Methodenartikel

Reinigung von Tubulin mit kontrollierten posttranslationalen Modifikationen und Isotypen aus begrenzten Quellen durch Polymerisations-Depolymerisationszyklen

DOI:

10.3791/61826

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5. November 2020

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1PSL Research University, CNRS UMR3348, Institut Curie, 2Université Paris-Saclay, CNRS UMR3348, Université Paris Sud

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die Tubulinreinigung aus kleinen/mittleren Quellen wie kultivierten Zellen oder Gehirnen mit einer Maus unter Verwendung von Polymerisations- und Depolymerisationszyklen. Das gereinigte Tubulin ist in bestimmten Isotypen angereichert oder hat spezifische posttranslationale Modifikationen und kann in In-vitro-Rekonstitutions-Assays zur Untersuchung der Mikrotubuli-Dynamik und -Wechselwirkungen verwendet werden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein wichtiger Aspekt der Untersuchungen des Mikrotubuli-Zytoskeletts ist die Untersuchung des Mikrotubuli-Verhaltens in In-vitro-Rekonstitutionsexperimenten. Sie ermöglichen die Analyse der intrinsischen Eigenschaften von Mikrotubuli, wie dynamik, und ihrer Wechselwirkungen mit mikrotubuli-assoziierten Proteinen (MAPs). Der "Tubulin-Code" ist ein neu entstehendes Konzept, das auf verschiedene Tubulin-Isotypen und verschiedene posttranslationale Modifikationen (PTMs) als Regulatoren von Mikrotubuli-Eigenschaften und -Funktionen verweist. Um die molekularen Mechanismen des Tubulin-Codes zu erforschen, ist es entscheidend, In-vitro-Rekonstitutionsexperimente mit gereinigtem Tubulin mit spezifischen Isotypen und PTMs durchzuführen.

Bis heute war dies technisch eine Herausforderung als Gehirn Tubulin, das weit verbreitet in In-vitro-Experimente verwendet wird, beherbergt viele PTMs und hat eine definierte Isotypzusammensetzung. Daher haben wir dieses Protokoll entwickelt, um Tubulin aus verschiedenen Quellen und mit unterschiedlichen Isotypzusammensetzungen und kontrollierten PTMs zu reinigen, wobei der klassische Ansatz von Polymerisations- und Depolymerisationszyklen verwendet wird. Im Vergleich zu bestehenden Methoden, die auf der Affinitätsreinigung basieren, ergibt dieser Ansatz reines, polymerisationskompetentes Tubulin, da Tubulin, das gegen Polymerisation oder Depolymerisation resistent ist, während der aufeinanderfolgenden Reinigungsschritte verworfen wird.

Wir beschreiben die Reinigung von Tubulin aus Zelllinien, die entweder in Suspension oder als anhantibe Kulturen angebaut werden, und von einzelnen Mausgehirnen. Das Verfahren beschreibt zunächst die Erzeugung von Zellmasse sowohl in Suspensions- als auch in Hafteinstellungen, dem Lyseschritt, gefolgt von den aufeinanderfolgenden Stadien der Tubulinreinigung durch Polymerisations-Depolymerisationszyklen. Unsere Methode liefert Tubulin, das in Experimenten verwendet werden kann, die sich mit dem Einfluss des Tubulin-Codes auf die intrinsischen Eigenschaften von Mikrotubuli und Mikrotubuli-Wechselwirkungen mit assoziierten Proteinen befassen.

Einleitung

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Mikrotubuli spielen in vielen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle. Sie geben Zellen ihre Form, bauen meiotische und mitotische Spindeln für die Chromosomensegregation und dienen als Spuren für den intrazellulären Transport. Um diese vielfältigen Funktionen auszuführen, organisieren sich Mikrotubuli auf unterschiedliche Weise. Eine der faszinierendsten Fragen auf diesem Gebiet ist es, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die es den strukturell und evolutionär konservierten Mikrotubuli ermöglichen, sich an diese Fülle von Organisationen und Funktionen anzupassen. Ein potenzieller Mechanismus ist die Diversifizierung der Mikrotubuli, die durch das Konzept definiert wird, das als "Tubulin-Code"1,2,3" bekannt ist. Der Tubulin-Code umfasst zwei Hauptkomponenten: die Differentialintegration von α- und β-Tubulin-Genprodukten (Tubulin-Isotypen) in die Mikrotubuli und Tubulin-Posttranslationalmodifikationen (PTMs).

Seit den 1970er Jahren haben In-vitro-Rekonstitutionsexperimente, kombiniert mit sich entwickelnden Lichtmikroskopie-Techniken, den Weg für wichtige Entdeckungen über die Eigenschaften von Mikrotubuli geebnet: dynamische Instabilität4 und Laufband5,und ihre anderen Mechanismen und Funktionen6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Fast alle bisher durchgeführten In-vitro-Experimente basierten auf Tubulin, das aus Hirngewebe mit wiederholten Zyklen der Polymerisation und Depolymerisation16,17gereinigt wurde. Obwohl die Reinigung aus dem Hirngewebe den Vorteil der Gewinnung von hochwertigem Tubulin in großen Mengen (in der Regel Grammmengen) verleiht, ist ein wichtiger Nachteil die Heterogenität, da Tubulin, das aus Hirngewebe gereinigt wird, eine Mischung aus verschiedenen Tubulin-Isotypen ist und mit vielen Tubulin-PTMs angereichert ist. Diese Heterogenität macht es unmöglich, die Rolle eines bestimmten Tubulin-PTM oder Isotyps bei der Kontrolle von Mikrotubuli-Eigenschaften und -Funktionen abzustecken. Daher ist die Herstellung von Montage-kompetentem Tubulin mit kontrollierten Tubulin-PTMs und homogener Isotypzusammensetzung unerlässlich, um die molekularen Mechanismen des Tubulincodes anzugehen.

