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Lymph- und Blutnetzwerkanalyse bei Adipositas

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DOI:

10.3791/61814

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19. November 2020

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1Department of Pathology and Immunology, Washington University School of Medicine, 2Université Côte d'Azur, 3Mediterranean Center of Molecular Medicine C3M, Team 13, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) UMR1065, 4Mediterranean Center of Molecular Medicine C3M, Team 7, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) UMR1065

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Fettleibigkeit ist ein wachsendes globales Problem für die öffentliche Gesundheit. Sie wurde bereits früher mit lymphatischer Dysfunktion in Verbindung gebracht, was auf eine vitale Wechselwirkung zwischen dem Fettgewebe und dem Lymphsystem hindeutet. Hier schlagen wir eine zugängliche Methodik vor, die es ermöglicht, Blut- und Lymphgefäße innerhalb des subkutanen Fettgewebes eindeutig zu markieren.

Zusammenfassung

Lymphsammelgefäße und Lymphknoten sind zwangsläufig in das Fettgewebe eingebettet. Die physiologische Bedeutung dieser Beobachtung ist bis heute nicht geklärt. Adipositas ist jedoch durch eine gestörte Lymphfunktion und eine erhöhte Gefäßpermeabilität gekennzeichnet. Umgekehrt induziert eine lymphatische Dysfunktion bei Mäusen Fettleibigkeit, was auf ein signifikantes Zusammenspiel zwischen Lymphgefäßen und dem Fettgewebe hindeutet. Daher könnte das Verständnis von Faktoren, die zu lymphatischer Dysfunktion führen, neue therapeutische Fenster öffnen, um Adipositas und damit verbundene Komorbiditäten zu verhindern. Der erste Schritt in diesem Prozess erfordert eine genaue und detaillierte Visualisierung des lymphatischen Netzwerks in gesundem und entzündetem Fettgewebe. Hier beschreiben wir eine schnelle, kostengünstige und effiziente Methode, die es ermöglicht, Lymph- und Blutgefäße zu markieren und zu analysieren. Dieser Ansatz nutzt die Vorteile der hautdrainierenden Lokalisation der brachialen Lymphknoten innerhalb des subkutanen Fettgewebes. Die lymphatische Arborisierung dieses Gewebes kann durch subkutane Injektion von Fluorochrom-konjugierten Lektinen aufgedeckt werden. Darüber hinaus bietet der In-vivo-Markierungsansatz eine Möglichkeit, die Dichte und Funktion der Lymphgefäße zu bewerten. In Verbindung mit der Färbung von Blutgefäßen, Adipozyten und Immunzellen ermöglicht das Protokoll eine hochauflösende Kartierung des subkutanen Fettgewebes durch 3D-Bildgebung.

Einleitung

Das lymphatische Kreislaufsystem spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase und der Induktion effizienter Immunantworten. Lymphgefäße verlaufen parallel zu den Blutgefäßen und transportieren interstitielle Flüssigkeit, Metaboliten und Immunzellen zum lokalen drainierenden Lymphknoten (LN) und schließlich zum venösen Kreislauf1. Eine dysfunktionale Lymphdrainage wurde bei Infektionen, Entzündungen und Stoffwechselerkrankungen beobachtet 2,3,4,5. Das lymphatische Gefäßsystem besteht aus kleinen Gefäßen, die als Lymphkapillaren bezeichnet werden. Lymphkapillaren bestehen aus einer einzigen Schicht dünner lymphatischer Endothelzellen (LECs), die durch offene Verbindungen ("knopfähnliche" Verbindungen) gekennzeichnet sind, die den Eintritt von interstitieller Flüssigkeit, Metaboliten und Immunzellen, hauptsächlich dendritischen Zellen (DCs) und T-Zellen, in das lymphatische Kapillarlumen erleichtern5. Lymphkapillaren verschmelzen zu größeren Gefäßen, die als lymphatische Sammelgefäße bezeichnet werden. Lymphkollektoren zeichnen sich durch eine Schicht von LECs aus, die von einer Muskelschicht umgeben sind, die einen autonomen kontraktilen Tonus bereitstellt und den Flüssigkeitsfluss aufrechterhält5. Darüber hinaus verfügen Auffanggefäße über Ventile, die einen unidirektionalen Lymphfluss gewährleisten.

