Summary
환경 DNA 분석법은 현장 데이터 수집이 시작되기 전에 엄격한 설계, 테스트, 최적화 및 검증이 필요합니다. 여기서, 우리는 환경 샘플에서 표적 종 DNA의 검출 및 정량화를 위한 종별, 프로브 기반 qPCR 분석의 각 단계를 통해 사용자를 취할 프로토콜을 제시한다.
Abstract
수산 및 야생 동물 보호 관리를 돕기 위해 종의 존재를 감지하고 모니터링하기위한 새로운 비침습적 방법이 개발되고 있습니다. macrobiota를 검출하기 위한 환경 DNA(eDNA) 샘플의 사용은 급속히 인기를 끌고 국가 관리 프로그램에서 구현되고 있는 방법의 한 개이다. 여기서 우리는 프로브 기반 정량 PCR (qPCR) 응용 프로그램에 대한 종 별 표적 분석의 개발에 초점을 맞추고 있습니다. 프로브 기반 qPCR을 사용하면 프라이머만으로도 가능한 것보다 더 큰 특이성을 제공합니다. 더욱이, 샘플에서 DNA의 양을 정량화하는 능력은 eDNA의 생태학과 현장에서 eDNA 검출 패턴의 해석에 유용할 수 있다. 환경 샘플에서 대상 종을 검출하는 민감도 및 특이성을 보장하기 위해 이러한 아세의 개발 및 테스트에 주의 깊은 고려가 필요합니다. 이 프로토콜에서 우리는 표적 종의 검출을 위한 프로브 기반 분석서를 설계하고 테스트하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 시퀀스 데이터베이스, 분석 설계, 분석 선택 및 최적화, 테스트 분석 성능 및 필드 유효성 검사를 포함합니다. 이러한 단계를 수행하면 자신있게 사용할 수 있는 효율적이고 민감하며 구체적인 분석결과를 달성하는 데 도움이 됩니다. 우리는 미국 클린치 강에서 발견되는 담수 홍합 종인머켓(액티논나이아스 인대)의인구를 위해 고안된 분석으로 이 과정을 시연합니다.
Introduction
연구원과 관리자는 점점 종 검출을 위한 환경 DNA 연구약의 사용에 관심을 지고 있습니다. 3년 동안, 정량적 또는 실시간 PCR(qPCR/rtPCR)은 핵산1,2의서열 특이적 검출 및 정량화를 위해 수많은 분야에서 사용되어 왔다. eDNA 연구의 비교적 새로운 분야 내에서, 이러한 검사의 사용은 부피 또는 eDNA 샘플의 무게당 표적 DNA의 사본을 정량화하기 위한 표준 곡선을 가진 이 애약의 사용이 이제 일상적인 사례가 되었습니다. 미토콘드리아 DNA 서열은 일반적으로 미토콘드리아 게놈이 세포당 수천 개의 사본에 존재하기 때문에 eDNA 분석은 일반적으로 표적으로 하지만 핵 DNA 또는 RNA 서열에 대한 분석은 또한 가능하다. eDNA 샘플에 대한 출판 된 소가 항상 성능과 동일하지 않다는 것을 이해하는 것이 중요합니다. 표적 종의 DNA(즉, 특이성)만 검출하고 표적 DNA(즉, 감도)의 검출에 대한 분석의 신뢰성은 분석이 설계, 선택, 최적화 및 테스트된 방식의 차이로 인해 상당히 달라질 수 있다. 분석 성능의 정량적 측정을 보고하는 것은 이전에 크게 간과되었지만, 최근 분석 개발의 투명성을 개선하기 위한 표준이3,4,5,6,7,8로부상하고있다.
eDNA 조사 결과의 연구 설계 및 해석에 대한 분석 성능 보조 제의 최적화 및 보고. 비표적 종 DNA와 교차 반응하는 분석은 거짓 양성 검출으로 이어질 수 있으며, 민감성이 좋지 않은 분석법은 샘플(거짓 네거티브)에 존재하는 경우에도 표적 종 DNA를 감지하지 못할 수 있습니다. 분석 민감도 및 선택성에 대한 이해는 희귀 종을 검출하는 데 필요한 샘플링 노력을 알리는 데 도움이 됩니다. eDNA에 변화의 많은 자연적인 소스가 있기 때문에, 연구는 완전히 최적화하고 eDNA 분석3을특성화포함, 가능한 한 변이의 제어 가능한 소스를 제한해야합니다.
분석기의 특이성 또는 감도에 직접적인 영향을 주는 조건은 분석기의 성능을 변경합니다. 이것은 다른 실험실 조건 (즉, 다른 시약, 사용자, 기계 등)에서 발생할 수 있습니다. 따라서 새 조건에서 분석서를 적용할 때 이 프로토콜을 다시 검토해야 합니다. 문헌에서 잘 특징지어지는 소법조차도 새로운 실험실에서 채택하거나 다른 시약(예를 들어, 마스터 믹스 용액)을 사용할 때 테스트및 최적화되어야 한다5,9. 분석 특이성은 상이한 지리적 영역에 적용될 때 변경될 수 있으며, 분석이 시험되지 않은 비표적 종을 포함할 수 있는 새로운 바이오틱 커뮤니티로부터의 샘플에 적용되고 있기 때문에 표적 종의 유전적 변화가 발생할 수 있다. 다시 말하지만, 분석은 새 위치에서 사용할 때 다시 평가되어야 합니다. 현장 PCR 억제제는 샘플에 존재할 가능성이 높기 때문에 현장 조건은 실험실 조건과 다릅니다. PCR 억제제는 증폭 반응에 직접적인 영향을 미치고 따라서 분석 성능에 영향을 미칩니다. 이러한 이유로, 내부 긍정적인 제어 는 eDNA 분석 기 개발 시 필요.
마지막으로, 필드에 있는 환경 조건은 DNA 분해, 수송 및 보존을 통해 표적 종의 DNA 분자 및 그들의 포착에 영향을 미칠 수 있습니다. 더욱이, DNA 수집 및 추출을 위한 다른 프로토콜은 DNA를 유지하는 그들의 효율성 그리고 기능에 변화합니다. 그러나 이러한 프로세스는 eDNA의 검출 가능성에 영향을 미치지만 분자 적 약의 성능은 아니라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서, 현장 샘플에서 표적 종으로부터의 DNA의 검출성은 qPCR 분석의 기술적 성능뿐만 아니라 현장 조건 및 수집, 저장 및 추출 프로토콜의 기능이다. 잘 특징적이고 성능이 높은 분석서를 사용하는 경우 사용자는 분석의 기능에 자신감을 느낄 수 있습니다. 연구원은 지금 eDNA 탐지에 영향을 미치는 외부 분석 요인 (즉, 환경 변수, 포획 또는 추출 프로토콜의 차이)를 이해하는 데 집중할 수 있습니다.
여기서우리는 엄격한 설계와 최적화를 통해 분석 기술 성능에 특히 중점을 둡니다. 우리는 미국 클린치 강에서 샘플링 된 물에서 담수 홍합, 머킷(액티논아 인대)의검출을 위해 개발 된 프로브 기반 분석법을 사용하여 프로토콜을 시연합니다. 최근 탈링거 외 (2020)는 표적 eDNA 검사의 검증을 위한 지침을 제출했습니다. 우리의 프로토콜에 따라 분석 디자인은 탈링거 등의 레벨 4플러스 레벨 56을향한 추가 단계에 대한 분석서를 가져올 것이다. 이 시점에서 분석의 기술 성능이 최적화될 것이며 실험실 및 현장 응용 분야에서 정기적으로 사용할 준비가 될 것입니다. 실험실, 중소균 및 현장 실험에서 분석법의 추가 사용은 eDNA 검출 및 검출가능성에 영향을 미치는 요인, 레벨 5 유효성 검사6의최종 단계에 관한 질문을 해결할 수 있다.
