Methodenartikel

Heterologe Expression und funktionelle Analyse von Geruchsrezeptoren von Aedes aegypti für menschliche Gerüche in Xenopus-Eizellen

DOI:

10.3791/61813

⸱

8. Juni 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University, 2Departments of Biochemistry & Biophysics, and Cellular & Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, 3Department of Biological Sciences, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Es wird ein Protokoll vorgestellt, das Mücken-OPs als Reaktion auf menschliche Gerüche funktionell charakterisiert, indem ein Xenopus-Oozytenexpressionssystem verwendet wird, das mit einer Zwei-Elektroden-Spannungsklemme gekoppelt ist, und bietet eine leistungsstarke neue Technik zur Erforschung der Reaktionen von Mücken-OPs auf die Exposition gegenüber menschlichen Gerüchen.

Zusammenfassung

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Die Stechmücke Aedes aegypti (Linnaeus), ein Überträger vieler wichtiger menschlicher Krankheiten wie Gelbfieber, Dengue-Fieber und Zika-Fieber, zeigt eine starke Präferenz für menschliche Wirte gegenüber anderen warmblütigen Tieren für Blutmahlzeiten. Geruchsreize spielen eine entscheidende Rolle für Mücken, da sie ihre Umgebung erkunden und einen menschlichen Wirt suchen, um Blutmahlzeiten zu erhalten und so menschliche Krankheiten zu übertragen. Es ist bekannt, dass Geruchsrezeptoren (ORs), die in den olfaktorischen sensorischen Neuronen exprimiert werden, für die Interaktion von Mückenvektoren mit menschlichen Gerüchen verantwortlich sind. Um tiefere Einblicke in die olfaktorische Physiologie von Ae. aegypti zu erhalten und ihre Interaktionen mit dem Menschen auf molekularer Ebene zu untersuchen, haben wir ein optimiertes Protokoll der heterologen Expression von Xenopus-Eizellen verwendet, um die Geruchsrezeptoren von Ae. aegypti als Reaktion auf menschliche Gerüche funktionell zu analysieren. Es werden drei Beispielexperimente vorgestellt: 1) Klonierung und Synthese von cRNAs von ORs und Odorant-Rezeptor-Co-Rezeptoren (Orco) von vier bis sechs Tage alten Ae. aegypti-Antennen ; 2) Mikroinjektion und Expression von ORs und Orco in Xenopus-Eizellen ; und 3) Ganzzellstromaufzeichnung von Xenopus-Eizellen , die Mücken-ORs/Orco exprimieren, mit einer Zwei-Elektroden-Spannungsklemme. Diese optimierten Verfahren bieten Forschern eine neue Möglichkeit, die menschliche Geruchswahrnehmung in Aedes-Mücken zu untersuchen und die zugrunde liegenden Mechanismen aufzudecken, die ihre Aktivität bei der Wirtssuche auf molekularer Ebene steuern.

Einleitung

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Die Gelbfiebermücke Ae. aegypti kann viele tödliche Krankheiten übertragen, darunter Gelbfieber, Dengue-Fieber und Zika-Fieber, die enormes Leid und den Verlust von Menschenleben verursachen. Mücken nutzen mehrere Signale wie CO2, Hautgeruch und Körperwärme, um ihre Wirte zu lokalisieren1. Angesichts der Tatsache, dass sowohl Menschen als auch andere warmblütige Tiere CO2 produzieren und ähnliche Körpertemperaturen haben, scheint es wahrscheinlich, dass weibliche Ae. aegypti in erster Linie auf den Hautgeruch angewiesen sind, um den Wirtzu unterscheiden 2. Dies ergibt jedoch ein komplexes Bild, da in einer frühen Studie mehr als 300 Verbindungen aus menschlichen Hautemanationen isoliertwurden 3. Weitere Verhaltenstests haben gezeigt, dass eine Reihe dieser Verbindungen bei Ae. aegypti Verhaltensreaktionen hervorrufen 4,5,6,7, aber wie genau diese Verbindungen von der Mücke nachgewiesen werden, ist weitgehend unbekannt. Neuere Forschungen unserer Gruppe haben mehrere menschliche Geruchsstoffe identifiziert, die an der Wirtssuchaktivität von Ae. aegypti beteiligt sein könnten, obwohl ihre Rolle noch durch weitere Verhaltenstests bestätigt werden muss8. Wie diese essentiellen menschlichen Geruchsstoffe im peripheren sensorischen System von Ae. aegypti entschlüsselt werden, muss noch geklärt werden.