Kürzlich wurde ein Ansatz zur Reinigung von Tubulin durch Affinitätschromatographie mit der mikrotubulienbindenden TOG-Domäne (Tumor-überexprimiertes Gen) der Hefe Stu2pentwickelt. Bei dieser Methode wird Tubulin in rohen Lysaten von Zellen oder Geweben durch eine Säule geleitet, wo es an die matriximmobilisierte TOG-Domäne bindet, die die Analyse des gesamten Tubulinpools einer bestimmten, sogar sehr kleinen Probe ermöglicht. Ein lang erwarteter Ansatz zur Reinigung des rekombinanten Tubulins wurde in den letzten Jahren ebenfalls beschrieben. Es basiert auf dem Baculovirus-System, in dem ein bi-cistronischer Vektor, der α- und β-Tubulin-Gene enthält, in Insektenzellen19exprimiert wird. Diese Methode ist jedoch sehr umständlich und zeitaufwändig und wird daher hauptsächlich zur Untersuchung der Auswirkungen der Tubulinmutationen20 und der Tubulin-Isotypen21,22,23 in vitro verwendet.

Im aktuellen Protokoll beschreiben wir eine Methode, die den etablierten und weit verbreiteten Polymerisations-Depolymerisationsansatz als Blaupause verwendet, um Tubulin mit unterschiedlichen Modifikationsstufen entweder aus Zelllinien oder aus Maushirngewebe zu erzeugen24. Bei diesem Verfahren wird Tubulin zwischen dem löslichen (Tubulin-Dimer bei 4 °C) und der polymerisierten Form (Mikrotubuli bei 30 °C in Gegenwart von Guanosin 5'-Triphosphat [GTP]) geradelt. Jede Form wird durch aufeinander folgende Zentrifugationsschritte getrennt: Tubulin-Dimere bleiben nach einer Erkältung (4 °C) im Überstand, während Mikrotubuli bei 30 °C pelletiert werden. Darüber hinaus wird ein Polymerisationsschritt bei hoherPiperazin-N-Bis(2-Ethansulfonsäure) (PIPES) Konzentration durchgeführt, die die Entfernung von mikrotubuli-assoziierten Proteinen aus den Mikrotubuli und damit aus dem schließlich gereinigten Tubuli ermöglicht. Tubulin gereinigt aus HeLa S3 Zellen als Suspension oder anhantibe Kulturen gewachsen ist praktisch frei von jedem Tubulin PTM und wurde in den jüngsten In-vitro-Rekonstitutionsexperimente25,26,27,28verwendet. Wir haben die Methode zur Reinigung von Tubulin von einzelnen Mausgehirnen weiter angepasst, die für eine große Anzahl von Mausmodellen mit Änderungen in Tubulin-Isotypen und PTMs verwendet werden können.

Im Protokoll beschreiben wir zunächst die Erzeugung des Ausgangsmaterials (Zellmasse oder Hirngewebe), seine Lyse (Abbildung 1A), gefolgt von den aufeinanderfolgenden Schritten der Tubulinpolymerisation und Depolymerisation zur Reinigung des Tubulins (Abbildung 1B). Wir beschreiben ferner das Verfahren zur Beurteilung der Reinheit (Abbildung 2A,B) und der Menge (Abbildung 3A,B) des gereinigten Tubulins. Das Verfahren kann angepasst werden, um Tubulin zu produzieren, das mit einem ausgewählten PTM angereichert ist, indem ein modifizierendes Enzym in Zellen vor der Tubulinreinigung überexzessiert wird (Abbildung 4B). Alternativ können Tubulin-modifizierende Enzyme während des Reinigungsprozesses dem Tubulizuz hinzugefügt werden. Schließlich können wir Tubulin ohne spezifische Isotypen oder PTMs aus dem Gehirn von Mäusen reinigen, die einen Mangel an den entsprechenden Tubulin-modifizierenden Enzymen aufweisen (Abbildung 4B)29.

Die Methode, die wir hier beschreiben, hat zwei Hauptvorteile: (i) es ermöglicht die Produktion ausreichend großer Mengen Tubulin in relativ kurzer Zeit, und (ii) es erzeugt hochwertiges, reines Tubulin, entweder mit spezifischer Tubulin-Isotypzusammensetzung oder PTMs. Im zugehörigen Video dieses Manuskripts heben wir einige der kritischen Schritte dieses Verfahrens hervor.