Protocol
1. 표적 및 비표적 종의 미토콘드리아 DNA 서열의 서열 데이터베이스 생성
- 해결 중인 질문, 대상 및 시스템을 정의합니다. eDNA 검출을 위한 표적 종을 식별합니다. 분석이 사용되는 지리적 시스템을 식별합니다. 대상 종, 대칭(co-발생) 종 내의 종(보통 주문 또는 가족 수준) 및 밀접한 관련이 있는 종종, 대상과 동일한 지리적 위치에 있지 않을 수 있는종(도 1)을포함하는 관심종의 목록을 만든다.
참고 : 여기, 종 A. 인대의 클린치 강 인구는 대상이었다. - 1단계에서 목록에 있는 종에 대한 여러 유전자 영역에서 서열을 검색하고 다운로드합니다. NCBI(생명공학정보센터), BOLD(생명데이터베이스 바코드), EMBL(유럽분자생물학연구소), DDBJ(일본 DNA데이터뱅크)와 같은 서열 데이터베이스를 사용할 수 있다. NCBI, EMBL 및 DDBJ는 모두 시퀀스 정보를 공유합니다.
- NCBI의 뉴클레오티드 데이터베이스를 사용하여 표적 유기체(예를 들어, 액티노나이아스 인대)및 유전자 영역(예를 들어, 시토크롬 c 산화효소 I(COI) 또는 NADH-탈수소효소 1(ND1);을 검색합니다. 예 검색 문자열: 액티노리아 인대 및 ND1)
- 그런 다음 사양과 일치하는 모든 시퀀스를 선택하고 보내기를 선택합니다. 전체 레코드, 파일 및 다운로드 형식을 GenBank 또는 FASTA로 선택한 다음 파일 만들기를 선택합니다. 이제 이러한 시퀀스가 컴퓨터에 저장됩니다.
- 1단계에서 정의된 목록의 모든 종에 대해 이러한 단계를 반복합니다. 각각의 유전자 부위에 대한 서열을 별도의 파일로 유지하여 별도로 분석할 것이다.
- 1단계에서 확인된 대상 종에 대해 모든 관련 서열(또는 시퀀스의 대표비율)을 다운로드한다. 가능하면 지리적 변형을 포함합니다.
- 1단계에서 확인된 동일한 분류균 군의 관련 및 대칭 비표적 종에 대한 검색 및 다운로드 서열을 반복한다(예를 들어, 대상 종은머킷(A. 인대)인경우 가족 연합의 다른 모든 담수 홍합 종에 대한 다운로드 시퀀스(예: 관심있는 시스템에서 발생하는 가족 연합의 모든 민물 홍합 종).
- 검색을 반복하고 1.1 단계에 나열된 밀접하게 관련되었지만 항종 (지리적으로 분리된) 종에 대해 다운로드합니다.
참고: 모든 종(대상 및 비 대상)이 공용 데이터베이스에서 사용할 수 있는 것은 아닙니다. 사내에서 관심 있는 종의 분류를 증폭하고 시퀀싱하여 로컬 참조 데이터베이스를 늘립니다. 종 내 유전적 다양성이 높은 종과 함께 일하거나 지리적 변이체가 예상될 수 있는 지리적으로 넓은 지역에서 일하는 경우, 범위 전체에서 서열을 수집합니다.
2. 분석 디자인
- 다양한 유전자 서열 편집 및 생물 정보학 프로그램에서 찾을 수 있는 정렬 소프트웨어를 사용하여 각 유전자 영역의 서열을 별도로 정렬합니다. 각 유전자 영역에 대해 이러한 정렬을 수행합니다.
- 예를 들어, Geneious Prime 소프트웨어(https://www.geneious.com)를 사용하여 다운로드한 시퀀스 파일을 프로그램에 가져옵니다.
- 각 유전자 영역에 대해 별도의 폴더를 만듭니다.
- 한 유전자 영역의 서열을 포함하는 폴더 내에서 모든 서열을 선택합니다.
- 다중 정렬 도구를 사용하여 선택한 서열의 뉴클레오티드 정렬을 만듭니다. Geneious 또는 MUSCLE 정렬 및 기본 매개 변수를 사용하여 정렬 유형에 대한 몇 가지 옵션이 있을 수 있습니다.
- 정렬된 시퀀스 데이터의 시각화를 통해 분석 설계에 대한 유망한 영역을 선택합니다. 관심있는 종에 사용할 수있는 서열 데이터가 많은 지역은 종 간에 매우 차이가 있으며 종 내 의 변화가 좋은 후보임을 보여줍니다. 이것은 디자인된 프라이머와 프로브가 비표적 종으로부터 대상을 구별할 수 있을 가능성을 높이고, 또한 특이적 변이체가 분석으로 증폭되도록 합니다.
- 분석 프라이머와 프로브의 디자인.
- qPCR 분석 설계 소프트웨어를 사용하고 지침을 따르십시오. IDT의 프라이머퀘스트 툴(https://www.idtdna.com/)은 5세트의 qPCR 어필을 설계하는 데 사용되었습니다.
- 2.2 단계에서 선택한 시퀀스를 시퀀스 입력 상자에 붙여 넣습니다. 선형이 공백을 만든 경우 시퀀스에서 해당 공간을 삭제합니다.
- 디자인 선택 옵션에서 qPCR 2 프라이머 + 프로브를 선택합니다.
- 권장 된 에세이를 다운로드 합니다.
- 첫 번째 분석기의 전방 프라이머에서 시퀀스를 복사하고 2.1.4 단계에서 생성된 선형에서 이 프라이머 시퀀스를 검색합니다. Geneious Prime을 사용하는 경우 젠장 및 예측 도구를 사용하여 정렬에 프라이머 영역을 추가합니다. 모든 프라이머 및 프로브조합(그림 2)에대해 이 작업을 수행합니다.
- 공동 발생 종 내에서뿐만 아니라 대상 종 내의 변화에 대한 정렬의 이러한 영역을 검사한다.
- 특이적 유전적 변이가 있는 경우 프라이머와 프로브가 이 지역에 속하지 않는 것을 검색하십시오.
- 비표적 종 증폭을 방지하기 위해 비대상 종과의 불일치를 검색합니다. 추가 유효성 검사를 위해 가장 불일치가 있는 assays를 선택합니다. Currier et al. (2018)는 모든 비표적 종과 적어도 두 개의 불일치를 갖는 세 지역 (두 프라이머 또는 프라이머 및 프로브)의 적어도 두 개의 세트를 선택하는 것이 좋습니다. 그러나 프로브의 불일치는 특이성10에덜 기여한다는 점에 유의하십시오.
참고: 각 프라이머의 3'끝의 3개의 기본 쌍 내의 차이는 프라이머10의5'끝에 있는 차이보다 특이성을 높입니다.
- 분석 설계에서 다음과 같은 중요한 매개 변수를 고려하십시오.
- 프라이머와 프로브의 용융 및 어닐링 온도를 결정합니다. 이상적으로 프라이머의 용융 온도 (Tm)는 각각 60-64 °C 와 2 ° C 이내여야하며 프로브의 Tm은 프라이머의 Tm보다 6-8도 높아야합니다. qPCR 반응의 어닐링 온도(Ta)를 용융 온도 보다 5°C, 약 55-60°C11이하로 설정한다.