Die LECs von Kollektoren und Kapillaren exprimieren einen spezifischen Satz von Markern, die sie von Blutendothelzellen (BECs) unterscheiden. Unter diesen Faktoren ist Prox1 ein Transkriptionsfaktor, der die LECs-Bildung steuert und in LECs stark exprimiert wird, während er in BECs nicht vorhanden ist. Die entscheidende Beteiligung von Prox1 an der Biologie der LECs wurde durch die Erzeugung und Analyse von Prox1-defizienten Mäusen veranschaulicht6. Prox1-heterozygote Mäuse haben eine defekte lymphatische Gefäßentwicklung, die durch eine verminderte Lymphgefäßdichte und eine erhöhte Gefäßpermeabilität gekennzeichnet ist6. LECs exprimieren stark VEGFR3, Podoplanin und CCL215. Diese Marker sind auf BECs nicht zu finden und ermöglichen es, das Netzwerk von Lymph- und Blutgefäßen getrennt zu analysieren. Lyve1 wird selektiv von lymphatischen Kapillaren exprimiert, während es an Sammelgefäßen fehlt5.

Es wurden drei Arten von Fettgewebe beschrieben, die auf ihrem mitochondrialen Gehalt und der anschließenden Farbe basieren. Mitochondrienreiches thermogenes braunes Fettgewebe spielt eine Schlüsselrolle bei Kälteexposition und befindet sich bei Mäusen im interscapularen Bereich 7,8. Weiße und beige Adipozyten haben eine geringere mitochondriale Dichte und sind hauptsächlich an der Energiespeicherung in Form von Lipidtröpfchen beteiligt. Weiße und beige Adipozyten befinden sich in viszeralen und subkutanen Depots9.

Klinische Beobachtungen stellten einen Zusammenhang zwischen Adipositas und lymphatischer Dysfunktionher 10. Adipositas führt zu morphologischen Veränderungen des Fettgewebes, der lymphatischen Gefäße und führt zu einer Beeinträchtigung des Lymphtransports11. Daten, die in präklinischen Modellen gewonnen wurden, zeigten, dass eine fettreiche Diät (HFD) einen lymphatischen Umbau induziert und adipöse Mäuse kleinere Lymphknoten und eine geringere Anzahl von Lymphgefäßen haben12. Die genauen molekularen Mechanismen, die diesem Phänotyp zugrunde liegen, müssen jedoch noch aufgeklärt werden. Die Beteiligung von LECs bei Adipositas wird durch Beobachtungen in genetischen Modellen mit gestörter lymphatischer Gefäßentwicklung weiter unterstützt. Wie bereits erwähnt, weisen Prox1-heterozygote Mäuse (Prox1+/-) ein schlecht funktionierendes lymphatisches System auf und entwickeln zufällig eine übermäßige Ansammlung von viszeralem Fettgewebe im Vergleich zu Prox1-ausreichenden Tieren6. Interessanterweise wird dieser Fettgewebsphänotyp durch die Wiederherstellung der lymphatischen Funktion gerettet13. Zusammengenommen haben diese Ergebnisse starke Verbindungen zwischen den Lymphgefäßen und dem Fettgewebe ans Licht gebracht, die weiter untersucht werden müssen.

Im Zusammenhang mit Entzündungen, einem Kennzeichen von Adipositas, beeinträchtigt die veränderte Expression von LEC- und BEC-Markern die Analyse dieser Zellen mittels klassischer Antikörperfärbung14,15. Genetische Modelle zur spezifischen Markierung von LECs und BECs wurden entwickelt und ermöglichen es, dieses Problem zu lindern 16,17,18,19. Die Verwendung genetischer Reporterlinien erfordert jedoch mehrere Züchtungsschritte und erhöht die Länge und die Kosten eines Projekts erheblich. Daher schlagen wir vor, Fluorochrom-konjugierte Lektin-Injektionen zur Untersuchung des Blut- und Lymphkreislaufsystems im subkutanen Fettgewebe zu verwenden, ein einfacher und relativ kostengünstiger Ansatz. Lektin, das an verschiedene Fluorochrome konjugiert ist, ist kommerziell erhältlich und kann intravenös injiziert werden, um Blutgefäße zu markieren, oder subkutan, um die hautdrainierenden Lymphgefäße zu markieren, die in das subkutane Fettgewebe eingebettet sind. Dieser Ansatz beruht auf der Verwendung separater Fluorochrom-Lektin-Konjugate für jede Injektion und ermöglicht die unterschiedliche Markierung jedes Gefäßsystems. Diese Methode ist auch kompatibel mit der Verwendung genetischer Modelle zur Markierung des Lymph- oder Blutgefäßnetzwerks. Wichtig ist, dass es mehrere Messwerte liefert, um den allgemeinen Gesundheitszustand des subkutanen Fettgewebes und der Blut- und Lymphgefäße, die es durchbluten, zu analysieren. Dieses Verfahren könnte leicht angewendet werden, um die Lymph- und Blutgefäßnetzwerke bei akuten und chronischen Hauterkrankungen wie Psoriasis und Infektionen zu analysieren.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den lokalen Ethikkommissionen durchgeführt.

