Verwendung computerbasierter Bildanalyse zur Verbesserung der Quantifizierung von Lungenmetastasen im 4T1-Brustkrebsmodell

Summary

Wir beschreiben eine konsistentere und beschleunigte Methode zur Quantifizierung von Lungenmetastasen im 4T1-Brustkrebsmodell mit Fidschi-ImageJ.

Abstract

Brustkrebs ist eine verheerende Bösartigkeit, die allein im Jahr 2019 40.000 Todesfälle bei Frauen und 30 % der neuen Krebsdiagnosen bei Frauen in den Vereinigten Staaten ausmacht. Die Hauptursache für Todesfälle im Zusammenhang mit Brustkrebs ist die metastasierende Belastung. Daher müssen präklinische Modelle für Brustkrebs die metastasierende Belastung analysieren, um klinisch relevant zu sein. Das 4T1-Brustkrebsmodell bietet ein spontan metastasierendes, quantifizierbares Mausmodell für menschlichen Brustkrebs im Stadium IV. Die meisten 4T1-Protokolle quantifizieren jedoch die metastasierende Belastung, indem sie gefärbte Kolonien manuell auf Gewebekulturplatten zählen. Während dies für Gewebe mit geringerer metastasierender Belastung ausreicht, führt menschliches Versagen bei der manuellen Zählung zu inkonsistenten und variablen Ergebnissen, wenn Platten konfluent und schwer zu zählen sind. Diese Methode bietet eine computerbasierte Lösung für menschliche Zählfehler. Hier evaluieren wir das Protokoll mit der Lunge, einem hochmetastasierenden Gewebe im 4T1-Modell. Bilder von Methylenblau-gefärbten Platten werden in Fidschi-ImageJ zur Analyse aufgenommen und hochgeladen. Fiji-ImageJ bestimmt dann den Prozentsatz des ausgewählten Bildes, der blau ist, und stellt den Prozentsatz der Platte mit metastasierender Belastung dar. Dieser computergestützte Ansatz bietet konsistentere und schnellere Ergebnisse als manuelle Zählung oder histopathologische Auswertung für hochmetastasierte Gewebe. Die Konsistenz der Fidschi-ImageJ-Ergebnisse hängt von der Qualität des Bildes ab. Es können leichte Abweichungen in den Ergebnissen zwischen den Bildern auftreten, daher wird empfohlen, dass mehrere Bilder aufgenommen und die Ergebnisse gemittelt werden. Trotz ihrer minimalen Einschränkungen ist diese Methode eine Verbesserung der Quantifizierung der metastasierenden Belastung in der Lunge, indem sie konsistente und schnelle Ergebnisse bietet.

Introduction

Eine von acht Frauen wird in ihrem Leben an Brustkrebs diagnostiziert werden, und trotz mehrerer Behandlungsmöglichkeiten ist Brustkrebs die zweithäufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle bei amerikanischen Frauen¹. Diese Frauen sterben nicht an dem primären Tumor in ihrer Brust. Stattdessen ist die metastasierende Last für die Sterblichkeit dieser Krankheit verantwortlich, da sie sich häufig auf die Lungen-, Knochen-, Gehirn-, Leber- und Lymphknoten ausbreitet². Aus diesem Grund müssen Brustkrebsmodelle Metastasen bewerten, um zur Eindämmung der Sterblichkeit dieser Krankheit beizutragen. Das 4T1 murinen Brustkrebs....

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Virginia Tech und in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals genehmigt. Die Durchführung dieses Protokolls erfordert die Genehmigung der zuständigen Institutionen und die Einhaltung aller geeigneten Richtlinien.

1. Zellkultur

1. Machen Sie komplette Kulturmedien (RPMI + 10% Fetal Bovine Serum +1% Pen Strep). 4T1-Zellen gemäß ATCC-Protokoll¹⁰ beleben und bei 37 °C und 5%_CO2 in einem T-25-Kolben bis zum Einfluss inkubieren. Ändern Sie die Me....

Results

Diese Methode enthält einfache Anpassungen aus dem Pulaski und Ostrand-Rosenberg 4T1 Protokoll³ und kann in Abbildung 1visualisiert werden. Wenn 3 separate Forscher metastasierende Kolonien manuell für 12 Lungenplatten zählten (1:10 Verdünnung), waren die Ergebnisse zwischen verschiedenen Zählern sehr inkonsistent (Abbildung 2A). Alle Forscher wurden angewiesen, "die metastasierenden Kolonien zu zählen, die als blaue Punkte erscheinen", a.......