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Protokoll

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Die Tierpflege und -verwendung für diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Europäischen Gemeinschaft (2010/63/UE) durchgeführt. Experimentelle Verfahren wurden von der Ethikkommission des Institut Curie CEEA-IC #118 (Genehmigungnr. 04395.03 von der nationalen Behörde) in Übereinstimmung mit den internationalen Richtlinien ausdrücklich genehmigt.

1. Herstellung von Reagenzien zur Tubulinreinigung

HINWEIS: Alle Puffer, die für die Tubulinreinigung verwendet werden, sollten Kaliumsalze und NICHT Natriumsalzeenthalten 30.

  1. Bereiten Sie 1 L des kompletten Mediums vor: Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM), mit 10% fetalem Rinderserum (FBS, 100 ml), 200 mM L-Glutamin (10 ml von 2 M Vorrat) und 1x Penicillin-Streptomycin (10 ml 100x Vorrat). Bei 4 °C lagern.
  2. 10 M Kaliumhydroxid (KOH) vorbereiten, 140 g KOH in Wasser auflösen, das Endvolumen auf 250 ml einstellen und bei Raumtemperatur lagern.
  3. 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH 8, durch Auflösen von 36,5 g EDTA in Wasser vorbereiten, den pH-Wert mit KOH auf 8,0 einstellen (sonst löst sich EDTA nicht auf) und das Endvolumen auf 250 ml, filtersterilisieren und bei Raumtemperatur aufbewahren.
  4. Bereiten Sie 5 mM Phosphat-gepufferte Saline (PBS)-EDTA vor, indem Sie 5 ml 0,5 M EDTA zu 500 ml PBS hinzufügen, filtersterilisieren und bei Raumtemperatur lagern.
  5. 0,5 M K-PIPES, pH 6,8 vorbereiten, 75,5 g PIPES in Wasser auflösen, mit KOH auf pH 6,8 (sonst löst sich PIPES nicht auf) und das Endvolumen auf 500 ml einstellen, filtersterilisieren und bei 4 °C lagern.
  6. 1 M K-PIPES, pH 6,8 vorbereiten, 15,1 g PIPES in Wasser auflösen, mit KOH auf pH 6,8 und das Endvolumen auf 50 ml einstellen, filtersterilisieren und bei 4 °C lagern.
  7. 0,5 M Kalium-Ethylenglykol-Bis(β-Aminoethylether)-N,N,N,-Tetraessigsäure(K-EGTA, pH 7,7) vorbereiten, indem 47,5 g EGTA in Wasser aufgelöst werden, auf pH 7,7 mit KOH und das Endvolumen auf 250 ml einstellen, filtersterilisieren und bei Raumtemperatur lagern.
  8. BRB80 (80 mM K-PIPES, pH 6,8; 1 mM K-EGTA; 1 mM Magnesiumchlorid [MgCl2]) Lösung durch Mischen von 3,2 ml 0,5 m PIPES, 40 l mit 0,5 m K-EGTA und 20 l von 1 M MgCl2 und Einstellen des Endvolumens auf 20 ml vorbereiten. Bei 4 °C lagern.
  9. 0,1 M Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) vorbereiten, indem 435 mg PMSF in Isopropanol aufgelöst werden, um ein Endvolumen von 25 ml zu erhalten und bei -20 °C lagern.
  10. Präechen Sie Protease-Inhibitoren (200x) durch Auflösen von 10 mg Aprotinin, 10 mg Leupeptin und 10 mg 4-(2-Aminoethyl)-Benzolesulfonylfluorid in Wasser, um ein Endvolumen von 2,5 ml zu erhalten, Aliquots von 100 l zu bilden und bei -20 °C zu lagern.
  11. Bereiten Sie 10% Triton X-100 vor, indem Sie 5 ml Triton X-100 in 45 ml Wasser mischen, filtersterilisieren und bei Raumtemperatur lagern.
  12. Lysispuffer (BRB80 ergänzt durch 1 mM 2-Mercaptoethanol, 1 mM PMSF, 1x Proteasehemmer mischen und, gegebenenfalls für HEK-293-Zellen, 0,2% Triton X-100) am Tag der Tubulinreinigung durch Mischen von 20 ml BRB80 mit 1,5 l 2-Mercaptoethanol, 200 l 0,1 M PMSF, 100 l der Proteaseinhibitoren mischung und, optional für HEK-293-Zellen, und optional für HEK-293-Zellen , 400 l von 10% Triton X-100.
    HINWEIS: 2-Mercaptoethanol ist giftig und sollte in der Dunstabzugshaube verwendet werden.
  13. 0,2 m GTP vorbereiten, indem Sie 1 g GTP in 9,5 ml Wasser auflösen, den pH-Wert mit KOH auf 7,5 einstellen, Aliquots von 20 l bilden und bei -20 °C lagern. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen.
  14. 1 M Tris(Hydroxymethyl)-Aminomethan-Hydrochlorid (Tris-HCl) vorbereiten, indem 60,56 g Tris in Wasser aufgelöst werden, mit HCl auf pH 6,8 einstellen, auf ein Endvolumen von 500 ml abschließen, filtersterilisieren und bei Raumtemperatur lagern.
  15. 5x Laemmli Probenpuffer (450 mM Dithiothreitol (DTT); 10% Natriumdodecylsulfat (SDS); 400 m Tris-HCl, pH 6,8; 50% Glycerin; 0,006% Bromphenolblau) durch Zugabe von 4 g SDS zu 16 ml vorgeheiztem 1 M Tris-HCl, pH 6,8, und die Lösung sanft mischen. 2,6 g DTT und 20 ml 100% Glycerin in die Mischung geben und rühren, bis die Lösung homogen wird. Fügen Sie die gewünschte Menge Bromphenolblau (2,5 mg) hinzu, um die erforderliche Farbintensität zu erreichen. 5 ml Aliquots herstellen und bei -20 °C lagern. Bereiten Sie die 2x Arbeitslösung des Laemmli-Probenpuffers vor, indem Sie den 5-fachen Vorrat in destilliertem Wasser verdünnen.

