Methodenartikel

Ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus

DOI:

10.3791/61812

⸱

25. Oktober 2021

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Physiology, Temple University School of Medicine, 3Department of Pediatrics, Seattle Children’s Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primäre Hepatozyten sind ein wertvolles Werkzeug, um die Leberreaktion und den Metabolismus in vitro zu untersuchen. Unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien wurde ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus entwickelt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primäre Hepatozyten werden in der Leber-in-vitro-Forschung , insbesondere in Glukosestoffwechselstudien, umfassend eingesetzt. Eine Basistechnik wurde basierend auf verschiedenen Anforderungen wie Zeit, Arbeit, Kosten und primärer Hepatozytennutzung angepasst, was zu verschiedenen primären Hepatozytenisolationsprotokollen führte. Die zahlreichen Schritte und zeitaufwändigen Reagenzienpräparate in der primären Hepatozytenisolierung sind jedoch große Nachteile für die Effizienz. Nach dem Vergleich verschiedener Protokolle für ihre Vor- und Nachteile wurden die Vorteile jedes Protokolls kombiniert und ein schnelles und effizientes primäres Hepatozytenisolationsprotokoll formuliert. Innerhalb von nur ~ 35 Minuten könnte dieses Protokoll genauso viel, wenn nicht mehr, gesunde primäre Hepatozyten liefern wie andere Protokolle. Darüber hinaus validierten Glukosestoffwechselexperimente, die mit den isolierten primären Hepatozyten durchgeführt wurden, die Nützlichkeit dieses Protokolls in In-vitro-Leberstoffwechselstudien . Wir haben auch die Bedeutung und den Zweck jedes Schritts in dieser Studie ausführlich überprüft und analysiert, damit zukünftige Forscher dieses Protokoll basierend auf den Bedürfnissen weiter optimieren können.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Leber dient als eines der wichtigsten Organe im Wirbeltierkörper aufgrund der lebenswichtigen Rolle, die sie bei zahlreichen lebenserhaltenden Funktionen wie Nahrungsverdauung, Durchblutung und Entgiftung spielt. Die Verwendung von primären Hepatozyten in vitro-Kulturen der Maus wird in Studien zum Kohlenhydratstoffwechsel und zum Leberkarzinom immer beliebter. Daher ist es wichtig, eine geeignete Methode zur primären Hepatozytenisolierung der Maus zu entwickeln und gleichzeitig ihre angeborene physiologische Funktion beizubehalten. Aufgrund ihrer Funktion als Drehscheibe des Glukosestoffwechsels ist die Leber auch für die Glukoseproduktion und -speicherungvon zentraler Bedeutung 1. Experimente mit primären Hepatozyten in vitro sind ein Muss für die meisten Glukosestoffwechselstudien. Daher haben verschiedene Forschungsgruppen seit Jahren Protokolle für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus entwickelt.

Das allgemeine Verfahren der Hepatozytenisolierung der Maus besteht darin, zuerst Blut in der Leber mit einer isosmotischen Flüssigkeit wie phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) auszuspülen und dann Kollagenase-haltige Lösung zu verwenden, um Hepatozyten zu dissoziieren. Diese Protokolle teilen sich ein allgemeines Verfahren, unterscheiden sich jedoch in Reagenzien und Schritten, die auf unterschiedlichen Anforderungen basieren. Die Vorbereitung der erforderlichen Reagenzien und die Durchführung von Isolationsschritten nehmen jedoch Zeit in Anspruch. Bei der Entwicklung des vorliegenden Protokolls wurde die Effizienz als Priorität festgelegt, wobei alle Reagenzien gebrauchsfertig und auf dem Markt erhältlich sind, und zwar in so wenigen Schritten wie möglich. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine schnelle und arbeitseffiziente Methode zur Isolierung primärer Hepatozyten von der Maus bereitzustellen, ohne die Reinheit und Lebensfähigkeit isolierter primärer Hepatozyten zu gefährden.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Verfahren wurden vom Johns Hopkins Animal Care and Use Committee genehmigt. C57BL/6 weibliche Mäuse (8 Wochen alt) wurden in dieser Studie verwendet.

