbalken: 50 m. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzendes Video 1: Schneiden eines kurzen Abschnitts seminiferous tubulie für Stufe VII-VIII. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Diskussion

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Die oben beschriebene transilluminationsunterstützte Mikrodissektionsmethode ermöglicht einen stufenorientierten Ansatz zur Untersuchung der Spermatogenese. Die Spermatogenese ist ein hochsynchronisierter Prozess, und alle wichtigen Schritte während der spermatogenen Differenzierung werden stufenabhängig reguliert und ausgeführt, wie Z.B. Differenzierungsverpflichtung (in den Stadien VII-VIII), Beginn der Meiose (VII-VIII), meiotische Teilungen (XII), Beginn der Spermadehnung (VIII) und Spermiation (VIII)1,26,27. Die phasenorientierte Analyse bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um diese besonderen Ereignisse zu untersuchen, die auf bestimmte Schritte der Spermatogenese beschränkt sind und daher nur in definierten Stadien des seminiferen Epithelzyklus gefunden werden. Die Beherrschung der Methode erfordert einige Praxis und die Verwendung eines hochwertigen Seziermikroskops und richtige Beleuchtungsbedingungen sind der Schlüssel zum Erfolg. Die Implementierung dieser Methode als Teil des täglichen Toolkits hat die Fähigkeit, die Wirkung und biologische Relevanz der Forschung über männliche Fortpflanzungsfunktionen erheblich zu verbessern, indem eine genauere Zerlegung molekularer Ereignisse während der Spermatogenese ermöglicht wird.

Alle von uns untersuchten WT-Mausstämme zeigen ein ähnliches Transilluminationsmuster und zeigen konservierte Zellassoziationen in Stadien des seminiferen Epithelzyklus. Unter der Voraussetzung, dass sich die spermiogene Differenzierung von Keimzellen nicht wesentlich von WT-Mäusen unterscheidet, gilt das gleiche auch für alle von uns untersuchten Knock-out-Mausmodelle. Darüber hinaus kann es auf andere Arten angewendet werden, die längsförmige segmentale Anordnung von Stadien des seminiferen Epithelzyklus7aufweisen. Arten mit nicht-segmentalen Stadien (z. B. menschliche Stadien) können jedoch nicht verwendet werden. Angesichts der wesentlichen Rolle der Chromatinkondensation bei der Festlegung des Transilluminationsmusters bei der Definition des Transilluminationsmusters ist klar, dass jede Fehlregulation dieses Prozesses unweigerlich die Umsetzung dieser Methode beeinträchtigen wird. Bei jugendlichen Mäusen und jungen Erwachsenen (5-6 Wochen) ist das Transilluminationsmuster noch nicht vollständig etabliert, daher sollten nur Mäuse verwendet werden, die älter als 8 Wochen sind. Es ist auch wichtig zu bedenken, dass das Drücken und Ziehen der Tubuli unweigerlich auf das Transilluminationsmuster einwirkt, da es die zelluläre Architektur innerhalb des seminiferen Epithels verzerrt.

Die isolierten seminiferen Tubulensegmente können auch kultiviert werden, was die Ex-vivo-Beobachtung und Manipulation von Spermatogenese-gekoppelten Prozessen, einschließlich Meiose, ermöglicht. Um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu gewährleisten und den Abbau von RNA und Protein zu verhindern, sollten die Proben nicht mehr als 2 Stunden nach dem Opfern der Maus gesammelt und verarbeitet werden. Für ex vivo Kultur der seminiferous tubulies, sollte die Zeit vom Opfer bis zum Beginn der Kultur nicht mehr als 1 Stunde. Die Integrität von Tubule-Fragmenten kann in der Regel bis zu 72 Stunden in vitro aufrechterhalten werden, wenn sie richtig geerntet werden.

Das Stadium des seminiferen Epithelzyklus kann mit einer Phasenkontrastmikroskopie von Squashpräparaten16überprüft und noch genauer definiert werden. Die Mikroskopie wird an lebenden Zellen durchgeführt, was eine zusätzliche Dimension in die Analyse einführt und die Beobachtung von Organellen- oder Zellbewegungen in bestimmten Stadien der Spermatogenese28,29,30ermöglicht. Die Phasenkontrastmikroskopie liefert eine exakte Inszenierung für die nachfolgende Immunfärbung, die eine sehr detaillierte Analyse der Proteinexpression und Lokalisierungsdynamik während der Spermatogenese ermöglicht, einschließlich stufenspezifischer Veränderungen.

Während Zellen in Squashpräparaten aus dem epitheliaalen Kontext freigesetzt werden, ermöglichen ganzmontierte Immunostainierungen von Tubulisegmenten die Untersuchung von spermaatogenen Zellen in ihrer physiologischen Umgebung. Daher können Vollmontagepräparate eine bessere Visualisierung der seminiferous tubbule Architektur und ihrer interzellulären Kontakte bieten als die Immunfärbung auf Querschnitten. Wichtig ist, dass die transilluminationsunterstützte Inszenierung der Tubulesegmente vor der Immunfärbung den Ansatz noch stärker macht, indem Informationen über die spezifische Stufe eines bestimmten Segments eingebunden werden. Die Vollfärbung ist ein besonders nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Zellen an der Peripherie seminiferöser Tubuli, wie peritubululare Myoidzellen, peribuläre Makrophagen und Spermatogonie, könnte aber auch neue Erkenntnisse in der Forschung an meiotischen und postmetiotischen Keimzellen eröffnen.

Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Akademie Finnlands [315948, 314387 bis N.K.] unterstützt; Sigrid Jusélius Stiftung [nach N.K., J.T.]; Emil Aaltonen Foundation [to J.-A.M., T.L.]; Turku Doktoratsstudium molekulare Medizin [S.C.-M., O.O.].

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Rinderserumalbumin (BSA)SigmaA9647
Deckglas 20x20 mmMenzel Glä ser11961988
Falcon konisches Röhrchen 15 mlSarstedt62.554.502
fötales Rinderserum (FBS)BiowestS1810
Fettstift (ImmEdge)Vector LaboratoriesH-4000
Objektträger Superfrost PlusThermo Scientific22-037-246
Parafolmaldehyd (PFA)Elektronenmikroskopie Sciences15714
Petrischale (100 mm)Greiner664160
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco11503387
ProLong Diamond Antifade EindeckmittelThermo FisherP36962
Rhodamin markiertes Erdnussagglutinin (PNA)Vector LaboratoriesRL-1072
Triton X-100Sigma93443
Tween-20SigmaP2287
mit

Referenzen

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