2. Amplifikations- und Erntequellen von Tubulin

HINWEIS: In diesem Protokoll wurden drei Tubulinquellen verwendet: (i) Zellen (HeLa S3 und HEK-293), die als Suspensionskulturen angebaut werden; ii) Zellen, die als Anhantibe Kulturen angebaut werden (HEK-293, HeLa und U2 OS); und (iii) Maus-Hirngewebe. Dieses Protokoll betrachtet den Tag der Tubulinreinigung als "Tag 0" und dementsprechend wurden andere Schritte relativ zu Tag 0 beschrieben.

  1. Amplifikation von Zellen
    1. Zellen, die als Suspensionskulturen angebaut werden
      HINWEIS: Um Tubulin erfolgreich von Suspensionskulturen zu reinigen, verwenden Sie mindestens 2 L Suspensionskultur.
      1. Für 2 L Suspensionskultur, beleben und wachsen Sie den bevorzugten Zelltyp, um 6 × 107 Zellen 10 Tage vor dem Tag der Vorbereitung zu erhalten. Am Tag -10, Tellerzellen auf sechs 15 cm Durchmesser Gerichte mit 107 Zellen pro Platte.
      2. Am Tag -8 die benötigte Menge an komplettem Medium auf 37 °C vorheizen. Fügen Sie 1 L vorgeheiztes Medium zu jeder Spinnerflasche unter sterilen Bedingungen hinzu. Legen Sie die Spinner auf einen Rührtisch von 20 bis 25 Umdrehungen pro Minute im Zellkultur-Inkubator, öffnen Sie die seitlichen Spinnerkappen leicht, damit das Medium der Atmosphäre des Inkubators gleichkommen kann.
        HINWEIS: Um Verunreinigungen zu vermeiden, reinigen Sie die Außenfläche der Medien und Spinnerflaschen gründlich mit 70 % Ethanol.
      3. Am Tag -7 versuchen sie, die auf 80–90 % zusammengewachsenen Zellen (ca. 1,8 × 108 Zellen) zu sammeln. Sammeln Sie Zellen aus 3 Gerichten gleichzeitig, drehen Sie sich nach unten (200 × g, 5 min, Raumtemperatur), und hängen Sie alle Zellen in 10 ml DMEM wieder auf.
        HINWEIS: Eine gründliche Dissoziation der Zellen an dieser Stelle ist sehr wichtig, um die Bildung größerer Aggregate in den Spinnerflaschen zu vermeiden, was das Zellüberleben beeinflusst und zu einer niedrigen Tubulinausbeute führt.
      4. Fügen Sie 5 ml der Zellsuspension zu jeder Spinnerflasche mit 1 L DMEM hinzu, geben Sie die Spinner an den Rührtisch im Zellkultur-Inkubator zurück und lassen Sie Zellen eine Woche lang wachsen.
    2. Zellen, die als anhandende Kulturen angebaut werden
      HINWEIS: Um Tubulin erfolgreich von anhaftenden Zellen zu reinigen, verwenden Sie mindestens 10 Gerichte mit 80–90% Zusammenfluss.
      1. Beleben und verstärken Sie den gewünschten Zelltyp, um 1 × 108 Zellen drei Tage vor dem Tag der Tubulinpräparation zu erhalten.
      2. Am Tag -3 diese Zellen auf zehn 15 cm Teller zu 1 × 107Zellen pro Schale und lassen Sie sie 80-90% Zusammenfluss wachsen.
      3. Am Tag -1, falls erforderlich, transfekieren Zellen mit einem Plasmid, um ein Tubulin-modifizierendes Enzym oder einen bestimmten Tubulin-Isotyp auszudrücken.
  2. Ernte der Zellen/Gehirngewebe
    1. Zellen, die als Suspensionskulturen angebaut werden
      1. Übertragen Sie die Zellsuspension von Spinnern in 1 L Zentrifugenflaschen (Materialtabelle)und Pelletzellen bei 250 × g,15 min, Raumtemperatur. Um sofort eine andere Kultur der HeLa S3-Zellen in den Spinnerflaschen zu starten, lassen Sie 100 ml Zellsuspension in den Spinnern und fügen Sie 1 L komplettes, vorgewärmtes DMEM in die Spinnerflasche.
        HINWEIS: Prüfen Sie sorgfältig auf bakterielle Kontamination, bevor Sie die Tubulinreinigung in Dierin untersuchen.
      2. Pelletzellen aus jeder Zentrifugenflasche in 10 ml eiskaltem PBS aussetzen und alle Zellen in 50 ml Schraubkappenrohre übertragen. Während der Wiedersuspension die Zellen auf Eis halten. Pellet die Zellen bei 250 × g, 15 min, 4 °C.
        HINWEIS: Befolgen Sie die Empfehlungen für die Reinigung und Lagerung von Spinnerflaschen (siehe Materialtabelle).
      3. Entsorgen Sie den Überstand und bestimmen Sie das Volumen des Zellpellets. Von 2 L Suspensionskultur (zwei Spinnerflaschen) erwarten Sie ein Zellpellet von 5–6 ml.