- GC 콘텐츠를 검사합니다. 35 ~ 65 % GC 콘텐츠 중에서 선택하고 4 개 이상의 연속 Gs가있는 영역을 피하십시오. 프라이머(GC 클램프)의 3엔드 5개 마지막 베이스에 1 또는 2개의 Gs 또는 Cs를 갖는 것은 프라이머가 더 강한결합(12)을만드는 데 도움이 될 것이기 때문에 특이성을 높일 수 있다.
- 헤어핀과 이머 구조를 검색합니다. 올리고뉴클레오티드 분석 프로그램을 이용한 예측된 헤어핀 구조 및 디머에 대한 테스트 프라이머 및 프로브(예: OligoAnalyzer-IDT13; 올리고칼쿨레이터14). 이러한 구조는 비표적 증폭및 낮은 효율성을 유발할 수 있습니다. 이러한 구조를 형성할 것으로 예상되는 에세이를 피하십시오.
- 프라이머 길이를 결정합니다. 길이18-25베이스와 20~25개의 베이스 사이의 프로브 길이 사이의 프라이머를 목표로 합니다. 프라이머와 프로브가 길수록 증폭 효율이 낮아질 수 있습니다.
- 앰플리카 길이를 결정합니다. 약 100~250개의 베이스 쌍이어야 한다. 이 범위는 일반적으로 높은 PCR 효율을 위해 충분히 짧지만 Sanger 시퀀싱4,15에의한 검증용으로 충분히 길다.
- 설계 프로브. 녹색 및 노란색 염료11에서신호를 약화시킬 수 있기 때문에 프로브에 5'끝에 G 베이스가 없는지 확인합니다. IDT 3IABkFQ, ZEN 퀘이셔, FAM 또는 HEX 플루오로포리스를 갖춘 이중 담금질 프로브를 설계했습니다.
참고: MGB 프로브 결정: TaqMan MGB(작은 홈 바인더) 프로브는 eDNA 연구에 자주 사용됩니다. 그러나 이러한 프로브는 매우 짧기 때문에 2 또는 3 베이스 페어 불일치10에서도비 대상에 바인딩할 수 있습니다. - 프로브 Tm. 프로브의 용융 온도는 프라이머보다 6-8°C 높아야 한다고 결정합니다. 온도가 낮을수록 프로브의 결합 성공이 줄어듭니다.
- 프로브 길이와 위치를 결정합니다. 프로브는 길이가 20~25bp 사이여야 하며 겹치지 않고 동일한 가닥의 프라이머 바인딩 부위 에 이상적으로 위치해야 합니다.
3. 분석 검사 및 최적화
- 실리코 분석 개발 및 테스트. 프라이머 프로브 세트를 주문하기 전에 실리코에서 프라이머 증폭을 테스트하여 특이성(잠재적 비표적 증폭)을평가합니다.
- NCBI의 프라이머-블라스트16 또는 분석으로 증폭될 수 있는 NCBI nt/nr 데이터베이스에서 잠재적인 비표적을 식별할 수 있는 유사한 프로그램을 통해 프라이머를 테스트합니다. 프라이머- 블라스트 페이스트 프라이머를 사용하는 경우 프라이머 매개 변수에서 내 자신의 프라이머 상자를 사용합니다. 프라이머 쌍 특이성 검사 매개변수 옵션에서 nr을 데이터베이스로 선택하고 관심 있는 유기체의 순서(예: "Unionida" 또는 "Unionoida")를 유기체 상자에 입력합니다.
- 정렬된 시퀀스 데이터에 대한 프라이머/프로브 세트를 시각적으로 계속 평가합니다.
- 실리코에서 프라이머와 프로브를 동시에 평가하기 위해 전방 프라이머, 12 N's, 프로브, 12 N의 텍스트 문자열 및 역방향 프라이머의 역 보완을 만듭니다. 프로브 시퀀스가 프라이머 중 하나의 12개의 기본 쌍 내에 있는 경우 프라이머와 프로브 사이의 기본 쌍 수에 해당하는 N의 수를 사용합니다.
- NCBI의 뉴클레오티드 블라스트 검색(Blastn)을 사용하여 nr데이터베이스(17)에대해 검색합니다. 분류술 탭을 사용하여 불일치가 거의 없는 비대상 종을 찾습니다. 이들은 분석 최적화 도중 실험실에서 시험되어야 합니다.
참고: 실리코 테스트에서비특이적 분석방법을 배제하는 데 도움이 되지만, 모든 종에 유전 데이터베이스와 프라이머 및 프로브가 소프트웨어에 의해 가능성이 낮다고 판단되더라도 비표적에 묶을 수 있는 것은 아니기 때문에 잠재적으로 특정 분석이 경험적으로(시험관내에서) 테스트되어야 합니다.
- 실험실에서 테스트할 3~5개의 프라이머/프로브 조합을 선택합니다.
- 주문 프라이머, 프로브 및 합성 DNA 표준뿐만 아니라 앰플리톤 염기서열에 대한 추가 M13 꼬리 프라이머.
- 올리고를 만드는 회사에서 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머와 프로브를 주문하십시오. 프로브는 형광 염료와 담수로 표시됩니다. 다중형형어를 사용해야 하는 아세약에 대해 다른 형광을 선택해야 합니다. qPCR 기기에서 악기가 감지할 수 있는 형광 목록을 확인하십시오.
- M13 포워드(-20) 시퀀스, GTA AAA CGA CGG CCA GT, 전방 프라이머의 5'엔드, 그리고 M13 리버스(-27) 시퀀스, CAG GAA ACA GCT AT ACG의 5엔드를 추가하여 Sanger 시퀀싱을 통한 qPCR 검출 검증을 위한 M13 꼬리 프라이머를 설계 및 주문하여 5대 1의 방향을 바릅니다.
- 합성 DNA 표준은 이 표준의 공지된 농도(즉, 표준 곡선)에 의해 만들어진 곡선을 기반으로 알 수 없는 시료를 정량화하는 카피/μL의 알려진 농도에서 표적 서열(프라이머 영역 포함)을 포함한다. 프라이머와 프로브를 제조하는 동일한 회사에서 합성 표준을 획득하십시오. 리서스펜션 및 스토리지에 대한 제조업체 권장 사항을 따릅니다. 낮은 보존 플라스틱웨어를 사용하여 tRNA 캐리어로 TE 버퍼의 표준을 희석하여 가수분해를 줄이고 표면에 결합합니다.
참고: 표준 곡선이 제대로 작동하지 않는 경우(PCR 효율이 좋지 않으면 3.4.2단계를 참조), 물 또는 Tris-HCl에서 표준을 다시 일시 중단해 보십시오. - 분석 사용을 위한 편리한 농도에서 뉴클레아제 프리 워터, Tris-HCl 또는 TE 버퍼에서 프라이머 및 프로브를 일시 중단합니다. 일반적으로, 마스터 믹스에서 작업 주식을 20배 희석하여 최적화된 최종 분석 농도를 달성한다. 사용하지 않을 때는 일정한 -20°C에서 중단된 올리고를 보관하십시오.
- 시험관 내 (실험실에서) 분석 최적화 및 테스트. 효율성이 떨어지거나, 동발생 종과 상호 반응하거나, 민감도가 떨어지는 것을 거부합니다.18. 분석 개발 중뿐만 아니라 실제 샘플을 실행할 때 내부 긍정 제어(IPC)의 사용을 포함합니다.
- 먼저, 분석에 대한 최적의 온도 및 프라이머/프로브 농도 값을 찾아보세요. 이러한 매개 변수가 PCR 효율(3.4.2단계), 교차 반응성(3.4.3단계) 및 감도(3.4.4단계)에 최적화되면 멀티플렉스 IPC(3.4.5단계)로 분석 테스트를 진행합니다.
- 예측된 평균 프라이머 Tm 아래 5°C를 중심으로 PCR 온도 그라데이션을 사용하여 프라이머 및 프로브를 위한 최적의 어닐링 온도(Ta)를 테스트합니다.