HINWEIS: Prox1-cre-ERT2 (Prox1tm3(cre/ERT2)Gco/J, Jax #022075) und Rosa26-LSL-tdTomate (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J, Ai9, Jax #007914) wurden aus dem Jackson Laboratory gewonnen und gekreuzt, um die induzierbare lymphatische Reporter-Mauslinie Prox1-cre-ERT2::tdTomato zu erhalten. Die Mäuse wurden 10 Generationen lang auf den Hintergrund von C57BL/6 rückgekreuzt. Sechs Wochen alte männliche Prox1-cre-ERT2::tdTomato-Mäuse erhielten 3 Wochen lang Tamoxifen-Diät. Tamoxifen Diät von Envigo Teklad (Diät-Nr. TD.130857; 500 mg/kg) verwendet. Die Experimente wurden an 12-14 Wochen alten Mäusen durchgeführt. Dieses Protokoll gilt für Mäuse jeden Alters, Geschlechts und Stammes.

1. Materialvorbereitung

  1. Sterilisieren Sie Scheren, Pinzetten und Präpariernadeln mit 70% Ethanol.
  2. Bereiten Sie zwei 1-ml-Spritzen mit 25- bis 27-Gauge-Nadeln vor. Für die subkutane Injektion empfehlen wir die Verwendung einer Mikrospritze, um 10 μl in das obere Fußpolster zu injizieren.
  3. Bereiten Sie in einem 1,5-ml-Kunststoffröhrchen 200 μl DyLight 488-konjugiertes Lektin in sterilem PBS bei einer Endkonzentration von 100 μg/ml vor.
  4. In einem anderen Kunststoff-Röhrchen werden 1,5 ml 100 μl DyLight 649-konjugiertes Lektin hergestellt, das in sterilem PBS bei einer Endkonzentration von 100 μg/ml verdünnt ist.
  5. Bereiten Sie eine 6-Well-Platte mit PBS vor und stellen Sie sie auf Eis.
  6. Bereiten Sie eine Lösung aus 4 % Paraformaldehyd und 30 % Saccharose vor.

2. Markierung von subkutanem Fettgewebe, Blut und Lymphgefäßen.

  1. Betäuben Sie die Maus durch Inhalation von 5% Isofluran. Beurteilen Sie die Narkosetiefe, indem Sie die Pfote des Tieres fest einklemmen, um sicherzustellen, dass das Tier während des Eingriffs nicht verletzt wird. Die Anästhesie sollte bis zum Ende der Lektininjektionsschritte oder bis zur Euthanasie aufrechterhalten werden.
  2. Injizieren Sie 100 μl DyLight 488-konjugiertes Lektin intravenös in die Schwanzvene, um das Blutgefäßsystem zu markieren. Warten Sie 15 Minuten, bevor Sie mit der Gewebeentnahme fortfahren.
  3. Injizieren Sie mit einer anderen Spritze 10 μl DyLight 649-konjugiertes Lektin subkutan auf den oberen Fußballen des Tieres, um die drainierenden Lymphgefäße zu markieren. Warten Sie 15 Minuten, bevor Sie mit der Gewebeentnahme fortfahren.
  4. Euthanasieren Sie die Maus durch Gebärmutterhalsluxation oder Exposition gegenüber CO2 15 Minuten nach der Injektion.

3. Entnahme von subkutanem Fettgewebe

  1. Lege die Maus auf den Rücken auf ein Sezierbrett.
  2. Sterilisieren Sie das Fell der Maus mit 70% Ethanol.
  3. Heben Sie die Haut der Flanke mit einer Pinzette an und machen Sie einen Querschnitt, um das brachiale Fettpolster freizulegen.
  4. Ziehen Sie vorsichtig an der Haut, um sie vom Depot des brachialen Fettgewebes zu lösen, wodurch das gesamte subkutane brachiale Fettgewebe mit dem Lymphknoten und dem lymphatischen Sammelgefäß zum Vorschein kommt.
  5. Entfernen Sie mit Pinzette und Schere vorsichtig die subkutanen Fettdepots und geben Sie sie in eine Schale mit kaltem PBS. Für ein optimales Ergebnis empfehlen wir, die Fettdepots in einem Stück zu entfernen.
  6. Schützen Sie das Gewebe von nun an vor Licht.