        HINWEIS: In dem unten beschriebenen Protokoll wird das Zellpelletvolumen auf 10 ml angenommen. Passen Sie das Experiment an die Pelletvolumina an.
      4. Fügen Sie 1 Volumen (10 ml) Lysepuffer hinzu und setzen Sie das Zellpellet wieder auf.
        HINWEIS: Das Verhältnis von Zellpelletvolumen zu Lysepuffervolumen ist sehr wichtig für eine erfolgreiche Tubulinreinigung. Durch die Zugabe von mehr Lysepuffer verringert sich die Tubulinkonzentration, die dann nicht die kritische Konzentration erreicht, die für die Polymerisation erforderlich ist, wodurch die Tubulinausbeute erheblich reduziert wird.
        HINWEIS: Zellen, die im Lysepuffer resuspendiert werden, können in flüssigem Stickstoff eingefroren und zwei Monate lang bei -80 °C gelagert werden.
    2. Zellen, die als anhandende Kulturen angebaut werden
      HINWEIS: Zellen aus anhaftenden Kulturen müssen sehr schnell geerntet werden, um eine erfolgreiche Tubulinreinigung zu erhalten (ca. 15 Minuten für die Ernte von zehn 15 cm Schalen). Drei Personen nahmen an diesem Schritt des Protokolls teil.
      1. Entfernen Sie das Medium von 15 cm Geschirr, indem Sie die Gerichte geneigt, und waschen Sie dann sanft die Zellen mit 7 ml PBS-EDTA bei Raumtemperatur (Person 1). Arbeiten Sie nur mit drei 15 cm Geschirr zu einer Zeit, um zu vermeiden, dass die Zellen ohne Medium oder Puffer verlassen.
      2. Fügen Sie den Zellen 5 ml PBS-EDTA hinzu und inkubieren Sie sie 5 min bei Raumtemperatur.
      3. Verwenden Sie einen Zellheber, um die Zellen sanft zu lösen, indem Sie sie an eine Kante der Schale schieben (Person 2), und sammeln Sie alle Zellen in einem 50 ml Schraubkappenrohr (Person 3). Spülen Sie jede Platte mit zusätzlichen 2 ml PBS-EDTA, um alle verbleibenden Zellen aus den Gerichten zu sammeln. Bewahren Sie in diesem Schritt das 50 ml Schraubkappenrohr mit der Zellsuspension auf Eis auf.
      4. Pellet die Zellen bei 250 × g, 10 min, 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und bestimmen Sie das Volumen des Zellpellets. Erwarten Sie ein Volumen von 1 ml von zehn 15 cm Geschirr.
        HINWEIS: In dem unten beschriebenen Protokoll wird das Zellpelletvolumen auf 10 ml angenommen. Passen Sie die Experimente an die Pelletvolumina an.
      5. Setzen Sie die Zellen in 1 Volumen (10 ml) Lysepuffer aus.
        HINWEIS: Zellen, die im Lysepuffer resuspendiert werden, können bis zu zwei Monate bei -80 °C gelagert werden.
    3. Hirngewebe
      HINWEIS: Mäuse jeden Alters, Geschlechts oder genetischen Hintergrunds können verwendet werden. Die Wahl des transgenen Mausstamms hängt von der zu behandelnden wissenschaftlichen Frage ab. In diesem Manuskript zeigen wir das Beispiel von Tubulin, das von der ttll1-/- Maus gereinigt wird, ohne ein großes Gehirnglutamylierungsenzym, das Tubulintyrosinligase-ähnliche 1 (TTLL1) Protein31.
      1. Opfern Sie die Maus durch Zervixdislokation, enthaupten Sie schnell und sammeln Sie das Gehirn in einem runden Bodenrohr. Wenn es überschüssiges Blut im Gehirn gibt, waschen Sie schnell mit Lysepuffer. Sammeln Sie das Gehirn, sobald die Maus geopfert wird, da eine post-mortem Verzögerung den Erfolg der Tubulinreinigung beeinflussen kann. Verwenden Sie Rundbodenrohre, um die Breite der Sonde aufzunehmen, die für die Homogenisierung verwendet wird.
        HINWEIS: Gesammelte Mausgehirne können in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zu 3 Jahre bei -80 °C gelagert werden.
      2. Fügen Sie einem einzelnen Gehirn, das aus einer erwachsenen Maus extrahiert wurde, einen Lysepuffer von 500 l hinzu. Für den Rest des Protokolls wird das Volumen des hinzugefügten Lysepuffers auf 10 ml angenommen. Passen Sie ihr Experiment an die Anzahl der zu verwendenden Gehirne an.