- 최적의 프라이머 및 프로브 농도를 테스트합니다. 전형적으로, 200nM, 400nM 및 800nM 프라이머 농도 및 75nM, 125nM 및 200nM 프로브 농도가 시험된다.
- 표준 곡선을 만들고 효율성과 선형 범위를 결정합니다. 표적 서열을 포함하는 합성 DNA 표준의 적어도 6개의 10배 희석을 시험하고, 105부/반응(그림3A)에약 1000카피/반응으로 반응한다.
- qPCR 소프트웨어를 사용하여 x축의 복사본/반응에서 초기 표준 농도의 y축 및 로그 베이스(10)의 각 표준의 Cq 값(정량화 시 주기에 대한 임계값)을 플롯합니다. qPCR 소프트웨어는 선형 회귀(그림3B)를자동으로 실행해야 합니다.
- 회귀, E = -1 + 10(-1 /경사)의경사에서 효율을 계산합니다. 예를 들어, 경사가 -3.4인 경우, E= -1 + 10(0.29) = 0.97 또는 97%입니다. 또한 표준 복제가 곡선에 얼마나 잘 맞는지 나타내는 r2 값을 확인합니다. qPCR 소프트웨어도 자동으로 계산해야합니다(그림 3B). 100% (±10%)의 효율성 값을 목표로 합니다. 및 r2 값 ≥0.989,15, 19,20,21, 22.
- 표준 곡선을 시각적으로 검사하여 회귀로부터의 편차는 일관된 방향으로 또는 효율성 및 r2 값(그림 3C 및 3D)으로측정된 표준 곡선 성능 저하를 검사합니다.
- 특이성: 비표적 종과의 상호 반응성을 평가하여 거짓 긍정의 가능성을 감소시면 됩니다. eDNA 검출이 비용이 많이 드는 관리 결정을 내릴 수 있는 경우 앰플리턴 시퀀싱을 통해 양수 검출을 확인합니다.
- 비 표적: 관련 종 및 지리적으로 공동 발생 하는 종의 분류학적으로 검증 된 표본의 게놈 DNA 추출에 대 한 분석 실행; 가장 높은 우선 순위는 밀접하게 관련, 공동 발생 종에 대해 테스트하는 것입니다. 대상 및 비 표적 샘플 모두에 유사한 총 DNA 농도를 사용합니다. 선택한 농도는 표준 곡선의 선형 범위의 중간 부근에 있는 표적 종 샘플로부터 증폭을 얻어야 한다. 증폭은 대상 종으로만 관찰되어야 합니다.
- 비표적 증폭이 관찰되면 제품을 깨끗하게 하고 시퀀스를 사용하여 해당 ID를 확인합니다. 비표적 종의 조직 샘플에서 표적 종으로부터의 오염을 관찰하는 것은 드문 일이 아니며, 따라서 이 단계의 모든 증폭은 시퀀싱에 의해 확인되어야 한다. M13 꼬리 프라이머와 M13 프라이머를 사용하여 특이성 테스트에서 세척 앰프를 회수합니다.
- 포스트 PCR 실험실에서 qPCR 제품을 신선한 튜브로 시퀀스할 수 있습니다. 정리 키트(예: MinElute PCR 정화 키트)를 통해 잔류 프라이머 및 반응 구성 요소를 제거합니다.
- M13 꼬리 프라이머와 고충실도 폴리머라제(예: 푸시온 고충실도 DNA 폴리머라제)를 통해 50μL PCR 반응으로 30사이클동안 각각 1:100의 희석을 하고 1μL을 증폭시한다.
- 1% 아가로즈 젤에 각 반응의 10 μL을 실행하여 예상 된 크기의 단일 밴드를 확인합니다. 대역이 관찰되지 않으면 사이클 수 또는 샘플 양을 늘립니다. 여러 밴드가 관찰되면 젤은 예상 크기의 밴드를 정화합니다.
- 위와 같이 세척 키트로 잔류 프라이머 및 반응 성분을 제거하고 elutions의 DNA 농도를 측정합니다.
- 시퀀싱 시설의 지침에 따라 M13 프라이머로 시퀀싱 반응을 설정합니다.
참고: qPCR 실험실에서 증폭된 샘플을 열지 마십시오. PCR 이후 샘플 전용 실험실에서 시퀀싱을 위한 샘플을 준비합니다.
- 감도: 감도는 거짓 네거티브의 기회에 영향을 미치거나, 표적 종 DNA가 존재할 때 검출하는 실패에 영향을 미칩니다. 각 분석시에 대한 검출 제한(LOD) 및 정량화 제한(LOQ)을 평가합니다. 마지막으로, 샘플의 PCR 억제를 평가하기 위한 내부 양성 제어(IPC)를 포함한다. 멀티플렉스와 두 분석이 서로 간섭하지 않도록 설계된 분석으로이 IPC 분석방법을 테스트합니다.
- LOD: 합성 DNA 표준의 6배 연속 희석제를 만들고, 표준 희석제당 8-24복제(그림4)를만듭니다. 95% 검출으로 가장 낮은 초기 농도를 계산합니다. LOD/LOQ 계산기 R 스크립트5로LOD 및 LOQ 플롯을 생성할 수 있습니다.
참고: LOD 아래의 데이터는 검열해서는 안 됩니다. PCR의 특이성 때문에 진정한 긍정에 대한 하한이 없습니다. LOD는 거짓 네거티브가 발생할 것으로 예상되는 가장 높은 농도입니다. - LOQ: 동일한 희석 계열에서 35% 미만의 변동 계수(CV)로 정량화가능한 가장 낮은 초기 DNA 표준 농도를 계산합니다.
참고: LOD 및 LOQ는 사본/반응으로 보고해야 합니다. 검증된 분석및 현장 샘플을 LOQ 이하로 증폭하는 경우 정확한 농도를 자신있게 측정할 수 없기 때문에 결과가 eDNA 농도가 아닌 %의 검출으로 보고되어야한다.
- LOD: 합성 DNA 표준의 6배 연속 희석제를 만들고, 표준 희석제당 8-24복제(그림4)를만듭니다. 95% 검출으로 가장 낮은 초기 농도를 계산합니다. LOD/LOQ 계산기 R 스크립트5로LOD 및 LOQ 플롯을 생성할 수 있습니다.
- 내부 양성 제어(IPC)를 사용하여 PCR 억제를 테스트합니다. 억제는 감도 및 거짓 네거티브의 감소로 이어질 수 있습니다. 대상 분석기로 멀티플렉션되는 IPC 분석의 능력을 테스트합니다.
- IPC 분석체는 대상 분석기와 다른 리포터 염료를 가진 프로브를 사용하여 표적 분석으로 멀티플렉싱될 수 있다. 이 IPC 분석법은 대상 taxa와 관련이 없는 종으로부터 짧은 합성 DNA 서열로 구성되며, qPCR 마스터 믹스에 약 102카피/반응의 낮은 농도로 통합되어 이를 감지하는 프라이머 및 프로브로 구성된다. 이러한 낮은 농도는 중합효소 및뉴클레오티드(23)에대한 표적 서열과의 경쟁을 피하기 위해 필요하다.
- 샘플IPC 템플릿의 Cq 값을 템플릿 컨트롤이 없는 IPC 템플릿과 비교합니다. 이 템플릿 제어(NTC)에서 유일한 DNA 입력은 IPC 템플릿입니다. 이 반응의 IPC 템플릿은 예상대로 증폭되어야 합니다. 샘플의 IPC 템플릿이 NTC의 IPC 템플릿과 2사이클 이상 증폭되면 eDNA 샘플이 억제됩니다. 억제를 보여주는 샘플은 1:10을 희석하고 다시 테스트할 수 있습니다. 샘플이 억제된 상태로 유지되면 해당 샘플을 분석에서 제거해야 합니다.