Insekten nehmen Geruchsstoffe über die chemosensorischen Sensillen an ihren Riechanhängen wahr. In jeder der Sensillen werden verschiedene Geruchsrezeptoren, einschließlich Geruchsrezeptoren (ORs), ionotrope Rezeptoren (IRs) und Geschmacksrezeptoren (GRs), auf der Membran olfaktorischer sensorischer Neuronen exprimiert9. Diese OPs sind für die Wahrnehmung vieler Geruchsstoffe verantwortlich, denen Insekten begegnen, insbesondere der Gerüche, die mit Nahrung, Wirten und Paarungspartnern verbunden sind 10,11,12,13. Eine frühere Studie, die sich auf die Entwaisung der Funktion von OPs in Anopheles gambiae unter Verwendung des Xenopus-Expressionssystems in Verbindung mit einer Zwei-Elektroden-Spannungsklemme konzentrierte, ergab, dass Anopheles-ORs spezifisch auf die Aromaten abgestimmt sind, die die Hauptkomponenten in menschlichen Emanationen sind14. Eine kürzlich durchgeführte Genomstudie identifizierte bis zu 117 OR-Gene in Ae. aegypti15. Folglich würde eine Möglichkeit, die Funktionen dieser Aedes-OPs als Reaktion auf biologisch oder ökologisch wichtige Geruchsstoffe wie menschliche Gerüche oder Eiablagereize systematisch zu untersuchen, nützliche Informationen für diejenigen liefern, die die chemische Ökologie oder Neuroethologie von Ae. aegypti besser verstehen möchten.

Die Zwei-Elektroden-Spannungsklemmtechnik (TEVC) wurde ursprünglich entwickelt, um die Funktion von Membranionenkanälen Mitte der 1990er Jahre zu untersuchen16,17. Seitdem wird TEVC zur Untersuchung von OPs einer Reihe verschiedener Insektenarten eingesetzt: 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Diese funktionelle Untersuchung von ORs hat wesentlich zur Beantwortung wichtiger ökologischer Fragen bei Insekten beigetragen, darunter: 1) Wie lokalisieren Insekten Nahrungsquellen? 2) Wie werden sie von den flüchtigen Sexualpheromonen angezogen, die von ihren Paarungspartnern freigesetzt werden? 3) Wie finden sie einen perfekten Eiablageplatz für ihren Nachwuchs? und 4) Gibt es pflanzliche oder synthetische Verbindungen, die den Menschen wirksam vor beißenden Wanzen schützen können? Antworten auf diese Fragen sind entscheidend für die Bekämpfung wichtiger Krankheitsüberträger wie Stechmücken.

Eine Reihe anderer Ansätze, einschließlich solcher, die auf der humanen embryonalen Nierenzelllinie 293 (HEK293), dem Drosophila-System leerer Neuronen, der Zinkfinger-Nuklease, der Transkriptionsaktivator-ähnlichen Effektornuklease und dem CRISPR/Cas9-Gen-Editing-System basieren, wurden ebenfalls in OP-Funktionsstudien verwendet 12,20,35,36,37. Diese Techniken erfordern jedoch alle die Fähigkeiten eines erfahrenen Molekularbiologen und beinhalten mehrere potenziell verwirrende Faktoren. Die TEVC/Oozytenexpression ist in der Lage, geruchsevozierte Rezeptorströme und die Ionenleitfähigkeit direkt zu messen und hat den zusätzlichen Vorteil der schnellen, schnellen Einrichtungszeit, die für die Expression von Rezeptoren aus cRNA erforderlich ist. In dieser Studie untersuchten wir daher mit TEVC die Reaktionen eines Ae. aegypti OR55 (AaegOR55) gegen mehrere Geruchsstoffe mit potenzieller biologischer Relevanz, wobei wir zeigten, dass Eizellen, die mit AaegOR55•AaegOrco exprimiert wurden, eine dosisabhängige Reaktion auf den humanen Geruchsstoff Benzaldehyd zeigten.

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Protokoll

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Das Protokoll für dieses Verfahren, die Pflege und Verwendung von Labortieren, ist genehmigt und überwacht (Auburn University's Institutional Animal Care and Use Committee: genehmigtes Protokoll # 2016-2987).

HINWEIS: Die kundenspezifische Gensynthese ist eine praktikable Alternative zum Klonen von Mücken-OR-Genen.