3. Lyse von Zellen oder Hirngewebe

  1. Zellen, die als Suspensionskulturen angebaut werden
    1. Für HEK-293 lysieren Sie die Zellen auf dem Eis, indem Sie sich wiederholt mit Pipettenspitzen unterschiedlicher Breite nach oben und unten pfeifen. Befestigen Sie zunächst eine p1000-Spitze an einer 10 ml Pipette und pipette die Zellsuspension alle 5 min nach oben und unten, für 10 min (drei Zyklen der Pipetten). Zweitens, befestigen Sie eine p200 Spitze an einer p1000 Spitze und weitere Pipette alle 5 min, für 20 min (fünf Zyklen der Pipetten).
    2. Für HeLa S3 lysieren Sie die Zellen mit einer französischen Presse (siehe Tabelle der Materialien für Einstellungen).
    3. Nehmen Sie das 1/100. Volumen des Lyse-Mix (L) (200 l für 20 ml L), und fügen Sie das gleiche Volumen von 2x Laemmli Puffer, kochen für 5 min, und lagern bei -20 °C für die weitere Analyse.
  2. Zellen, die als anhandende Kulturen angebaut werden
    1. Übertragen Sie die Zellen in ein 14 ml Rundbodenrohr, dessen Höhe für die Beschallungssonde reduziert wurde (siehe Tabelle der Materialien für Einstellungen). Beschallen Sie die Zellen für 45 Pulse und bestätigen Sie die Zelllyse, indem Sie einen Tropfen des Lysemixes unter dem Mikroskop abtasten.
      HINWEIS: Die Anzahl der Impulse kann je nach Zelltyp für die Tubulinreinigung variieren. Die Zusersonicing-Zellen zu viel könnten tubulitieren und wird die Reinigungsleistung negativ beeinflussen.
    2. Pipette die Zellen auf und ab auf Eis alle 5 min für 20 min (fünf Zyklen der Pipetten), mit einer p200 Spitze.
    3. Nehmen Sie das 1/100. Volumen der Lysemischung (L) (200 l für 20 ml L) und fügen Sie das gleiche Volumen von 2x Laemmli Puffer hinzu, kochen Sie für 5 min und lagern Sie bei -20 °C für weitere Analysen.
  3. Hirngewebe
    1. Lyse das Gehirngewebe mit einem Gewebemixer (siehe Tabelle der Materialien für Einstellungen). Alternativ lysieren Sie das Gewebe mit einem Mikrorohr-Stößel oder einer gleichwertigen Ausrüstung und Pipette auf Eis mit einer 1 ml Spritze mit einer 18 G Nadel.
    2. Nehmen Sie das 1/100. Volumen der Lysemischung (L) (200 l für 20 ml L), und fügen Sie das gleiche Volumen von 2x Laemmli Puffer hinzu, kochen Sie für 5 min, und lagern Sie bei -20 °C für weitere Analysen.

