Eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode für Rattenhirngewebe

Summary

Hier stellen wir eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode vor, die es ermöglicht, Zielmoleküle als Teil intakter Gehirnstrukturen zu betrachten. Diese Technik wurde nun für die F344/N-Kontrolle und HIV-1 transgene Ratten beiderlei Geschlechts validiert.

Abstract

Hydrophobe Gewebereinigungsmethoden sind leicht einstellbare, schnelle und kostengünstige Verfahren, die die Untersuchung eines Moleküls von Interesse in unveränderten Gewebeproben ermöglichen. Herkömmliche Immunmarkierungsverfahren erfordern das Schneiden der Probe in dünne Abschnitte, was die Fähigkeit einschränkt, intakte Strukturen zu kennzeichnen und zu untersuchen. Wenn jedoch Hirngewebe während der Verarbeitung intakt bleiben kann, können Strukturen und Schaltkreise für die Analyse intakt bleiben. Zuvor etablierte Clearing-Methoden brauchen viel Zeit, um das Gewebe vollständig zu reinigen, und die aggressiven Chemikalien können oft empfindliche Antikörper schädigen. Die iDISCO-Methode räumt Gewebe schnell und vollständig, ist mit vielen Antikörpern kompatibel und erfordert keine spezielle Laborausrüstung. Diese Technik wurde ursprünglich für den Einsatz in Mäusegewebe validiert, aber das aktuelle Protokoll passt diese Methode an die Abbildung von Hemisphären von Kontroll- und transgenen Rattengehirnen an. Darüber hinaus nimmt das vorliegende Protokoll auch mehrere Anpassungen am bereits vorhandenen Protokoll vor, um klarere Bilder mit weniger Hintergrundflecken zu liefern. Antikörper gegen Iba-1 und Tyrosinhydroxylase wurden bei der transgenen HIV-1-Ratte und bei F344/N-Kontrollratten mit der vorliegenden hydrophoben Gewebereinigungsmethode validiert. Das Gehirn ist ein verwobenes Netzwerk, in dem Strukturen häufiger zusammenarbeiten als getrennt voneinander. Die Analyse des Gehirns als Gesamtsystem im Gegensatz zu einer Kombination einzelner Teile ist der größte Vorteil dieser gesamten Gehirnreinigungsmethode.

Introduction

Mehrere Gewebereinigungstechniken wurden für den Einsatz im Gehirn validiert: Hydrogel, hydrophil und hydrophob. Diese Techniken zielen darauf ab, ein Gewebe durch Entgiftung, Entfärbung und Entkalkung durch die Verabreichung von Lösungsmitteln transparent zu machen. Sobald der Brechungsindex der Gewebeprobe mit dem Brechungsindex des gewählten Bildgebungsmediums übereinstimmt, kann ein klares Bild der Probe erhalten werden. Hydrogel-basierte Techniken wie CLARITY sichern Biomoleküle im Gewebe, indem sie mit Hydrogelen auf Acrylbasis verbunden werden, was strukturelle Schäden und den Verlust von Proteinen verhindert¹. Hydrogel-Techniken verwend....

Protocol

Alle Tierprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der University of South Carolina überprüft und genehmigt.

1. Vorbereitung der Lagerlösung

1. Lösung 1 (1 L): Zu 900 ml entionisiertem_H2Owerden 100 mL 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 2 ml Triton X-100 hinzugefügt.
2. Lösung 2 (1 L): Zu 900 ml entionisiertem_H2Owerden 100 ml 10x PBS, 2 ml Tween-20 und 1 ml 10 mg/ml Heparin-Stammlösung hinzugefügt.
3. Lösung 3 (500 ml): Zu 400 ml Lösung 11,5 g Glycin und 100 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzufügen.
4. Lösung 4 (50 ml): Zu 42 ml Lösung 1 werden 3 ml entsprechendes Serum un....

Results

Die vollständige Beseitigung großer Abschnitte von F344/N- und HIV-1-Rattenhirngewebe wurde mit diesem modifizierten hydrophoben Gewebereinigungsprotokoll erreicht. Abbildung 1 zeigt ein typisches konfokales Bild für TH im Bereich substantia nigra. Abbildung 1A stellt eine dichte, positive Färbung dar. Dichte Bereiche wie diese können durch Fokussierung durch die "Z" -Ebene analysiert werden, um eine positive Färbung und die richtige Zellmorphologie zu bestätige.......

Discussion

Tissue Clearing bietet eine Lösung für die Einschränkungen des traditionellen IHC-Protokolls. Eine transparente Probe minimiert die Streuung und Absorption von Licht, was auf zellulärer Ebene einen optischen Zugang zu intaktem Gewebe^{bietet 18,19}. Gewebereinigungstechniken machen ein Gewebe durch Entgiftung, Entfärbung und Entkalkung mit der Verabreichung von Lösungsmitteln transparent. Sobald der Brechungsindex der Gewebeprobe mit dem Brechungsindex des gewählten.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Choleratoxin Untereinheit B (rekombinant), Alexa Fluor 488	Invitrogen	C34775
DBE	Sigma-Aldrich	108014-1KG
	DCM Sigma-Aldrich	270997-100mL
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-1L
Glycin	Fisher Chemical	G46-500
Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor Plus 647	Invitrogen	A32733
Ziegenserum	Sigma Life Science	G9023-10mL
Heparin	Acros Organics	41121-0010
Iba1 primärer Antikörper	FUJIFILM Wako	019-19741
Kwik-sil Epoxid	VWR	70730-062
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1l-R
PBS	Fisher Bioreagents	BP2944-100
Perfusionsmaschine	VWR	70730-062	Minipumpe mit variablem Durchfluss
PFA	Sigma-Aldrich	158127-3KG
TH Primärantikörper	Millipore Sigma	AB152
TritonX-100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Tween-20	Fisher Bioreagents	Nr. BP337-500