- 먼저, 분석에 대한 최적의 온도 및 프라이머/프로브 농도 값을 찾아보세요. 이러한 매개 변수가 PCR 효율(3.4.2단계), 교차 반응성(3.4.3단계) 및 감도(3.4.4단계)에 최적화되면 멀티플렉스 IPC(3.4.5단계)로 분석 테스트를 진행합니다.
- 시투 분석 개발 및 테스트에서
- 실험실에서: 실험실에서 유기체뿐만 아니라 대칭 종에 대한 액세스를 사용할 수 있는 경우; 이러한 종과 인클로저에서 물 샘플을 가지고 샘플을 처리하고 이러한 eDNA 샘플에 대한 분석검사를 테스트합니다. 위와 같은 시퀀스 제품은 M13 꼬리 프라이머를 사용하여 의도된 대상의 증폭을 검증한다.
- 현장에서:
- 대상 유기체가 발생하는 것으로 알려져 있으며 발생하지 않는 것으로 알려진 부위를 식별합니다. 표적 종들이 발생하는 각 부위에 어느 정도의 풍요로움을 갖는 것이 바람직하다.
- 어떤 샘플 볼륨 및 샘플 수집 방법(예: 여과, 원심분리 등)이 사용될지 결정합니다.
- 각 부위에 필드 블랭크 또는 음수 제어를 포함, 이것은 필드 사이트로 가져온 다음 수집하고 eDNA 샘플링에 사용되는 동일한 필드 장비 및 프로토콜으로 준비 된 깨끗한물이다(24) 필드 블랭크의 목적은 현장에 가져온 샘플링 장비 및 현장 장비의 오염을 감지하는 것입니다. 필드 워터 샘플을 처리하기 전에 필드를 비워 둡이 됩니다.
- 사이트당 여러 개의 물 샘플을 채취하시며, 바람직하게는 사이트당 3개의 샘플을 채취하십시오.
- 실험실로 돌아가 서 샘플을 처리하고 추출합니다.
- 도 5A와 유사한 플레이트를 사용하여 분석체를 실행하고 eDNA 농도 및 검출 빈도를 알려진 부위의 발생 및 풍부성과 비교한다. 24,25를시퀀싱하여 모든 검출을 확인합니다.
참고: 위의 척도 는 탈링거(2020) 스케일 6(분석기의 기술 성능 최적화)의 레벨 4를 통해 분석의 유효성을 검사하고 레벨 5 분석 유효성 검사를 지원하는 데이터를 수집하기 시작합니다. 레벨 5는 eDNA 생태학 연구를 위한 분석의 확률 모델링 및 사용을 통합합니다. 우리는 이것이 기본적인 분석 개발의 범위를 벗어납니다 생각합니다, 그러나 우리는 분석 설계 및 데이터 해석을 향상시키기 위하여 실험실 및 필드 심사 분석의 이 응용을 격려합니다.
Representative Results
머킷(A. 인대)에대한 종별 qPCR 분석체를 설계할 때 클린치 강의 모든 유니온대 종의 사용 가능한 시퀀스를 다운로드했다. 람실리스 실리쿼이트와 같은 밀접한 관련 종은 동일한 강에서 발견되지 않았음에도 불구하고 참조 데이터베이스에 포함되었습니다. 겐뱅크에서 관심 있는 강 계통의 모든 종만 발견되지 않았기 때문에 추가 종들이 집에서 시퀀스되었습니다. 시퀀스는 Geneious 소프트웨어를 사용하여 정렬되었고, IDT(프라이머 퀘스트) 소프트웨어는 여러 분석서를 설계하는 데 사용되었습니다. 5세트의 프라이머와 프로브가 시각적 평가를 위한 정렬에 추가하였다(도2). 그런 다음 프라이머 블라스트를 사용하여 실리코에서 테스트되었으며, 그 후 시험관내에서 추가 테스트를 위해주문되었습니다. 실험실에서는, 모든 분석은 특이성을 확인하기 위하여 27의 유효한 종의 DNA 추출을 사용하여 시험되었습니다. 하나의 분석(A.lig.1)은 표적 종만 성공적으로증폭시켰다(표 1; 표 2)를참조하십시오. 이 분석은 분석 효율, LOD 및 LOQ의 추가 테스트를 위해 앞으로 나아갔습니다. 그것은 121 베이스 쌍의 앰플리시온 길이가 있습니다. 표 3은 A. 인대 합성 DNA 표준에 사용되는 서열을 나타낸다. 도 3A 및 도 3B는 좋은 효율과 r2 값을 가진 성공적인 분석의 결과를 보여줍니다. 그림 3C 및 그림 3D는 표준 곡선이 효율성이 떨어지는 분석서를 보여 준다. 이 분석은 폐기되었습니다. 선택된 분석체(A.lig.1)에 대한 LOD 및 LOQ는 모두 Klymus 외5에기재된 이산 방법을 사용하여 5.00부/반응으로 나타났다. 분석(표 3-6)으로멀티플렉션된 IPC는 A. 인대 분석의 표준 곡선에 영향을 미치지 않았다. 우리가 사용하는 IPC는 마우스 HemT 성적 증명서의 조각입니다. 이 분석서는 다른 응용 프로그램에 대한 IDT에 의해 미리 설계되었지만 랩의 eDNA 응용 프로그램에 대한 IPC로 사용을 수정했습니다.
성공적인 qPCR 실행은 각 성능 측정값(예: 표준 곡선 증폭, 게놈 DNA 양성 제어, 템플릿 제어 및 내부 양성 제어)에 대한 특정 기준을 충족해야 합니다. 대상 분석 표준에는 지수 증폭 곡선이 있어야 합니다. 이 곡선은 충분한 사이클을 실행할 수 있다면 엔드 포인트 고원에 도달해야 합니다. 이는 반응 중에 완전히 소모되는 형광 프로브와 최대 한계에 도달하는 형광 수준을 나타냅니다. 나중에 증폭 기준은 40 사이클에서 고원에 도달하지 않을 수 있습니다. 양성 대조군 (게놈 DNA 및 IPC)은 동일한 패턴을 가져야합니다. 알 수 없는 증폭 될 수 있습니다 또는 증폭 하지 않을 수 있습니다., 하지만 미지의 증폭 또한 기하 급수적인 패턴 및 끝점 고원(도 5)를가져야 한다.
품질 qPCR에서 표준 희석제는 농도의 각 10배 차이에 대해 약 3.3사이클마다 균등하게 간격을 둔 Cq로 증폭됩니다. 표준 희석의 각 복제는 거의 동일한 Cq(r2 값으로 표현)를 갖는 긴밀하게 그룹화된 방식으로 증폭됩니다. 모든 표준 희석은 증폭(그림3A)을나타내야 한다. 가난한 qPCR에서, 표준은 희석 사이의 Cq 값의 비 지수 모양, 고르지 않은 변화를 나타낼 수 있으며, 엔드포인트 고원에 오지 않거나 일부 희석은 전혀 증폭되지 않을 수있다(도 3D).