1. Sammlung von Mücken und Riechanhängseln (Antennen)

  1. Halten Sie Ae. aegypti-Mücken (erhalten von Dr. James Becnel, USDA, ARS, Mosquito and Fly Research Unit) bei 25 ± 2°C und einer Photoperiode von 12:12 (L:T) h (Licht an 8 Uhr).
  2. Betäuben Sie ~800 4-6 Tage alte weibliche Mücken ohne Blutzufuhr mit CO2. Schneiden Sie die Mückenantennen (Riechgewebe) unter einem Mikroskop (40x) mit einer Schere ab und sammeln Sie sie in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, das auf Trockeneis aufbewahrt wird.
    HINWEIS: Die gesammelten Antennen können in einem Gefrierschrank bei -80 °C gelagert oder sofort verwendet werden.

2. ODER Klonierung von Antennen von Ae. aegypti

  1. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus den Antennen mit einem im Handel erhältlichen Gesamt-RNA-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  2. Verdauen Sie die Gesamt-RNA mit dem kommerziellen DNA-freien Kit, um DNase und andere Ionen gemäß dem Protokoll des Herstellers zu entfernen.
  3. Synthetisieren Sie cDNA aus 1,5 μg DNA-freier RNA mit dem Oligo d(T)20-primed SuperScript IV First-Strand Synthesis System13,30.
  4. Entwerfen Sie PCR-Primer für die OR-Gene entsprechend den an VectorBase (https://www.vectorbase.org/) verfügbaren Sequenzen und den speziellen Anforderungen der Enzymschneidstelle. Eine Kozak-Sequenz (GCCACC), die bei den meisten eukaryotischen Organismen die Translation einleitet, wird zwischen der Schnittstelle und dem Startcodon in jedem Vorwärtsprimer30 hinzugefügt.
  5. Klonieren Sie die kodierenden Sequenzen der OR-Gene mittels PCR unter Verwendung genspezifischer Primer, die Restriktionsendonuklease-Stellen und die Kozak-Sequenz gemäß dem Protokoll des Herstellers enthalten.
  6. Weisen Sie PCR-Produkte durch ein 1%iges Agarosegel nach und reinigen Sie sie mit einem kommerziellen Gelextraktionskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  7. Durchführung der rekombinanten Plasmidkonstruktion durch Klonierung von PCR-Produkten in einen pT7T-Vektor nach dem Verdau durch Restriktionsenzyme gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  8. Verifizieren Sie die rekombinanten Plasmide durch Sanger-Sequenzierung und bestätigen Sie mit der VectorBase-Datenbank.

3. cRNA-Synthese

  1. Linearisieren Sie die konstruierten Plasmide mit spezifischem Restriktionsenzym(en).
    HINWEIS: Die Plasmid-DNA muss mit einem Restriktionsenzym stromabwärts des zu transkribierenden Gens linearisiert werden.
  2. Verwenden Sie die linearisierten Plasmide zur Synthese von cRNAs mit einem kommerziellen T7-Kit gemäß einer früheren Beschreibung 13,30.
  3. Mischen Sie die cRNA von OR und Orco (1:1) in einem Zentrifugenröhrchen vor und aliquotieren Sie die gemischte cRNA in ein Volumen von 2 μL (250 ng/μL/Stück) für jedes PCR-Röhrchen. Lagern Sie die aliquotierte cRNA vor der Verwendung bei -80 °C.

4. Xenopus-Eizellentnahme

HINWEIS: Das Verfahren folgt den Anweisungen von Schneider et al.38.