1. Vorbereitung:

  1. Mischen Sie William's E Medium (GlutaMAX Supplement) mit 10% FBS und 1% antimykotischer Lösung, um die Kultur medium zu machen.
  2. Filtern Sie 25 ml Kollagenase-Dispase-Medium (z. B. Leberaufschlussmedium) durch einen 0,45-μm-Spritzenfilter, um Partikelablagerungen zu entfernen.
  3. Erwärmen Sie 50 ml doppelt destilliertesH2O(ddH2O), 35 ml Perfusionsmedium (z. B. Leberperfusionsmedium) (oder 50 ml zum ersten Mal unter Verwendung dieses Protokolls) und 25 ml gefiltertes Kollagenase-Dispase-Medium in einem 45 ° C-Wasserbad für 30 min.
  4. Mischen Sie in einer sterilen Gewebekulturhaube 2 ml 10x HBSS und 18 ml Percoll in einem 50 ml Röhrchen, um 20 ml 1x Percoll-HBSS herzustellen und auf Eis oder 4 ° C zu halten.
    HINWEIS: 1x Percoll-HBSS kann mindestens 6 Monate bei 4 °C gehalten werden.
  5. In einer sterilen Gewebekulturhaube 30 ml Waschmedium (z. B. Hepatozyten-Waschmedium) in eine saubere Petrischale geben und auf Eis legen.
  6. Tauchen Sie das Pumprohr in das Wasser eines 45 °C warmen Wasserbades. Die Ergebnisse sind am zuverlässigsten, wenn die Raumtemperatur bei 25 °C liegt.
  7. Bereiten Sie 2 ml 1x Anästhetika vor, indem Sie 225 μL Ketamin HCL, 93,75 μL Xylat und 1681 μL 1x PBS mischen.
  8. Anästhesieren Sie eine Maus mit einer zugelassenen Methode. Hier wurde der Maus intraperitoneal 150 μL 1x Anästhetika injiziert. Führen Sie die Tests für den Verlust von Reflexen wie Reaktion auf Zehenkneifen durch, um eine Vollnarkose zu gewährleisten.
  9. Befestigen Sie die Maus auf dem Rücken mit vier Gliedmaßen auf dem Sezierpad, indem Sie entweder festklemmen oder wasserdichtes Klebeband oder andere vom Animal Care and Use Committee (oder gleichwertigen) der Institution genehmigte Methoden verwenden.
  10. Sterilisierte Pinzetten und Scheren für die Dissektion vorbereiten. Um eine mögliche Kontamination zu vermeiden, führen Sie alle Schritte in einer sterilen Haube durch.