표준 곡선의 중요한 매개 변수는 효율성, r2,경사 및 y-intercept입니다. 효율성은 100% 에 가까운 이상적인 값으로 90%-110% 사이여야 하며 r2 값은 0.98 이상이어야 하며 이상적인 결과는 1.015,22에근접합니다. 경사 값은 -3.2에서 -3.5 사이여야 하며 이상적인 결과는 -3.322에 가깝습니다. y-가로채기 값은 34-41C 사이에 있어야 하며, 이상적인 결과는 37.0C를 갖는 것입니다. y-intercept는 단일 qPCR로 측정할 수 있는 가장 작은 단위인 표적 시퀀스의 1카피를 가진 반응의 예측 Cq이다. Cq의 y-intercept보다 큰 알 수없는 억제 될 가능성이 높습니다. PCR의 40사이클 이상을 실행하는 것은 억제 또는 비효율적인 프라이머 세트의 경우 표적을 검출할 필요가 있을 수 있지만, 이러한 상황에서는 정량화가 불가능하지만, 알 수 없는 것과 유사한 총 DNA를 함유하고 있으나, 비특이적 소스로부터의 증폭을 배제하기 위해 실행되어야 한다.
알 수 없는 샘플의 내부 양성 제어(IPC) 증폭은 시약에 대한 경쟁이 없고 억제제가 없기 때문에 부정적인 템플릿 제어 IPC의 결과와 비교되어야 한다. IPC가 2사이클의 Cq를 갖는 알 수 없거나 NTC의 평균 Cq 값보다 크거나 증폭되지 않는 것을 억제하는 것으로 간주되어야 합니다. 샘플에 억제제가 없는 경우 모든 IPC 증폭은 NTC(그림6)와가까운 Cq 값으로 플롯에 단단한 그룹화해야 합니다.
마지막으로, 분석의 시투 테스트가 발생했습니다. 클린치 강에서 20개의 물 샘플과 3개의 필드 빈 샘플은 A. 인대가있는 것으로 알려진 홍합 침대에서 500미터 이내로 2019년 9월 25-26일 사이에 여과되었다. 샘플링 위치당 약 4개의 1L 샘플의 물을 여과하였다. 위치 사이트는 스트림에 홍합 침대의 바닥에 포함, 해안 근처 홍합 침대의 바닥, 스트림침대의 100m 하류, 스트림침대의 500m 하류와 해안 근처 침대의 500m 하류(그림 7). 실험실에서, 각 필터는 반으로 절단되었고 DNA는 필터의 절반에서 추출되었다. 각 샘플에 대한 나머지 필터 절반은 -80°C 냉동고에 저장되었다. 그런 다음 샘플은 IPC로 멀티플렉싱된 A.lig.1 분석을 사용하여 실행되었습니다. 23개의 샘플 중 5개는 억제된 것으로 나타났습니다. 이 견본은 1:10희석되고 희석이 재실행되었습니다. 설계된 분석서를 사용하여 증폭된 20개의 필드 샘플 중 19개. 이 19개의 샘플 중 5개는 분석의 LOD 및 5개의 사본/반응의 LOQ 위에 있었습니다. 대부분의 시료는 eDNA 검출을 가졌지만 거짓 부정적인 결과가 발생할 가능성이 있는 수준에서 분석이 14개의 샘플에 대한 복사 번호를 자신있게 정량화할 수 없다는 것을 의미합니다. 그럼에도 불구하고, 4개의 생물학적 부위의 75~100%는 각 샘플링 위치에서 증폭된 복제한다. 3개의 필드 블랭크 중 2개는 부정적이었고, 한 필드 블랭크는 증폭을 보였으며, 현장에서 깨끗한 기술의 중요성을 강조했습니다.
그림 1: 미토콘드리아 DNA 서열 데이터베이스 구성을 위한 워크플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 액티논아 인대 ND1 분석기의 예비 프라이머와 프로브를 가진 클린치 강 홍합 종에 대한 순서 정렬. 진한 녹색의 프라이머를 앞으로, 빨간색과 밝은 녹색의 역 프라이머로 프로브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 표준 곡선 및 선형 회귀 예제입니다. 3개의증폭에서 파생된 허용 가능한 표준 곡선의 예는 각각 6개의 표준 희석제각각을 복제합니다. 왼쪽에 표준 의 농도가 가장 높은 10 배 표준 희석 계열, 오른쪽으로 이동 감소 농도와. 모든 추적을 교차하는 수평 선은 수량(Cq)에서 주기의 임계값입니다. 각 추적이 이 임계값을 교차하는 곳은 Cq가 결정되는 곳입니다. B. 그림 3A의 표준 복제로 만든 선형 회귀. 표준 희석제의 복제는 원에 플롯되고 알 수 없음(샘플)은 x로 플롯됩니다. 효율은 98.9%,r2는 1.0에 육박하고 - 3.349의 경사입니다. C.세 가지 증폭으로부터 파생된 열악한 표준 곡선의 예는 각각 6개의 표준 희석제각각을 복제합니다. D.표준에 대한 표준 곡선을 형성하는 선형 회귀는 예 3C에서 증폭된 복제합니다. 효율성이 저하되고 r2 값을 기록합니다. 또한 6개 표준 중 4개만 증폭된다는 점에 유의하십시오. 반복 실행 후 표준 곡선이 개선되지 않으면, 문제가 예상대로 대상 DNA를 증폭하지 않는 가난한 프라이머 / 프로브 세트에있을 수 있습니다, 이 분석은 고려되어서는 안된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: LOD 및 LOQ 표준 qPCR 실행에 대한 플레이트 설정의 예입니다. 곡선에 사용되는 표준은 파란색으로, 표준 농도는 어두운 파란색에서 밝은 파란색으로 감소합니다. 녹색및 노변의 템플릿 제어(NTC)의 DNA 양성 제어. 각 표준 희석에 대해 24 복제를 나타내는 회색의 실험 표준 농도. 희석 계열은 표준 곡선, 양수 제어 및 NTC를 가진 두 개의 플레이트(A, B)에 걸쳐 도금되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: qPCR 실행에서 플레이트 설정 및 증폭 추적. A. 플레이트 설정, 표준의 농도가 가장 높은 파란색, 어두운 색상으로 표시된 표준. 녹색의 DNA 양성 제어, 노란색 (NTC)의 템플릿 컨트롤없음, 회색의 샘플 표적. B. qPCR 실행에서 증폭 추적. 파란색으로 표시된 표준, 녹색의 DNA 양성 제어, 노란색의 템플릿 컨트롤, 빨간색의 알 수 없음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 내부 긍정 제어(IPC)에 대한 증폭 추적입니다. iPC는 삼각형이 있는 주황색으로 표시된 템플릿 컨트롤(NtC)에서 마젠타 및 IPC의 알 수 없는 모든 샘플에 대한 추적을 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 버지니아/테네시 국경을 따라 클린치 강에 있는 홍합 침대의 eDNA 수집 현장을 보여주는 지도. 샘플은 침대 바닥의 월렌스 벤드, 침대 의 하류 100m, 침대의 500m 하류에서 수집되었습니다. 장소는 (스트림) 또는 해안선 (해안)에서 약 1 - 2 미터의 중간에 수집되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 구성 요소 | 이름 | 시퀀스 5' – 3' | 형광 라벨 | |
| 포워드 프라이머 | A.lig.1-f | CCCTCATCACGTACCTCTTAATC | ||
| 역프라이머 | A.lig.1-r | GGAATGCCCATAATTCCAACTTTA | ||
| 탐침 | A.lig.1 프로브 | TTCTTGAACGTAAGCCCTCGGGT | FAM | |
표 1: 설계 된 액티오니아 인대 qPCR 분석기 (A.lig.1) 전방 및 역 프라이머및 프로브에 대한 시퀀스를 포함한다.