  1. Betäuben Sie Xenopus laevis für 20-30 min in 1 l ultrareinem Wasser mit 1 g Ethyl-m-aminobenzoat-Methansulfonat-Salz (Abbildung 1A). Kneifen Sie mit den Fingern in einen der Zehen des Frosches; Kommt es zu keiner Reaktion, ist der Frosch ausreichend betäubt und bereit für die Operation. Setze den betäubten Frosch auf das Eisbett um.
  2. Die Operation
    1. Reiben Sie den Bauchbereich des Frosches mit 10% Povidon-Jod-Lösung ein und wischen Sie die Lösung mit sauberen Wattebällchen ab. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 Mal.
    2. Machen Sie einen kleinen Bauchschnitt (10-15 mm, Abbildung 1B) mit einem Einwegskalpell. Haut und Faszien-Muskel-Schicht getrennt durchdringen. Der Schnitt befindet sich im unteren Teil des Bauches, lateral der Mittellinie.
      HINWEIS: Verletzen Sie nicht die inneren Organe.
    3. Fassen Sie Teile der Eierstocklappen mit einer Pinzette und ziehen Sie sie sanft nach außen. Hebe den Eierstock an und schneide ihn auf Höhe der Körperwand mit einer Schere ab. Wiederholen Sie dies mehrmals, bis genügend Eierstockmaterial (~200 Eier, Abbildung 1C) vorhanden ist. Übertragen Sie die Eierstockmaterialien in einen Waschpuffer (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM MgCl2•6H2O, 5 mM HEPES-Natriumsalz, 10 μg/mL Gentamycin, pH 7,6).
    4. Verschließen Sie die Operationswunden (sowohl Muskeln als auch Haut) mit resorbierbaren Nähten, die sich in der Regel innerhalb von 10-14 Tagen abbauen und auf natürliche Weise ausfallen.
    5. Legen Sie den Frosch nach jeder Operation in 1 l Rückgewinnungslösung (enthält 3,4 g Einmachsalz und 2 g Instant-Meersalz), bis er aufwacht, und bringen Sie ihn dann zurück in die Froschanlage.
      HINWEIS: An jedem Strahl können bis zu 4 Operationen durchgeführt werden. Das Operationsintervall jedes Strahls sollte mehr als 2 Monate betragen.
  3. Enzymatische defollikulierte Verdauung und Kultivierung von Eizellen
    1. Trennen Sie die Eizellen (~200 Eizellen, Abbildung 1C) in kleine Stücke.
    2. Alle Eizellen werden in eine Aufschlusslösung, einschließlich 10 ml Waschpuffer (Abschnitt 4.2.3) und 2 mg/ml Kollagenase B, für 40-60 min bei Raumtemperatur überführt, um follikuläre Zellschichten zu entfernen. Untersuchen Sie die Proben unter einem Mikroskop, um festzustellen, ob 80 % der Eizellen vollständig defollikuliert wurden. Wenn nicht, überprüfen Sie alle 10 Minuten, bis die meisten Eizellen fertig sind.
    3. Spülen Sie die Eizellen mit 1x Ringer-Lösung (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM MgCl2,6H 2O, 5 mM HEPES-Natriumsalz, pH 7,6), Waschpuffer (Abschnitt 4.2.3), modifizierter Barth-Kochsalzlösung (78 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,33 mM Ca(NO3)2,4H2O, 0,41 mM CaCl2,2H 2O, 0,82 mM MgSO4,7H 2O, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES-Natriumsalz, 1,8 mM Natriumpyruvat, 10 μg/ml Gentamycin, 10 μg/ml Streptomycin, pH 7,6) nacheinander (5 Mal für jeden Puffer, wobei jeweils 10 ml verwendet werden). Spülen Sie die Eizellen ausgiebig mit Puffern, um unreife und minderwertige Eizellen zu entfernen.
    4. Eizellen im Stadium V-VI gemäß der Dumont-Klassifikation entnehmen. Gesunde/qualitativ hochwertige Eizellen im Stadium V-VI mit einer klaren weiß/dunklen Teilung und ohne visuell offensichtliche Schädigung (Abbildung 1D) in eine 100 mm x 15 mm große Petrischale mit modifizierter Barth-Kochsalzlösung (Abschnitt 4.3.3). Entsorgen Sie die Eizellen von schlechter Qualität (Abbildung 1E). Halten Sie verdaute Eizellen in den Insektenwachstumskammern etwa 24 Stunden lang bei 18 °C, bevor Sie die Mikroinjektion durchführen.

5. cRNA-Mikroinjektion und Expression von Geruchsrezeptoren (ORs) und OR-Co-Rezeptoren (Orco) in Xenopus-Eizellen