2. Verfahren:

  1. Beginnen Sie mit einer Peristaltikpumpe mit dem Pumpen von erwärmtem ddH2O mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/min für 5 min. Wechseln Sie das Pumprohr von Wasser zu einem aufgewärmten Perfusionsmedium.
  2. Desinfizieren Sie den Bauch der betäubten Maus mit 70% EtOH und schneiden Sie ihn mit einer Schere auf, um die Leber, die Pfortader und die untere Hohlvene (IVC) freizulegen.
  3. Stoppen Sie die Peristaltikpumpe. Setzen Sie einen 24-G-Katheter (z. B. geschlossener IV-Katheter, 24 G, 0,75 Zoll) in IVC ein. Beginnen Sie mit dem Pumpen und schneiden Sie die Pfortader auf.
  4. Pumpen Sie weiter, bis die ausgespülte Flüssigkeit klar ist (ca. 3-5 min). Drücken Sie die Pfortader jede Minute, damit Flüssigkeit jeden Winkel der Leber erreicht. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen in das IVC eindringen.
    HINWEIS: Dieser Schritt besteht darin, so viel Blut wie möglich aus der Leber auszuspülen.
  5. Wechseln Sie das Pumprohr vom Perfusionsmedium zum Kollagenase-Dispase-Medium. Pumpen Sie weiter, bis alle 25 ml des Kollagenase-Dispase-Mediums erschöpft sind, während Sie Schritt 2.6 ausführen.
  6. Drücken Sie die Pfortader jede Minute, damit Flüssigkeit jeden Winkel der Leber erreicht.
    HINWEIS: In diesem Stadium ist der vollständige Blutverlust für die Maus tödlich. Der Tod der Maus kann durch einen fehlenden Herzschlag nach dem Experiment bestätigt werden. Entsorgen Sie den Kadaver gemäß den Richtlinien der Einrichtung.
  7. Isolieren Sie die ganze Leber ohne Gallenblase auf das 30 ml Waschmedium in der Petrischale auf Eis.
  8. Reißen Sie es mit einer Pinzette in Stücke, um primäre Hepatozyten in Lösung freizusetzen. Dieser Schritt würde das Waschmedium in eine trüben Lösung voller freigesetzter primärer Hepatozyten und kleiner Leberstücke verwandeln.
  9. Filtern Sie die trüben Lösung in Schritt 2.8 durch ein 70 μm Zellsieb in das 20 mL 1x Percoll-HBSS in einem 50 mL Rohr auf Eis. Mischen Sie, indem Sie das Rohr 20 Mal umkehren.
  10. Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei 4 °C.
  11. Saugen Sie den Überstand innerhalb der Gewebekulturhaube ab. Waschen Sie das Pellet mit kaltem 30 ml Waschmedium.
  12. Zentrifuge bei 50 x g für 5 min bei 4 °C.
  13. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 25 ml des Kulturmediums (oder geeigneten anderen Volumina) innerhalb der Gewebekulturhaube.
  14. Zählen Sie die Zellzahl und die Platte der Zellen auf den gewünschten Kulturplatten entsprechend dem Versuchsdesign.
    HINWEIS: Primäre Hepatozyten, die ordnungsgemäß von einer 8 Wochen alten Maus isoliert wurden, reichen normalerweise aus, um auf vier 6-Well-Platten oder vier 12-Well-Platten plattiert zu werden.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um die Effizienz zu testen, wurde das vorliegende primäre Hepatozytenisolationsprotokoll an 8 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen durchgeführt. Die Anheftung und Reinheit isolierter primärer Hepatozyten wurde getestet. Die primäre Hepatozytenisolierung wird für eine Vielzahl von Experimenten zur Leberphysiologie verwendet, wie z. B. hepatische Arzneimittelwirkungen und Glukosestoffwechsel, pharmazeutische Biomarkeraktivität2, Insulinsensitivität und Glukoseproduktion. Daher wurden die Aktivität...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschiedene primäre Hepatozytenisolationsprotokolle wurden entwickelt. Sie wurden auch optimiert und an unterschiedliche Bedürfnisse angepasst (Tabelle 1). Isolationsprotokolle bestehen im Allgemeinen aus zwei Teilen: Perfusion (einschließlich Enzymaufschluss) und Reinigung.

