Wir beschreiben eine konsistentere und beschleunigte Methode zur Quantifizierung von Lungenmetastasen im 4T1-Brustkrebsmodell mit Fidschi-ImageJ.
Brustkrebs ist eine verheerende Bösartigkeit, die allein im Jahr 2019 40.000 Todesfälle bei Frauen und 30 % der neuen Krebsdiagnosen bei Frauen in den Vereinigten Staaten ausmacht. Die Hauptursache für Todesfälle im Zusammenhang mit Brustkrebs ist die metastasierende Belastung. Daher müssen präklinische Modelle für Brustkrebs die metastasierende Belastung analysieren, um klinisch relevant zu sein. Das 4T1-Brustkrebsmodell bietet ein spontan metastasierendes, quantifizierbares Mausmodell für menschlichen Brustkrebs im Stadium IV. Die meisten 4T1-Protokolle quantifizieren jedoch die metastasierende Belastung, indem sie gefärbte Kolonien manuell auf Gewebekulturplatten zählen. Während dies für Gewebe mit geringerer metastasierender Belastung ausreicht, führt menschliches Versagen bei der manuellen Zählung zu inkonsistenten und variablen Ergebnissen, wenn Platten konfluent und schwer zu zählen sind. Diese Methode bietet eine computerbasierte Lösung für menschliche Zählfehler. Hier evaluieren wir das Protokoll mit der Lunge, einem hochmetastasierenden Gewebe im 4T1-Modell. Bilder von Methylenblau-gefärbten Platten werden in Fidschi-ImageJ zur Analyse aufgenommen und hochgeladen. Fiji-ImageJ bestimmt dann den Prozentsatz des ausgewählten Bildes, der blau ist, und stellt den Prozentsatz der Platte mit metastasierender Belastung dar. Dieser computergestützte Ansatz bietet konsistentere und schnellere Ergebnisse als manuelle Zählung oder histopathologische Auswertung für hochmetastasierte Gewebe. Die Konsistenz der Fidschi-ImageJ-Ergebnisse hängt von der Qualität des Bildes ab. Es können leichte Abweichungen in den Ergebnissen zwischen den Bildern auftreten, daher wird empfohlen, dass mehrere Bilder aufgenommen und die Ergebnisse gemittelt werden. Trotz ihrer minimalen Einschränkungen ist diese Methode eine Verbesserung der Quantifizierung der metastasierenden Belastung in der Lunge, indem sie konsistente und schnelle Ergebnisse bietet.
Eine von acht Frauen wird in ihrem Leben an Brustkrebs diagnostiziert werden, und trotz mehrerer Behandlungsmöglichkeiten ist Brustkrebs die zweithäufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle bei amerikanischen Frauen1. Diese Frauen sterben nicht an dem primären Tumor in ihrer Brust. Stattdessen ist die metastasierende Last für die Sterblichkeit dieser Krankheit verantwortlich, da sie sich häufig auf die Lungen-, Knochen-, Gehirn-, Leber- und Lymphknoten ausbreitet2. Aus diesem Grund müssen Brustkrebsmodelle Metastasen bewerten, um zur Eindämmung der Sterblichkeit dieser Krankheit beizutragen. Das 4T1 murinen Brustkrebsmodell ist ein hervorragendes Protokoll, um dies zu erreichen. Die hier beschriebene Methode bietet eine Verbesserung des 4T1-Modells, indem Fidschi-ImageJ verwendet wird, um Lungenmetastasen zu quantifizieren und konsistente und schnelle Ergebnisse zu erzielen.
Das 4T1-Modell ist etabliert, wobei die meisten Labore Protokolle wie die von Pulaski und Ostrand-Rosenberg im Jahr 2001 beschriebenen verwenden3. Die 4T1-Zelllinie ist 6-Thioguanin (6TG) resistent und repräsentativ für Stadium IV, dreifach negativer Brustkrebs3,4,5. Es ist klinisch relevant, da es ein orthotopisches Modell ist und spontan zu den gleichen Organen metastasiert wie bei menschlichem Brustkrebs3,4. Die 4T1-Zellen metastasieren spontan mit einer vorhersagbaren Rate basierend auf der Menge der injizierten Zellen3,4. Wichtig ist, dass genetische Unterschiede zwischen Mäusen, die hier verwendet werden, die erwartete interindividuelle Variabilität der metastasierenden Belastung verursachten. Zur Bewertung der Metastasierung werden Gewebe geerntet, um Krebszellen an entfernten Standorten mit 6TG-Auswahl und Methylenblaufärbung zu sammeln und zu quantifizieren. Das Ergebnis ist eine Sammlung von Gewebekulturplatten mit blauen Punkten, die metastasierende Kolonien darstellen. Das Pulaski- und Ostrand-Rosenberg-Protokoll quantifiziert jedoch metastasierende Kolonien durch manuelles Zählen, und daher war dies das Standardmittel zur Bewertung von Metastasen in diesem Modell. Während dies für Gewebe mit geringer metastasierender Belastung einfach ist, sind Gewebe wie die Lunge oft mit Metastasen beladen. Da Lungenplatten sehr konfluent sein können, ist die genaue und präzise Quantifizierung metastasierender Kolonien durch manuelles Zählen schwierig und anfällig für menschliches Versagen. Um die metastasierende Belastung besser zu quantifizieren, beschreiben wir die Verwendung von Fiji-ImageJ für eine computerbasierte Lösung für menschliche Zählfehler. Histopathologische Analyse mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) Färbung ist ein weiteres Mittel zur Quantifizierung von Lungenmetastasen, und interessanterweise wurde auch mit Fiji-ImageJ Software6,7verbessert. Da jedoch die histopathologische Analyse eine einzelne Scheibe der Lunge beobachtet, kann sie ungenau und unrepräsentativ sein. Dies liegt daran, dass das 4T1-Modell mehrere metastasierende Läsionen im gesamten Organ verursacht, die nicht gleichmäßig verteilt sind. Während die Gesamttrends zwischen histopathologischer Analyse und manueller Zählung ähnlich sein können8,können einzelne Werte unterschiedlich sein und daher sollte die histopathologische Analyse nicht als einziges Mittel zur Quantifizierung verwendet werden. Wir zeigen den Nutzen im Vergleich zur histopathologischen Analyse und die Inkonsistenzen bei der manuellen Zählung zwischen verschiedenen Zählern, während wir gleichzeitig die Konsistenz der Verwendung von Fidschi-ImageJ demonstrieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass diese Methode die Inkubationszeit von 10-14 Tagen auf 5 Tage reduzieren kann, was bedeutet, dass Forscher Daten aus ihrer Studie viel früher analysieren können, als wenn sie sich auf manuelles Zählen verlassen.