  1. Legen Sie eine Metallmatrix in die 100 mm x 15 mm große Petrischale und fügen Sie modifizierte Barth-Kochsalzlösung (Abschnitt 4.3.3) hinzu, bis die Matrix untergetaucht ist. Übertragen Sie Eizellen auf die Matrix und verwerfen Sie die Eizellen, die die Größe nicht erreichen. Ordnen Sie die Eizellen mit den pflanzlichen Polen auf der Oberseite an (Abbildung 1F).
  2. Ziehen Sie für jede Probe mit einem Mikrorohrabzieher (Hitze = 525, Zug = 50, Zug = 50, Geschwindigkeit = 50, Zeit = 250) eine Kapillare aus frischem Glas (1,0 mm AD x 0,5 mm Innendurchmesser, Länge = 100 mm) und schärfen Sie sie mit einer Mikropipetten-Anfasmaschine in einem Winkel von 25°. Montieren Sie das Kapillarrohr auf dem Nanoliter-Injektor.
  3. Vor der Injektion ist ein Röhrchen mit vorgemischten cRNAs von OR und Orco (Abschnitt 3.3) aus dem Gefrierschrank zu nehmen und auf Eis zu legen, bis es sich vollständig aufgelöst hat. Füllen Sie das Kapillarröhrchen mit dem OR/Orco-Gemisch, indem Sie die Fülltaste des Nanoliter-Injektors drücken.
  4. Injizieren Sie 10 ng (5 ng ODER + 5 ng Orco; ~20 nL) der vorgemischten cRNA für jede Eizelle mit einem Nanoliter-Injektor an einer RNAse-freien Station. (Abbildung 1F).
    HINWEIS: Vor der Injektion drücken wir die EMPTY-Taste, um ein wenig Gemisch abzulassen und sicherzustellen, dass das Kapillarrohr nicht verstopft ist. Warten Sie etwa 5 Sekunden, bis die cRNAs vollständig in die Eizelle eindringen können.
  5. Nach der Injektion lagern Sie die Eizellen auf einer sterilen 24-Well-Zellkulturplatte mit modifizierter Barth-Kochsalzlösung bei 18 °C für 3-7 Tage, bevor Sie die Ganzzellaufzeichnung durchführen.

6. Stromaufzeichnung der gesamten Zelle mit einem Zwei-Elektroden-Spannungsklemmensystem (Abbildung 2)

  1. Vor der Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Aufzeichnung lösen Sie die einzelnen Odorierverbindungen in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf, um eine Reihe von Stammlösungen (100 μg/μL) zu erhalten. Verdünnen Sie diese Stammlösungen mit 1x ND96-Puffer (91 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2,2H 2O, 2 mM MgCl 2,6H2O, 5 mM HEPES-Natriumsalz, pH 7,6) 1000-fach, um einen Satz Arbeitslösungen (0,1 μg/μL) zu erhalten.
  2. Stellen Sie sicher, dass alles auf dem TMC-Schwingungsisolationstisch, einschließlich der Metallabschirmung, des Mikroskops, der Lichtquelle und der Abfallpumpe, sorgfältig geerdet ist, um die Auswirkungen von externem elektrischem Rauschen auf die Signalaufzeichnung der gesamten Zelle zu reduzieren.
  3. Bereiten Sie Mikroelektroden vor, indem Sie eine Glaskapillare (1,20 mm AD x 0,94 mm ID, Länge = 750 mm) mit einem Mikrorohrabzieher ziehen (Hitze = 525, Zug = 50, Geschwindigkeit = 50, Zeit = 250). Füllen Sie die Kapillaren mit 3 M KCl. Chloridisieren Sie die Ag/AgCl-Drähte für 2-5 min in 10%iger Chlorbleiche, bis sie eine dunkelgraue Farbe annehmen (hellgraue Ag/AgCl-Drähte müssen chloriert werden).