4. Reinigung von Tubulin

  1. Lysate-Klarstellung
    1. Lysat (Trennpellet und löslicher Anteil der Lysemischung) durch Zentrifugation bei 150.000 × g,4 °C, 30 min. Siehe Tabelle der Materialien für Details über Ultrazentrifugenrotoren und Rohre. Bei Zellextrakten wird oft nach der Zentrifugation eine weiße schwimmende Schicht gebildet. Übertragen Sie diese schwimmende Schicht nicht zusammen mit dem Überstand, da sie die Tubulinpolymerisation stört. Verwenden Sie eine Spritze mit entsprechendem Volumen, die an einer langen 20 G oder 21 G Nadel befestigt ist, um den Überstand vorsichtig zu entfernen, ohne die schwimmende Schicht zu stören. Wenn der Überstand noch bewölkt ist, Zentrifuge bei 5.000 × g, 4 °C für 10 min.
    2. Übertragen Sie den Überstand (SN1) auf ein Ultrazentrifugenrohr und notieren Sie dessen Volumen. Für ein 10 ml Zellpellet erwarten Sie ein Volumen von 12 ml für SN1.
    3. Nehmen Sie das 1/100. Volumen von SN1 (120 l für 12 ml SN1), und fügen Sie das gleiche Volumen von 2x Laemmli Puffer hinzu, kochen Sie für 5 min, und lagern Sie bei -20 °C für weitere Analysen.
    4. Setzen Sie das Pellet (P1) in BRB80 (Materialtabelle) mit dem gleichen Volumen wie SN1 wieder aus. Nehmen Sie das 1/100. P1-Volumen (200 l für 20 ml P1), und fügen Sie das gleiche Volumen von 2x Laemmli-Puffer hinzu, kochen Sie 5 min und lagern Sie bei -20 °C für weitere Analysen.
  2. Erste Polymerisation im Low-Molarity Buffer
    1. Bereiten Sie den Polymerisationsmix vor, indem Sie 1 Volumen SN1 (12 ml), 1/200volumen von 0,2 m GTP (60 l; Endkonzentration 1 mM) und 0,5 Volumen vorgewärmtes Glycerin (6 ml) in einem Schraubverschlussrohr mit dem entsprechenden Volumen kombinieren.
      HINWEIS: Glycerin wird als Crowding-Agent in den Polymerisationsschritten im gesamten Protokoll verwendet und wird daher bei der Berechnung der Konzentrationen anderer Komponenten nicht berücksichtigt.
    2. Pipette die Verwechslung nach oben und unten, sanft die Bildung von Luftblasen zu vermeiden und übertragen Sie es auf die entsprechenden Ultrazentrifugenrohre.
      HINWEIS: Stellen Sie beim Übertragen der Mischung auf die Rohre das Gewicht der Rohre (paarweise) ein. Dies ermöglicht es dem Experimentator, nach dem Polymerisationsschritt direkt mit der Sedimentation von Mikrotubuli fortzufahren. Tun Sie dies für alle Polymerisationsschritte im gesamten Protokoll.
    3. Die Rohre mit Parafilm bedecken, auf ein Wasserbad auf 30 °C übertragen und 20 min inkubieren.
    4. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 150.000 × g, 30 °C für 30 min. Entfernen Sie den Überstand (SN2), und halten Sie das Pellet der polymerisierten Mikrotubuli (P2).
      HINWEIS: Microtubule Pellet kann bis zu 1 Jahr lang bei -80 °C eingefroren und gelagert werden.
    5. Nehmen Sie das 1/200-te Volumen von SN2 (90 l für 18 ml SN2) und fügen Sie das gleiche Volumen von 2x Laemmli Puffer hinzu, kochen Sie für 5 min, und lagern Sie bei -20 °C für weitere Analysen.
  3. Erste Depolymerisation
    1. Depolymerisieren Sie Mikrotubuli durch Zugabe von eiskaltem BRB80 zum Pellet P2, und lassen Sie sie 5 min auf dem Eis: für Tubulin aus Zellen 1/60th (200 l) hinzufügen, und für Tubulin aus Gehirnen 1/20th (600 l) des Volumens des SN1 hinzufügen.
      HINWEIS: Das Volumen des eiskalten BRB80, das dem Pellet während der Depolymerisationsschritte zugesetzt wird, ist immer relativ zum Volumen von SN1.
    2. Setzen Sie das Mikrotubulipellet vorsichtig aus, um Luftblasen zu vermeiden, bis die Lösung vollständig homogen ist. Verwenden Sie eine p1000 Spitze für ein paar Zyklen der Pipetten, gefolgt von einer p200 Spitze alle 5 min, für 20 min (fünf Zyklen der Pipetten). Dies ist ein entscheidender Schritt für den Erfolg der Tubulinreinigung.
    3. Übertragen Sie die Lösung auf geeignete Ultrazentrifugenrohre und drehen Sie sie bei 150.000 × g, 4 °C für 20 min. Übertragen Sie den SN3 auf ein neues 1,5 ml Ultrazentrifugenrohr. Das nach diesem Zentrifugationsschritt (P3) gebildete Pellet enthält ausgefällte Proteine (mikrotubulie-assoziierte Proteine oder MAPs) und nicht-depolymerisierte Mikrotubuli. Der Überstand (SN3) enthält lösliche Komponenten: depolymerisierte Tubulin-Dimere und MAPs, die sich von den depolymerisierten Mikrotubuli gelöst haben.
    4. Nehmen Sie 1–4 L SN3, und fügen Sie 9 Bände 2x Laemmli Puffer, kochen für 5 min, und lagern Sie bei -20 °C für weitere Analysen.
    5. Setzen Sie das Pellet P3 in BRB80 (im gleichen Volumen von SN3) wieder auf, nehmen Sie 1–4 l, und fügen Sie 9 Bände mit 2x Laemmli-Puffer hinzu, kochen Sie für 5 min und lagern Sie bei -20 °C.
  4. Zweite Polymerisation (in Hoch-Molarity-Puffer)
    1. Bereiten Sie den Polymerisationsmix vor, indem Sie 1 Volumen SN3 (200 l), 1 Volumen vorgewärmt1 M PIPES (200 l, Endkonzentration 0,5 m), 1/100th Volumen von 0,2 m GTP (2 l, Endkonzentration 1 mM) und 1 Volumen vorgewärmten Glycerin (200 l) in einem Rohr mit dem entsprechenden Volumen kombinieren.