4. Fixierung des Gewebes

  1. Tauchen Sie das entnommene Gewebe in eine Lösung, die 4 % Paraformaldehyd und 30 % Saccharose enthält.
  2. Inkubieren Sie das Gewebe mindestens über Nacht in dieser Lösung, bevor Sie es für die Bildgebung vorbereiten.

5. Färben und Bildgebung

  1. Für optimale Ergebnisse führen Sie eine Gewebereinigung und eine konfokale 3D-Erfassung durch, wie von Gilleron und Kollegenbeschrieben 20. Wir empfehlen die Verwendung eines Lichtblattmikroskops für die Analyse von großen Geweben. Während des Reinigungsprozesses kann eine zusätzliche Färbung durchgeführt werden.
  2. Um eine optimale Gewebekartierung zu erreichen, verwenden Sie die folgenden Antikörper:
    Für Adipozyten: Perilipin
    Für Makrophagen: CD68- und CD11b-Färbung.
    Für dendritische Zellen: MHC II und CD11b.
    Für B-Zellen: B220 (CD45R) Färbung.
    Für T-Zellen: CD3-Färbung.
    HINWEIS: Diese Methode ist kompatibel mit der Verwendung genetischer Modelle zur Markierung von Immunzellen.
  3. Für die Analyse des lymphatischen Auffanggefäßes mittels intravitaler 2-Photonen-Mikroskopie wird das Lektin subkutan in den unteren Fußballen injiziert und das popliteale Lymphsammelgefäß sichtbar gemacht.

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Ergebnisse

Um eine topologische Analyse des Blutes des brachialen Fettgewebes und der Lymphgefäßnetzwerke durchzuführen, injizierten wir subkutan Alexa Fluor 649-konjugiertes Lektin und intravenös Alexa Fluor 488-konjugiertes Lektin. Das brachiale Fettgewebe wurde sorgfältig exzidiert, fixiert, einem Clearing-Protokoll unterzogen und durch Whole-Mount-Färbung analysiert. Eine schematische Darstellung des Verfahrens ist in Abbildung 1A enthalten. Die Blutgefäße sind grün und die Lymphgefäße rot markiert...

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Diskussion

Dieser Ansatz ermöglicht eine effiziente und robuste Markierung des Blutes und der lymphatischen Gefäße des subkutanen Fettgewebes. Die getrennte Analyse von Blut- und lymphatischen Endothelnetzwerken könnte pathologische Mechanismen aufdecken, die eines oder beide des Kreislaufsystems bei Adipositas oder anderen pathologischen Zuständen betreffen. Ziel dieses Protokolls ist es, die Architektur der Gefäßsysteme, ihre Interaktion mit Stroma- und Immunzellen und ihre Funktionalität bei Ges...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Offenlegung und keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Danksagungen

SI wird unterstützt vom Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) und der Agence Nationale de la Recherche (ANR-17-CE14-0017-01 und ANR-19-ECVD-0005-01). AG wird von der französischen Regierung im Rahmen der UCAJedi-Projekte "Investitionen in die Zukunft" unterstützt, die von der Nationalen Forschungsagentur (ANR) unter der Referenznummer ANR-15-IDEX-01 verwaltet werden. RSC wird unterstützt durch FA-2020-01-IBD-1 vom Lawrence C. Pakula, MD IBD Education & Innovation Fund".

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Lectin DyLight 649Vector LabsDL-1178-1Beschrieben im Protokoll
Lectin DyLight 488Vector LabsDL-1174Beschrieben im Protokoll
ParaformaldehydVWR Chemicals9713.1000
SaccharoseEuromedexCAS-Nummer 57-50-1
Anti-PodoplaninAngioBio11-033Verdünnung : 1/50
Lectin DyLight 594Vector LabsDL-1177Beschrieben im Protokoll
Anti-MHCII (Klon M5/114.15.2)Biolegend107618Verdünnung : 1/100
Anti-CD11b (Klon M1/70)Biolegend101218Verdünnung : 1/100
Anti-CD68 (Klon FA.11)Biolegend137004Verdünnung : 1/100
Anti-B220 (Klon RA3-6B2)Biolegend103225Verdünnung : 1/100
Anti-Perilipin (Klon PERI 112.17)Progen651156Verdünnung : 1/50
Anti-CD3 (Klon 17A2)Biolegend100210Verdünnung : 1/100

Referenzen

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Lymphgef eBlutgef eFettgewebesubkutanes FettgewebeLymphknotenlokalisationfluorochrom konjugierte Lektine3D BildgebungGef dichteanalyseAdipositasmodellLymphfunktion
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