Die Perfusion kann mit der gesamten Leber in vivo 2,20,21,22,23 oder mit sezierten Leberlappen <...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (Grant 5R01HD095512-02 to S.W.) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1x PBSGibco10010023
10x HBSSGibco14065-056
12-Well-PlatteFALCON353043Beschichtung nicht erforderlich
6-Well-PlatteFALCON353046Beschichtung nicht erforderlich
Anti-AKTCell Signaling2920S
Antibiotische Antimykotische Lösung (100x), stabilisiertSigma-AldrichA5955
anti-FOXO1Zellsignalisierung97635S
anti-GAPDHZellsignalisierung2118S
anti-p-AKT (S473)Zellsignalisierung9271L
anti-PEPCKSanta CruzSC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)Zellsignalisierung84192S
Zellsieb, 70 &Mikro; mCELLTREATIV-Katheter
, 24 Gauge 0,75 INBecton Dickinson383511
DMEM, keine Glukose, kein Glutamin, kein PhenolrotThermoFisher ScientificA1443001
EnzyChrom Glukose-Assay-KitBioAssay SystemsEBGL-100
Fötales Rinderserum (FBS)HyklonSH30071,03
ForskolinMilliporeSigmaF3917-10MG
GlucagonSigma-AldrichG2044
Ziege Anti-Maus IgG Sekundärer AntikörperLI-COR926-68070
Ziege Anti-Kaninchen IgG Sekundärer AntikörperLI-COR926-32211
GraphPad Prism 8GraphPad SoftwareNA
Hepatozyten WaschmediumGibco17704-024
IBMXZellsignalisierung13630S
InsulinLillyNDC 0002-8215-01
Ketamin HCL (100 mg/ml)Hospira IncNDC 0409-2051-05
L-GlutaminGibco25030081
LeberverdaumediumGibco17703-034Aliquot in der Gewebekulturhaube auf jeweils 25 mL in einem 50-ml-Röhrchen und bei -20 & Grad aufbewahren; C Gefrierschrank
LeberperfusionsmediumGibco17701-038
Pen StrepGibco15140122
PercollGE Healthcare17-0891-01
PeristaltikpumpeGilsonMinipuls 2Kann mit 4 mL/min
pumpen PetrischaleFisherbrand08-757-12
KühlzentrifugeSorvallLegend RTKann 50 mL Röhrchen bei 4 & Grad zentrifugieren; C
Natrium L-LactatSigma-AldrichL7022
NatriumpyruvatGibco11360070
Spritzenvorsatzfilter, PVDF 0,45 µ mCELLTREAT229745
, 0,5 mLBecton Dickinson329461
Spritze, 60 mLBecton Dickinson309653
Trypan Blue Lösung, 0,4 %Gibco15250061
Röhrchen, 15 mLCorning430052
Röhrchen, 50 mLCorning430290
Wasser Bath TankCorningCLS6783Oder jeder Wasserbadtank, der auf bis zu 45 °C heizen kann; C
William' s E Medium (GlutaMAX Ergänzung)Gibco32551020
Xylozin (100 mg/ml)Vetone Anased LANDC13985-704-10
229483 geschlossener Spritze mit 30 mm

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218(2016).
  2. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  3. Guidotti, J. E., et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
  4. Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. Elife. 4, 11214(2015).
  5. Bruening, J., et al. Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111(2018).
  6. Silvie, O., et al. Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity. Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).
  7. Crispe, I. N. Hepatocytes as immunological agents. Journal of Immunology. 196 (1), 17-21 (2016).
  8. Liu, N. C., et al. Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis. Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).
  9. Wang, Z., et al. Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility. JCI Insight. 5 (17), 127817(2019).
  10. Santos, S. D., et al. CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).
  11. Pinhu, L., et al. Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes. Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).
  12. Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle. Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).
  13. Tanowitz, M., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).
  14. Manczak, M., et al. Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).
  15. Zhang, Y., et al. JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).
  16. Shih, S. C., et al. Molecular profiling of angiogenesis markers. American Journal of Pathology. 161 (1), 35-41 (2002).
  17. Liu, G., et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).
  18. Ding, Q., et al. Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo. Journal of Virology. 91 (4), 01799(2017).
  19. Renshaw, M., et al. Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging. Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).
  20. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  21. Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323(2018).
  22. Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).
  23. Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507(2019).
  24. Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar Journal. 6, 169(2007).
  25. Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).
  26. Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf (2021).
  27. Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
  28. Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. Differential location and distribution of hepatic immune cells. Cells. 6 (4), 48(2017).
  29. Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).
  30. Geerts, A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).
  31. Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
  32. Peter, M. E., et al. The CD95 receptor: apoptosis revisited. Cell. 129 (3), 447-450 (2007).
  33. Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
  34. Willoughby, J. L. S., et al. Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression. Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).
  35. Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130. American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Mouse Primary Hepatocyte IsolationPeristaltic Pump PerfusionCollagenase Dispase DigestionCell Strainer FiltrationCentrifugation WashingHepatocyte Marker AnalysisGlucose Metabolism AssaysInsulin Sensitivity TestingTime Efficient ProtocolLabor Friendly Method

Verwandte Artikel