Discussion

Wie gezeigt, kann das manuelle Zählen der metastasierenden Kolonien auf jeder Lungenplatte eine ungenaue und ungenaue Methode zur Quantifizierung von Lungenmetastasen sein, was die Notwendigkeit einer besseren Quantifizierung simoniert (Abbildung 2). Die histopathologische Analyse unterschied sich sowohl von der manuellen Zählung als auch von der Fidschi-ImageJ-Analyse(Abbildung 2B und 4D), wahrscheinlich, weil die H&E-Folien keine repräsentativ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anästhesiekammer	Siehe Kommentare	Siehe Kommentare	Verwenden Sie zugelassene Materialien in den Richtlinien Ihrer Einrichtung
Anästhetikum	Siehe Kommentare	Siehe Kommentare	Verwenden Sie zugelassene Materialien in den Richtlinien Ihrer Einrichtung
BALB/c Weibliche Mäuse	The Jackson Laboratory	000651
Blunt Schere	Roboz	RS-6700
Taschenrechner	Beliebig	Beliebige
Kamera	Beliebig		Mindestens 8 Megapixel
Zentrifugieren	Beliebig	Beliebig	der Lage sein, 125 x g und 300 x g
CO2-Euthanasie-Einrichtung	zu erfüllen Siehe Kommentare Siehe	Kommentare	Verwenden Sie zugelassene Materialien in den Richtlinien Ihrer Institution
Kühlraum, Kühlschrank, Kühlhaus	Beliebig Beliebig
Computer mit Fiji-ImageJ	Beliebig		der Lage sein, zu laufen Fiji-ImageJ
Zählkammer	Fisher Scientific	02-671-10
Gebogene Schere	Roboz	RS-5859
Destilliertes Wasser	Beliebig	Elastase
	MP Biomedicals	100617
Elektronische Waage	Beliebig	Beliebig Beliebig
Fötales Rinderserum (FBS)	R& D Systems	S11150
Pinzette	Roboz	RS-8100
Ice	N/A	N/A
Inkubator	Siehe Kommentare	Siehe Kommentare Muss	in der Lage sein, 5% CO2 und 37 &/de; C
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Methylenblau	Sigma-Aldrich	03978-250ML
Penicillin Streptomycin	ATCC	30-2300
Stecknadeln oder Nadeln	Beliebig		Zum Festhalten von Mäusen während der Autopsie
Kunststoff-Messschieber	VWR	25729-670
RMPI-1640 Medium	ATCC	30-2001
Wippe oder rotierendes Rad	Beliebig
Scharfe Schere	Roboz	RS-6702
Steriler Einwegfilter mit PES-Membran	ThermoFisher Scientific	568-0010
T-150 Kolben	Fisher Scientific	08-772-48
T-25 Kolben	Fisher Scientific	10-126-10
T-75 Kolben	Fisher Scientific	13-680-65
Dreieckiges Kunststoffbecherglas	Fisher Scientific	14-955-111F	Zum Wiegen von Mäusen
Trypanblau	VWR	97063-702
Trypsin-EDTA	ATCC	30-2101
Kollagenase Typ IV	Sigma-Aldrich	C5138
3,5 cm Gewebekulturplatten	Nunclon	153066
1 mL Spritze	BD	309659
1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen	VWR	87003-294
10 cm Gewebekulturplatten	Fisher Scientific	08-772-22
12 Well Platte	Corning	3512
15 mL Zentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	14-959-70C
1X Dulbecco's Phostphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS)	Fisher Scientific	SH30028FS
1x Hank' s Ausgewogene Kochsalzlösung (HBSS)	Thermo Scientific	SH3026802
27 g 1/2 Zoll Nadeln	Fisher Scientific	14-826-48
4T1 (ATCC® CRL&schüchtern; 2539&Handel;)	ATCC	CRL-2539
50 mL Zentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	14-959-49A
6-Thioguanin	Sigma-Aldrich	A4882
70 μ M Cell Sieb	Fisher Scientific	22-363-548
70% Ethanol	Sigma Aldrich	E7023	Auf 70% mit DI-Wasser verdünnen