| 종 | 증폭 | 클린치 강에서 |
| 1. 액티나니아 인대 | 예 | 예 |
| 2. 액티노나이아스 페토로사 | 아니요 | 예 |
| 3. 앰블마 플리카타 | 아니요 | 예 |
| 4. 코르비쿨라 스프. | 아니요 | 예 |
| 5. 컴벌란디아 모노돈타 | 아니요 | 예 |
| 6. 사이클로나이아스 결핵 | 아니요 | 예 |
| 7. 시프로게니아 슈타리아 | 아니요 | 예 |
| 8. 엘리티오 딜라타타 | 아니요 | 예 |
| 9. 에피오블라스마 브레비덴스 | 아니요 | 예 |
| 10. 에피오플라스마 캡세포르미스 | 아니요 | 예 |
| 11. 에피오플라스마 플로렌티나 아우레올라 | 아니요 | 예 |
| 12화 에피오플라스마 트리크트라 | 아니요 | 예 |
| 13화 푸스코나이아 코르 | 아니요 | 예 |
| 14화 푸스코나이아 아브로툰다 | 아니요 | 예 |
| 15화 람실리스 오바타 | 아니요 | 예 |
| 16화 람실리스 실리쿼이트 | 아니요 | 아니요 |
| 17. 라미고나 코스타타 | 아니요 | 예 |
| 18. 레미옥스 리모서스 | 아니요 | 예 |
| 19화 렉싱턴니아 도라벨로이드 | 아니요 | 예 |
| 20화 메디오니드 콘래디쿠스 | 아니요 | 예 |
| 21. 과다고시피루스 | 아니요 | 예 |
| 22화 플로베마 플레넘 | 아니요 | 예 |
| 23화 Ptychobranchus fasciolaris | 아니요 | 예 |
| 24화 Ptychobranchus 서브텐더스 | 아니요 | 예 |
| 25화 쿼드룰라 푸스툴로사 | 아니요 | 예 |
| 26화 스트로비투스 기복이 | 아니요 | 예 |
| 27화 빌로사 아이리스 | 아니요 | 예 |
표 2: A.lig.1 분석기의 체외 특이성 시험에 사용되는 종 목록입니다. 표적(액티노나인대)의게놈 DNA를 증폭시키고 비표적 종 중 어느 도증폭되지 않았다.
| 구성 요소 | 시퀀스 5'-3' | ||||
| 액티오니아리게티나 표준 | CCCTCATCACGTAC CTCTTAATCCTAT타그GTGTCGCATTTTCACTCTCTTGAACGTA | ||||
| AAGCCCTCGGGT ACTTTCAAATCCGAAAGCCCAAATAAGTTGGAGATGGGATATTC | |||||
| CCCAACCAT타그가트GCTCTAAGCTCTCTCTCTCTCTCTCTTCGTAAAAAAAATGAATGAATGAATATGAATATGAATATACCTCCT | |||||
| 카액타액타크택트타크택타액타액타트타택트 | |||||
| 가카타트CCATCCTTTTATATTATATATTTATTTATTTTTTTTTTTTGGATGCTCCTATTCT | |||||
| TGTGTATCTCCTCC타타타타카액타타타카액타타카박타갈CTGAGCCTCAAACTCCA | |||||
| AATGCCCTTT타그CTATTCGAGCTATTCCA타카타타카타타크카타타 | |||||
| TAAC | |||||
| IPC 템플릿(헴-T) | CTACATAAGTAACCTTCTCATGTAAGCTCTCTGAGTGTCTCGAATCTCAGACGCT | ||||
| GTATGACAGTCTCCTTTCGTGTGAACATTCGGCTGCT GCT GTTGTTCTCAAGGACTGCAC | |||||
표 3: 액티오나이아스 인대 표준의 서열(5'-3')과 IPC 템플릿(Hem-T)이 이 분석에 사용됩니다. 전방 및 역 프라이머의 시퀀스는 굵게 표시되고 기울임꼴이 있으며 프로브의 밑줄이 밑줄이 표시됩니다.
| 구성 요소 | 이름 | 시퀀스 5' – 3' | 형광 라벨 | |
| 포워드 프라이머 | 헴트-F | TCTGAGTGTCCCTCGAATCT | ||
| 역프라이머 | 헴트-R | GCAGTCCTT가카타카타가그C | ||
| 탐침 | 헴T-P | TGACAGTCTCCTGTGAACATTCG | Cy5 | |
표 4: 전방 및 역프라이머 및 프로브에 대한 시퀀스를 포함하는 내부 긍정 제어(IPC) 분석입니다.
| 샘플당 부피(μL) | 구성 요소 |
| 10 | 환경 마스터 믹스 |
| 1 | 20uM A. lig.1 F/R 믹스 |
| 1 | 2.5uM A. lig.1 프로브 |
| 1 | 5uM IPC 프라이머 믹스 (헴T-F / R) |
| 0.75 | 2.5uM IPC 프로브(헴T-P) |
| 1.5 | IPC 템플릿의 1 X 103 농도 |
| 2.75 | H20 |
| 2 | 견본 |
| 20 | 총 볼륨 |
표 5: IPC 분석으로 멀티플렉스로 된 A.lig.1 분석에 사용되는 PCR 믹스.
| 걸음 | 온도 (°C) | 시간 | |
| 1 | 초기 자연 | 95 | 10분 |
| 2 | 변성 | 95 | 15초 |
| 3 | 어 닐 링 | 60 | 1분 |
| 4 | 2단계로 이동하여 39X를 반복합니다. |
표 6: A.lig.1 분석에 대한 반응 조건.
Discussion
어떤 연구와 마찬가지로, 해결될 질문을 정의하는 것은 첫 번째 단계이고 eDNA 분석의 디자인은 연구 결과에 따라 다릅니다26. 예를 들어, 연구 또는 조사의 목적이 하나 또는 몇 가지 종을 검출하는 경우, 표적 프로브 기반 분석이 가장 좋습니다. 그러나, 목표는 더 큰 제품군 또는 종의 조립을 평가하는 것입니다 경우, 높은 처리량 시퀀싱 메타바코딩 분석이 더 적합합니다. 어떤 접근 방식을 취해야 할지 결정되면 분석 설계, 테스트 및 최적화를 포함한 파일럿 연구가 권장됩니다.24. 분석 설계는 에 설명된 대로 종 목록으로 시작됩니다. 그림 1. 이 목록은 분석이 특이성과 적용될 수 있는 지리적 범위측면에서 얼마나 잘 수행되는지 를 이해하는 기초가 될 것입니다.6,10. 특정 지리적 영역에 대한 분석기를 설계하여 설계하여 설계자가 해당 지역의 다른 종에 대한 상호 반응성에 대한 분석방법을 더 잘 테스트할 수 있으며, 표적 종이 발생할 수 있는 다른 지역으로 분석영역을 확장하는 데 있어 한계를 인식하는 것이 좋습니다.24. 목록이 완료되면 공개 유전 데이터베이스에서 시퀀스를 다운로드할 수 있습니다. 이러한 데이터베이스가 불완전하기 때문에27, 하나는 분석 설계에 사용되는 시퀀스의 로컬 참조 데이터베이스를 완료하기 위해 집에서 가능한 한 많은 종을 순서해야합니다. 이들은 증폭할 가능성이 가장 높은 비 표적이기 때문에, 밀접하게 관련되는 종을 공동 발생하는 우선순위를 정합니다. 대상 종과 같은 속 또는 가족 내의 모든 종에 초점을 맞추는 것은 시작하기에 좋은 장소입니다. 밀접하게 관련 된 종과의 비교는 대상 종에 고유한 서열 영역을 식별하는 데 도움이됩니다. 이렇게 하면 다른 시스템이나 위치에서 분석이 어떻게 수행되는지 알 수 있습니다. 미토콘드리아 영역은 종개발의 일반적인 선택이며, 생명 프로젝트의 바코드에 사용된 미토콘드리아 유전자에서 보다 다양한 종의 서열 정보를 사용할 수 있기 때문에, 미토콘드리아 DNA는 핵 DNA보다 사본/세포에 훨씬 더 큰 농도로 존재하기 때문이다.24,28,29. 여러 유전자 영역은 유전 저장소 데이터베이스에서 분류사 마다 서열 엄호가 변화하기 때문에 추가 분석 발달을 위해 평가되어야 합니다. 참조 시퀀스의 이 로컬 데이터베이스가 생성되면 정렬된 시퀀스 데이터와 컴퓨터 소프트웨어 프로그램의 수동 시각화가 결합되어 프라이머/프로브 분석방법을 디자인하는 데 사용됩니다. 하나는 테스트 할 분석방법을 결정하기 위해 소프트웨어에 엄격하게 의존해서는 안됩니다. 프라이머와 프로브가 대상과 비대상에 앉아 있는 정렬을 시각적으로 확인하여 PCR에서 어떻게 행동할지 더 잘 이해하는 것이 중요합니다. 마지막으로 분석 검사 및 최적화는 세 가지 수준을 포함 (실리코에서, 시험관 내 및 시투에서)6,7,24,25. 실리코 디자인 및 테스트는 성공 가능성이 좋은 짧은 분석 목록을 생성하는 데 중요하지만 경험적 (시험관 내) 테스트는 최상의 실제 성능으로 분석기를 선택하는 데 중요합니다. 시험관 내 최적화 및 분석 테스트에는 반응 효율을 측정하고 분석의 민감도 및 특이성을 정의하는 것이 포함됩니다. 검출 및 정량화의 한계는 분석 개발에서 간과되는 두 가지 매개 변수이지만 데이터 해석에 중요합니다. 분석에 대한 표준 곡선의 여러 복제를 실행함으로써 LOD 및 LOQ를 쉽게 측정할 수 있습니다.1,5,30. 분석의 LOD 또는 LOQ와 관련하여 결과를 논의하는 연구는 거의 없지만, Sengupta 외(2019)는 분석의 LOD 및 LOQ를 데이터 해석 및 그래픽에 통합하여 결과를 보다 명확하게 이해하기 위한 것입니다.31. 내부 양수 컨트롤도 설계된 분석서에 멀티플렉션되어야 합니다. 샘플에서 PCR 억제에 대한 테스트없이, 거짓 네거티브가 발생할 수 있습니다24,32. 우리는 PCR 억제 테스트를위한 가장 쉬운 방법으로 대상 분석과 멀티 플렉스 IPC 분석의 사용을 제안23. 마지막으로, 환경 샘플에서 표적 증폭이 발생하는지 확인하기 위해 현장 및 실험실 에서 수집된 샘플의 분석 현장에서 분석이 필요합니다.24.