  4. Schalten Sie das Gerät ein, indem Sie die Eizellklemme und den Digidata-Digitalisierer einschalten (Abbildung 3A). Öffnen Sie die Software (z. B. Clampex 10.3) und klicken Sie auf die Schaltfläche Aufnahme . Schalten Sie den Schalter für den 1x ND96-Puffer (Abschnitt 6.1) und die Pumpe für den Abfallpuffer ein.
  5. Führen Sie einen Vortest durch, indem Sie Mikroelektroden in den fließenden Puffer einführen und dann die Tasten V m Elektrodentest und Ve Elektrodentest drücken, um den Widerstand der Mikroelektroden zu überprüfen. Vm sollte < 40 mV und Ve < 40 μA betragen. Schalten Sie den 1x ND96 Pufferfluss (Abschnitt 6.1) und die Abfallpumpe nach dem Vortest ab.
  6. Legen Sie jede Eizelle in die mit 1x ND96-Puffer gefüllte Perfusionskammer (Abbildung 2) (Abschnitt 6.1) und positionieren Sie die Eizellen vorsichtig mit den Pflanzenpolen nach oben, wobei die Glasraupe nach oben zeigt. Führen Sie die Elektroden langsam in die Eizelle ein (Abbildung 3B). Stellen Sie den Parameter Vm auf 0 und dann den Parameter Ve auf 0 ein. Ändern Sie die Klemmtaste von OFF auf FAST. Stellen Sie die Gain-Taste auf ~ -80 mV ein.
  7. Überprüfen Sie den Wert von Ve, der konstant sein sollte. Ist dies nicht der Fall, ist mindestens eine der beiden Mikroelektroden undicht. Ersetzen Sie in diesem Fall defekte Komponenten durch neue Kapillaren.
  8. Zeichnen Sie die Ganzzellströme der injizierten Eizellen mit einer Eizellklemme bei einem Haltepotential von ~-80 mV auf (Abbildung 2).
  9. Führen Sie Datenerfassung und -analyse durch.
    1. Nehmen Sie den Fluss des 1x ND96-Puffers wieder auf (Abschnitt 6.1) und schalten Sie die Abfallpumpe ein.
    2. Odorierlösungsauftrag über das Perfusionssystem: Schalten Sie den 1x ND96-Puffer (Abschnitt 6.1) aus und lassen Sie die Odorierlösung 10 Sekunden lang fließen. Nehmen Sie dann den Spitzenwert auf. Um die Reaktion des OR auf den Prüfodorstoff zu erhalten, subtrahieren Sie den Ausgangswert vom Spitzenwert.
    3. Stoppen Sie den Fluss der Odorierlösung und wechseln Sie auf den 1x ND96-Puffer (Abschnitt 6.1). Waschen Sie die Eizelle mit dem Puffer, bis sich die aktuelle Spur von der vorherigen Geruchsstimulation erholt hat. Die Eizelle ist dann bereit für die Stimulation durch eine weitere Odorierlösung. Im Allgemeinen kann eine Eizelle verwendet werden, um 20-30 chemische Stimulationen zu erkennen.
      HINWEIS: Bei der Prüfung der konzentrationsabhängigen Reaktion sollte immer zuerst die niedrigste Konzentration angewendet werden, bevor zu den höheren Konzentrationen übergegangen wird.