Diese Methode ist eine Sammlung einfacher Anpassungen des Pulaski- und Ostrand-Rosenberg-Protokolls3. Da das 4T1-Modell weit verbreitet ist und die Lungenmetastasierung ein kritischer Parameter für präklinische Modelle ist, glauben wir, dass diese Methode weit verbreitet sein kann und für Brustkrebsforscher sehr wertvoll ist. Die einzigen zusätzlichen Vorräte sind eine Kamera und Der Zugriff auf einen Computer mit Fiji-ImageJ, einer kostenlosen Software, die häufig in der Bildanalyse verwendet wird9. Diese Methode konzentriert sich speziell auf Lungenmetastasen, aber es könnte für andere Gewebe mit signifikanter metastasierender Belastung verwendet werden.
Wie gezeigt, kann das manuelle Zählen der metastasierenden Kolonien auf jeder Lungenplatte eine ungenaue und ungenaue Methode zur Quantifizierung von Lungenmetastasen sein, was die Notwendigkeit einer besseren Quantifizierung simoniert (Abbildung 2). Die histopathologische Analyse unterschied sich sowohl von der manuellen Zählung als auch von der Fidschi-ImageJ-Analyse(Abbildung 2B und 4D), wahrscheinlich, weil die H&E-Folien keine repräsenta…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), dem Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA) und den National Institutes of Health R21EB028429 (IA) unterstützt.
Anesthesia chamber | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
Anesthetic agent | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
BALB/c Female Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
Blunt scissors | Roboz | RS-6700 | |
Calculator | Any | Any | |
Camera | Any | Any | Minimum of 8 megapixels |
Centrifuge | Any | Any | Needs to be capable of 125 x g and 300 x g |
CO2 euthanasia setup | See comments | See comments | Use approved materials in your institution's policies |
Cold room, refrigerator, cold storage | Any | Any | |
Computer with Fiji-ImageJ | Any | Any | Needs to be capable of running Fiji-ImageJ |
Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
Curved scissors | Roboz | RS-5859 | |
Distilled water | Any | Any | |
Elastase | MP Biomedicals | 100617 | |
Electronic scale | Any | Any | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11150 | |
Forceps | Roboz | RS-8100 | |
Ice | N/A | N/A | |
Incubator | See comments | See comments | Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C |
Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
Methylene blue | Sigma-Aldrich | 03978-250ML | |
Penicillin Streptomycin | ATCC | 30-2300 | |
Pins or needles | Any | Any | For pinning down mice during necropsy |
Plastic calipers | VWR | 25729-670 | |
RMPI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | |
Rocker or rotating wheel | Any | Any | |
Sharp scissors | Roboz | RS-6702 | |
Sterile disposable filter with PES membrane | ThermoFisher Scientific | 568-0010 | |
T-150 Flasks | Fisher Scientific | 08-772-48 | |
T-25 Flasks | Fisher Scientific | 10-126-10 | |
T-75 Flasks | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
Tri-cornered plastic beaker | Fisher Scientific | 14-955-111F | Used to weigh mice |
Trypan blue | VWR | 97063-702 | |
Trypsin-EDTA | ATCC | 30-2101 | |
Type IV collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
1 cm tissue culture plates | Nunclon | 153066 | |
1 mL syringe | BD | 309659 | |
1.7 mL microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
10 cm tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
12 well plate | Corning | 3512 | |
15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS) | Fisher Scientific | SH30028FS | |
1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH3026802 | |
27 g 1/2 in needles | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
4T1 (ATCC® CRL2539™) | ATCC | CRL-2539 | |
50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
6-Thioguanine | Sigma-Aldrich | A4882 | |
70 μM cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
70% ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | Dilute to 70% with DI water |