eDNA 샘플을 사용하여 종별 프로브 기반 qPCR 분석기의 사용에 대한 제한이 존재합니다. 예를 들어, 테스트를 위한 여러 분석서의 설계는 시퀀스 가용성에 의해 제한될 수 있으며 분석 성능측면에서 타협이 필요할 수 있습니다. 이러한 선택은 연구의 목표에 의해 인도되어야하며 결과26과함께보고해야합니다. 예를 들어, 희귀 종을 검출하는 것이 목표이고 몇 가지 양성이 예상되는 경우, 모든 검출이 시퀀싱에 의해 확인될 경우 불완전한 특이성(즉, 비표적 종의 증폭)을 가진 분석이 사용될 수 있다. 목표가 종의 지리적 범위를 모니터링하고 eDNA 농도 데이터가 필요하지 않은 경우 불완전한 효율성을 가진 분석이 사용될 수 있으며 데이터는 백분율 검출으로만 보고될 수 있습니다. 더욱이, 모든 잠재적인 동특이성이 실험실에서 시험되지 않는 한, 거의 가능하지 않습니다, 하나는 절대적으로 확실하게 분석의 진정한 특이성을 알 수 없습니다. 예를 들어, 분석은 클린치 강의 여러 담수 홍합 종에 대해 설계 및 테스트되었습니다. 다른 강 시스템에서이 분석서를 사용하려면 새로운 위치에있는 종의 제품군에 대해 테스트해야합니다. 분석 발달 도중 시험되지 않는 종 또는 인구 내의 유전 변이는 또한 특이성에 영향을 미칠 수 있습니다. 마지막으로, 분석이 높은 기술적 성능을 가지고 있는지 확인된 경우에도 현장에서 작업할 때 조건이 바뀝니다. 물 흐름, pH 및 동물 거동과 같은 비 분석 관련 조건은 상이한 eDNA 수집 및 추출 프로토콜을 사용할 수 있는 바와 같이 eDNA 검출가능성을 바꿀 수 있다. 최적화되고 잘 설명된 분석에 사용하면 이러한 매개 변수가 eDNA 검출에 미치는 영향을 이해하는 데 도움이 됩니다.
eDNA 분야는 탐색 분석 단계를 넘어 방법과 기술의 표준화를 증가시키기 위해 성숙하고 있습니다. 이러한 발전은 eDNA 기술, 능력 및 한계에 대한 이해를 향상시킬 것입니다. 위에서 설명하는 최적화 프로세스는 분석의 민감도, 특이성 및 재현성을 향상시킵니다. eDNA 방법의 이 정제 및 표준화의 궁극적인 목표는 eDNA 데이터를 기반으로 추론을 하는 연구원의 능력을 향상시키고 최종 사용자 및 스테이크 보유자의 결과에 대한 신뢰를 높이는 것입니다.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다. 자금 지원은 연구의 디자인에 아무런 역할이 없었다; 데이터의 수집, 분석 또는 해석에서; 원고의 글에서; 또는 결과를 게시하기로 결정합니다.
Acknowledgments
우리는 프라이머 개발 및 테스트에 도움이 알비 와두드와 트루디 프로스트 감사합니다. 이 연구에서 보고된 분석 설계에 대한 자금은 국방부 전략 환경 연구 개발 프로그램(RC19-1156)에 의해 제공되었습니다. 무역, 제품 또는 회사 이름을 사용하는 것은 설명적인 목적으로만 사용되며 미국 정부의 승인을 의미하지는 않습니다. 이 연구 기간 동안 생성된 데이터는 USGS 데이터 릴리스 https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5 사용할 수 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Place Reversible Racks with Covers | Globe Scientific | 456355AST | |
| Clean gloves (ie. latex, nitrile, etc.) | Kimberly-Clark | 43431, 55090 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 5408129 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0mL | Fisher Scientific | 2681332 | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | Bio-Rad | #HSP9601 | |
| IPC forward and reverse primers | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| IPC PrimeTime qPCR Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| IPC Ultramer DNA Oligo synthetic template | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Labnet MPS 1000 Compact Mini Plate Spinner Centrifuge for PCR Plates | Labnet | C1000 | |
| Microcentrifuge machine | Various | - | Any microcentrifuge machine that hold 1.5mL and 2.0mL tubes is typically okay. |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Invitrogen | AM9932 | |
| Pipette Tips GP LTS 1000 µL F 768A/8 | Rainin | 30389272 | |
| Pipette Tips GP LTS 20 µL F 960A/10 | Rainin | 30389274 | |
| Pipette Tips GP LTS 200 µL F 960A/10 | Rainin | 30389276 | |
| Pipettes | Rainin | Various | Depending on lab preference, manual or electronic pipettes can be used at various maximum volumes. |
| TaqMan Environmental Master Mix 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4396838 | |
| Target forward and reverse primers | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Target PrimeTime qPCR Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Target synthetic gBlock gene fragment | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product. used for qPCR standard dilution series |
| TE Buffer | Invitrogen | AM9849 | |
| VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXER | Fisher Scientific | 50728002 |
References
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