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Ergebnisse

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Mit Hilfe der Single Sensillum Recording (SSR)-Technik haben wir kürzlich menschliche Geruchsstoffe lokalisiert, von denen angenommen wird, dass sie für das Wirtssuchverhalten von Ae. aegypti wichtig sind8. Der molekulare Mechanismus, der den Prozess der Wahrnehmung menschlicher Geruchsstoffe im peripheren sensorischen System von Ae. aegypti antreibt, ist jedoch unbekannt. ORs spielen bei den meisten Insekten eine wichtige Rolle bei der Detektion von Geruc...

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Diskussion

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TEVC ist eine klassische Technik, die häufig verwendet wird, um die Funktion von Membranrezeptoren zu untersuchen. Obwohl bereits ein detailliertes Protokoll veröffentlicht wurde43 , das eine beträchtliche Ähnlichkeit mit dem hier vorgestellten Verfahren aufweist, führt die hier vorgeschlagene Methode einige wichtige Änderungen ein. Zum Beispiel werden hier die cRNA sowohl von OR als auch von Orco unmittelbar nach der Synthese vorgemischt und in kleinvolumige Prob...

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Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Projekt wurde durch eine Auszeichnung der Alabama Agricultural Experiment Station (AAES) Multistate/Hatch Grants ALA08-045, ALA015-1-10026 und ALA015-1-16009 an N.L. unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
24-Well-ZellkulturplatteCytoOneCC7682-7524Wird für die Eizellkultur
verwendet Afrikanischer KrallenfroschNascoLM00535Wird zur Gewinnung von Xenopus-Eizellen
verwendet Ag/AgCl-DrahtelektrodeWarner Instruments64-1282Wird für Mikroelektroden
verwendet Clampex 10.3AxonN.A.Wird für die Signalaufzeichnung verwendet
Klemme 10.3Axon Instruments Inc.N.A.Wird für die Datenanalyse verwendet
Kollagenase BSigma11088815001Wird für den Eizellverdau
verwendet Digidata DigitizerAxon CNSDigidata 1440AWird für die Datenerfassung
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini KitOmegaD6942-01Wird für die Plasmidvorbereitung verwendet
Ethyl-M-aminobenzoat, MethansulfonatsalzSigma886-86-2Wird zur Betäubung von Fröschen
verwendet Glas KapillareFHC30-30-1Wird für Mikroinjektionen
verwendet GlaskapillareWarner Instruments64-0801Wird zur Vorbereitung von Mikroelektroden
GyroMini Nutating MixerLabnetS0500Wird für den Eizellverdau
verwendet InsektenwachstumskammernCaron Productsmodel 6025Wird für die Inkubation von Eizellen
verwendet Leica MikroskopLeicaS6 DWird zum Schneiden von Moskitoantennen
verwendet LichtquelleSchottA20500Bereitstellung von Lichtquellen für die Beobachtung
MagnetstativNarishigeGJ-1Wird verwendet, um die Referenzelektrode
zu halten MikromanipulatorLeica115378Wird für kleinere Bewegungen der Elektrode
verwendet MikrorohrabzieherSutterModell P-97Wird verwendet, um Kapillaren zu ziehen
Mikropipetten-AnfaserSutterModell BV-10Wird zum Schärfen von Kapillaren
verwendet mMESSAGE mMACHINE T7 kitInvitrogenAM1344Wird für die Synthese von cRNA
verwendet Nanoject II Auto-Nanoliter-InjektorDrummond3-000-204Wird für die Mikroinjektion verwendet
Oligo d(T)20-geprimt SuperScript IV Erststrang-SynthesesystemInvitrogen18091050Verwendet für Synthese von cDNA
Olympus MikroskopOlympusSZ61Wird für die Mikroinjektion
verwendet One Shot TOP10 Chemisch kompetente E. coli-Zellen InvitrogenC404003Wird für die Transformation
verwendet EizellklemmenverstärkerWarner InstrumentsModell OC-725CWird für TEVC-Aufzeichnungen
verwendet QIAquick Gel-ExtraktionskitQiagen28704Wird für Gel verwendet Reinigung
TMC SchwingungsisolationstischTMC63-500Wird zur Isolierung der Schwingung von der Ausrüstung
verwendet TURBO DNA-freies KitInvitrogenAM1907Wird verwendet, um DNase und andere Ionen in RNA zu entfernen
verwendet

