Ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus

Summary

Primäre Hepatozyten sind ein wertvolles Werkzeug, um die Leberreaktion und den Metabolismus in vitro zu untersuchen. Unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien wurde ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus entwickelt.

Abstract

Primäre Hepatozyten werden in der Leber-in-vitro-Forschung , insbesondere in Glukosestoffwechselstudien, umfassend eingesetzt. Eine Basistechnik wurde basierend auf verschiedenen Anforderungen wie Zeit, Arbeit, Kosten und primärer Hepatozytennutzung angepasst, was zu verschiedenen primären Hepatozytenisolationsprotokollen führte. Die zahlreichen Schritte und zeitaufwändigen Reagenzienpräparate in der primären Hepatozytenisolierung sind jedoch große Nachteile für die Effizienz. Nach dem Vergleich verschiedener Protokolle für ihre Vor- und Nachteile wurden die Vorteile jedes Protokolls kombiniert und ein schnelles und effizientes primäres Hepatozytenisolationsprotokoll formuliert. Innerhalb von nur ~ 35 Minuten könnte dieses Protokoll genauso viel, wenn nicht mehr, gesunde primäre Hepatozyten liefern wie andere Protokolle. Darüber hinaus validierten Glukosestoffwechselexperimente, die mit den isolierten primären Hepatozyten durchgeführt wurden, die Nützlichkeit dieses Protokolls in In-vitro-Leberstoffwechselstudien . Wir haben auch die Bedeutung und den Zweck jedes Schritts in dieser Studie ausführlich überprüft und analysiert, damit zukünftige Forscher dieses Protokoll basierend auf den Bedürfnissen weiter optimieren können.

Introduction

Die Leber dient als eines der wichtigsten Organe im Wirbeltierkörper aufgrund der lebenswichtigen Rolle, die sie bei zahlreichen lebenserhaltenden Funktionen wie Nahrungsverdauung, Durchblutung und Entgiftung spielt. Die Verwendung von primären Hepatozyten in vitro-Kulturen der Maus wird in Studien zum Kohlenhydratstoffwechsel und zum Leberkarzinom immer beliebter. Daher ist es wichtig, eine geeignete Methode zur primären Hepatozytenisolierung der Maus zu entwickeln und gleichzeitig ihre angeborene physiologische Funktion beizubehalten. Aufgrund ihrer Funktion als Drehscheibe des Glukosestoffwechsels ist die Leber auch für die Glukoseproduktion und -speicheru....

Protocol

Alle Verfahren wurden vom Johns Hopkins Animal Care and Use Committee genehmigt. C57BL/6 weibliche Mäuse (8 Wochen alt) wurden in dieser Studie verwendet.

1. Vorbereitung:

1. Mischen Sie William's E Medium (GlutaMAX Supplement) mit 10% FBS und 1% antimykotischer Lösung, um die Kultur medium zu machen.
2. Filtern Sie 25 ml Kollagenase-Dispase-Medium (z. B. Leberaufschlussmedium) durch einen 0,45-μm-Spritzenfilter, um Partikelablagerungen zu entfernen.
3. Erwärmen Sie 50 ml doppelt destilliertes_H2O(ddH₂O), 35 ml Perfusionsmedium (z. B. Leberperfusionsmedium) (oder 50 ml zum ersten Ma....

Results

Um die Effizienz zu testen, wurde das vorliegende primäre Hepatozytenisolationsprotokoll an 8 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen durchgeführt. Die Anheftung und Reinheit isolierter primärer Hepatozyten wurde getestet. Die primäre Hepatozytenisolierung wird für eine Vielzahl von Experimenten zur Leberphysiologie verwendet, wie z. B. hepatische Arzneimittelwirkungen und Glukosestoffwechsel, pharmazeutische Biomarkeraktivität², Insulinsensitivität und Glukoseproduktion. Daher wurden die Aktivität.......

Discussion

Verschiedene primäre Hepatozytenisolationsprotokolle wurden entwickelt. Sie wurden auch optimiert und an unterschiedliche Bedürfnisse angepasst (Tabelle 1). Isolationsprotokolle bestehen im Allgemeinen aus zwei Teilen: Perfusion (einschließlich Enzymaufschluss) und Reinigung.

Die Perfusion kann mit der gesamten Leber in vivo 2,20,21,22,23 oder mit sezierten Leberlappen ^<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	10010023
10x HBSS	Gibco	14065-056
12-Well-Platte	FALCON	353043	Beschichtung nicht erforderlich
6-Well-Platte	FALCON	353046	Beschichtung nicht erforderlich
Anti-AKT	Cell Signaling	2920S
Antibiotische Antimykotische Lösung (100x), stabilisiert	Sigma-Aldrich	A5955
anti-FOXO1	Zellsignalisierung	97635S
anti-GAPDH	Zellsignalisierung	2118S
anti-p-AKT (S473)	Zellsignalisierung	9271L
anti-PEPCK	Santa Cruz	SC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)	Zellsignalisierung	84192S
Zellsieb, 70 &Mikro; m	CELLTREAT	IV-Katheter
, 24 Gauge 0,75 IN	Becton Dickinson	383511
DMEM, keine Glukose, kein Glutamin, kein Phenolrot	ThermoFisher Scientific	A1443001
EnzyChrom Glukose-Assay-Kit	BioAssay Systems	EBGL-100
Fötales Rinderserum (FBS)	Hyklon	SH30071,03
Forskolin	MilliporeSigma	F3917-10MG
Glucagon	Sigma-Aldrich	G2044
Ziege Anti-Maus IgG Sekundärer Antikörper	LI-COR	926-68070
Ziege Anti-Kaninchen IgG Sekundärer Antikörper	LI-COR	926-32211
GraphPad Prism 8	GraphPad Software	NA
Hepatozyten Waschmedium	Gibco	17704-024
IBMX	Zellsignalisierung	13630S
Insulin	Lilly	NDC 0002-8215-01
Ketamin HCL (100 mg/ml)	Hospira Inc	NDC 0409-2051-05
L-Glutamin	Gibco	25030081
Leberverdaumedium	Gibco	17703-034	Aliquot in der Gewebekulturhaube auf jeweils 25 mL in einem 50-ml-Röhrchen und bei -20 & Grad aufbewahren; C Gefrierschrank
Leberperfusionsmedium	Gibco	17701-038
Pen Strep	Gibco	15140122
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Peristaltikpumpe	Gilson	Minipuls 2	Kann mit 4 mL/min
pumpen Petrischale	Fisherbrand	08-757-12
Kühlzentrifuge	Sorvall	Legend RT	Kann 50 mL Röhrchen bei 4 & Grad zentrifugieren; C
Natrium L-Lactat	Sigma-Aldrich	L7022
Natriumpyruvat	Gibco	11360070
Spritzenvorsatzfilter, PVDF 0,45 µ m	CELLTREAT	229745
, 0,5 mL	Becton Dickinson	329461
Spritze, 60 mL	Becton Dickinson	309653
Trypan Blue Lösung, 0,4 %	Gibco	15250061
Röhrchen, 15 mL	Corning	430052
Röhrchen, 50 mL	Corning	430290
Wasser Bath Tank	Corning	CLS6783	Oder jeder Wasserbadtank, der auf bis zu 45 °C heizen kann; C
William' s E Medium (GlutaMAX Ergänzung)	Gibco	32551020
Xylozin (100 mg/ml)	Vetone Anased LA	NDC13985-704-10