Referenzen

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  1. Cardé, R. T. Multi-cue integration: how female mosquitoes locate a human host. Current Biology. 25 (18), 793-795 (2015).
  2. McBride, C. S., et al. Evolution of mosquito preference for humans linked to an odorant receptor. Nature. 515 (7526), 222-227 (2014).
  3. Bernier, U. R., Kline, D. L., Barnard, D. R., Schreck, C. E., Yost, R. A. Analysis of human skin emanations by gas chromatography/mass spectrometry. 2. Identification of volatile compounds that are candidate attractants for the yellow fever mosquito (Aedes aegypti). Analytical Chemistry. 72 (4), 747-756 (2000).
  4. Bernier, U. R., Kline, D. L., Schreck, C. E., Yost, R. A., Barnard, D. R. Chemical analysis of human skin emanations: comparison of volatiles from humans that differ in attraction of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of the American Mosquito Control Association. 18 (3), 186-195 (2002).
  5. Bernier, U. R., et al. Synergistic attraction of Aedes aegypti (L.) to binary blends of L-lactic acid and acetone, dichloromethane, or dimethyl disulfide. Journal of Medical Entomology. 40 (5), 653-656 (2003).
  6. Bernier, U. R., Kline, D. L., Allan, S. A., Barnard, D. R. Laboratory studies of Aedes aegypti attraction to ketones, sulfides, and primary chloroalkanes tested alone and in combination with L-lactic acid. Journal of the American Mosquito Control Association. 31 (1), 63-70 (2015).
  7. Okumu, F. O., et al. Development and field evaluation of a synthetic mosquito lure that is more attractive than humans. PloS one. 5 (1), 8951(2010).
  8. Chen, Z., Liu, F., Liu, N. Human odour coding in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Scientific Reports. 9 (1), 1-12 (2019).
  9. Hansson, B. S., Stensmyr, M. C. Evolution of insect olfaction. Neuron. 72 (5), 698-711 (2011).
  10. Nakagawa, T., Sakurai, T., Nishioka, T., Touhara, K. Insect sex-pheromone signals mediated by specific combinations of olfactory receptors. Science. 307 (5715), 1638-1642 (2005).
  11. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  12. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7285), 66-71 (2010).
  13. Liu, F., Xiong, C., Liu, N. Chemoreception to aggregation pheromones in the common bed bug, Cimex lectularius. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 82, 62-73 (2017).
  14. Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4418-4423 (2010).
  15. Matthews, B. J., et al. Improved reference genome of Aedes aegypti informs arbovirus vector control. Nature. 563 (7732), 501-507 (2018).
  16. Costa, A. C., Patrick, J. W., Dani, J. A. Improved technique for studying ion channels expressed in Xenopus oocytes, including fast superfusion. Biophysical Journal. 67 (1), 395-401 (1994).
  17. Schreibmayer, W., Lester, H. A., Dascal, N. Voltage clamping of Xenopus laevis oocytes utilizing agarose-cushion electrodes. Pflügers Archiv. 426 (5), 453-458 (1994).
  18. Lu, T., et al. Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Current Biology. 17 (18), 1533-1544 (2007).
  19. Ditzen, M., Pellegrino, M., Vosshall, L. B. Insect odorant receptors are molecular targets of the insect repellent DEET. Science. 319 (5871), 1838-1842 (2008).
  20. Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
  21. Xia, Y., et al. The molecular and cellular basis of olfactory-driven behavior in Anopheles gambiae larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (17), 6433-6438 (2008).
  22. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Characterization of an enantioselective odorant receptor in the yellow fever mosquito Aedes aegypti. PLoS One. 4 (9), 7032(2009).
  23. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Insect repellents: modulators of mosquito odorant receptor activity. PLoS One. 5 (8), 12138(2010).
  24. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Odorant receptor modulation: ternary paradigm for mode of action of insect repellents. Neuropharmacology. 62 (5-6), 2086-2095 (2012).
  25. Hughes, D. T., Pelletier, J., Luetje, C. W., Leal, W. S. Odorant receptor from the southern house mosquito narrowly tuned to the oviposition attractant skatole. Journal of Chemical Ecology. 36 (8), 797-800 (2010).
  26. Pelletier, J., Hughes, D. T., Luetje, C. W., Leal, W. S. An odorant receptor from the southern house mosquito Culex pipiens quinquefasciatus sensitive to oviposition attractants. PloS one. 5 (4), 10090(2010).
  27. Bohbot, J. D., et al. Multiple activities of insect repellents on odorant receptors in mosquitoes. Medical and Veterinary Entomology. 25 (4), 436-444 (2011).
  28. Bohbot, J. D., et al. Conservation of indole responsive odorant receptors in mosquitoes reveals an ancient olfactory trait. Chemical Senses. 36 (2), 149-160 (2011).
  29. Leal, W. S., Choo, Y. M., Xu, P., da Silva, C. S., Ueira-Vieira, C. Differential expression of olfactory genes in the southern house mosquito and insights into unique odorant receptor gene isoforms. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (46), 18704-18709 (2013).
  30. Liu, F., Chen, Z., Liu, N. Molecular basis of olfactory chemoreception in the common bed bug, Cimex lectularius. Scientific Reports. 7, 45531(2017).
  31. Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
  32. Ruel, D. M., Yakir, E., Bohbot, J. D. Supersensitive odorant receptor underscores pleiotropic roles of indoles in mosquito ecology. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 533(2019).
  33. Xu, P., Choo, Y. M., De La Rosa, A., Leal, W. S. Mosquito odorant receptor for DEET and methyl jasmonate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16592-16597 (2014).
  34. Xu, P., et al. Odorant inhibition in mosquito olfaction. iScience. 19, 25-38 (2019).
  35. Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
  36. DeGennaro, M., et al. orco mutant mosquitoes lose strong preference for humans and are not repelled by volatile DEET. Nature. 498 (7455), 487-491 (2013).
  37. Koutroumpa, F. A., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6, 29620(2016).
  38. Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method. Journal of Visualized Experiments. (45), e1864(2010).
  39. Missbach, C., et al. Evolution of insect olfactory receptors. ELife. 3, 02115(2014).
  40. Jones, P. L., Pask, G. M., Rinker, D. C., Zwiebel, L. J. Functional agonism of insect odorant receptor ion channels. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (21), 8821-8825 (2011).
  41. Butterwick, J. A., et al. Cryo-EM structure of the insect olfactory receptor Orco. Nature. 560 (7719), 447-452 (2018).
  42. Missbach, C., et al. Evolution of insect olfactory receptors. ELife. 3, 02115(2014).
  43. Nakagawa, T., Touhara, K. Functional assays for insect olfactory receptors in Xenopus oocytes. Pheromone signaling. , Humana Press. Totowa, NJ. 107-119 (2013).
  44. Dobritsa, A. A., Van Naters, W., Warr, C. G., Steinbrecht, R. A., Carlson, J. R. Integrating the molecular and cellular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 37 (5), 827-841 (2003).

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