    2. Pipette die Verwechslung nach oben und unten, Vermeidung der Bildung von Luftblasen, und übertragen Sie es auf Ultrazentrifugenrohre.
    3. Die Rohre mit Parafilm bedecken, in ein Wasserbad auf 30 °C geben und 20 min inkubieren.
    4. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 150.000 × g, 30 °C für 30 min. Entfernen Sie den Überstand (SN4), und halten Sie das Pellet der polymerisierten Mikrotubuli (P4). Das Pellet P4 enthält die polymerisierten Mikrotubuli, und der Überstand SN4 enthält unpolymerisiertes Tubulin, MAPs und andere lösliche Proteine.
      HINWEIS: Das Mikrotubulipellet nach dem zweiten Polymerisationsschritt kann bis zu einem Jahr bei -80 °C eingefroren und gelagert werden.
    5. Nehmen Sie 1–4 l und fügen Sie 9 Bände 2x Laemmli Puffer, kochen für 5 min, und lagern Sie bei -20 °C für weitere Analysen.
  5. Zweite Depolymerisation
    1. Depolymerisieren Sie Mikrotubuli durch Zugabe von eiskaltem BRB80 zum Pellet P4, und lassen Sie sie 5 min auf dem Eis: für Tubulin aus Zellen 1/100th (120 l) hinzufügen, und für Tubulin aus Gehirnen 1/40th (300 l) des Volumens des SN1 hinzufügen.
    2. Pipette nach oben und unten mit einer p200 Spitze alle 5 min, für 20 min (fünf Zyklen der Pipetten).
    3. Übertragen Sie die Lösung auf ein 1,5 ml Ultrazentrifugenrohr und drehen Sie sie bei 150.000 × g, 4 °C für 20 min. Übertragen Sie den SN5 auf ein neues 1,5 ml Ultrazentrifugenrohr. Das nach diesem Zentrifugationsschritt (P5) gebildete Pellet enthält nicht-depolymerisierte Mikrotubuli. Der Überstand (SN5) enthält das lösliche Tubulin.
    4. Nehmen Sie 1–4 l und fügen Sie 9 Bände 2x Laemmli Puffer, kochen für 5 min, und lagern Sie bei -20 °C für weitere Analysen.
    5. Das Pellet P5 in BRB80 (gleiches Volumen von SN5) wieder aufhängen, 1–4 l nehmen und 9 Volumina mit 2x Laemmli-Puffer hinzufügen, 5 min kochen und bei -20 °C für weitere Analysen lagern.
  6. Dritte Polymerisation (in Low-Molarity Buffer)
    1. Bereiten Sie den Polymerisationsmix vor: 1 Volumen SN5 (120 l), 1/200t Volumen von 0,2 m GTP (0,6 l, Endkonzentration 1 mM) und 0,5 Volumen vorgewärmtes Glycerin (60 l) in einem Rohr mit dem entsprechenden Volumen.
    2. Pipette die Verwechslung nach oben und unten, sanft vermeidung bildung von Luftblasen, und übertragen Sie es auf die entsprechenden Ultrazentrifugenrohre.
    3. Die Rohre mit Parafilm bedecken, in ein Wasserbad auf 30 °C geben und 20 min inkubieren.
    4. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 150.000 × g, 30 °C für 30 min. Das Pellet (P6) enthält polymerisierte Mikrotubuli und der Überstand SN6 kleine Mengen nicht polymerisierten Tubulins.
      HINWEIS: Mikrotubuli-Pellets können bis zu einem Jahr bei -80 °C eingefroren und gelagert werden.
    5. Nehmen Sie 1–4 l und fügen Sie 9 Bände 2x Laemmli Puffer, kochen für 5 min, und lagern Sie bei -20 °C für weitere Analysen.
  7. Dritte Depolymerisation
    1. Depolymerisieren Sie Mikrotubuli durch Zugabe von eiskaltem BRB80 zum Pellet P6, und lassen Sie sie 5 min auf dem Eis: für Tubulin aus Zellen 1/100th (120 l) hinzufügen, und für Tubulin aus Gehirnen 1/40th (300 l) des Volumens des SN1 hinzufügen.
    2. Pipette nach oben und unten mit einer p200 Spitze alle 5 min, für 20 min (fünf Zyklen der Pipetten).
    3. Übertragen Sie die Lösung auf die entsprechenden Ultrazentrifugenrohre und drehen Sie sie bei 150.000 × g, 4 °C für 20 min. Übertragen Sie SN7 auf ein neues 1,5 ml Ultrazentrifugenrohr. Das Pellet (P7) enthält geringe Mengen nicht-depolymerisierter Mikrotubuli. Der Überstand (SN7) enthält ausschließlich depolymerisierte Mikrotubuli (lösliches Tubulin).
    4. Nehmen Sie 1–4 l und fügen Sie 9 Bände 2x Laemmli Puffer, kochen für 5 min, und lagern Sie bei -20 °C für weitere Analysen.
    5. Das Pellet P7 in BRB80 (gleiches Volumen von SN7) wieder aufhängen, 1–4 l nehmen und 9 Volumina mit 2x Laemmli-Puffer hinzufügen, 5 min kochen und bei -20 °C für weitere Analysen lagern.
    6. Quantifizieren Sie die Menge an Tubulin (siehe Repräsentative Ergebnisse) und aliquot SN7 in kleine Mengen, Snap-Freeze, und lagern Sie bei -80 °C.

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Ergebnisse

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Das Hauptziel dieser Methode ist die Herstellung von hochwertigem, montagekompetentem Tubulin in Mengen, die für wiederholte In-vitro-Experimente mit den gereinigten Komponenten ausreichen. Aus diesem Tubulin zusammengesetzte Mikrotubuli können in Rekonstitutionstests verwendet werden, die auf der gesamten internen Reflexionsfluoreszenz-Mikroskopie (TIRF) mit dynamischen oder stabilen Mikrotubuli basieren, in Experimenten, die Mikrotubulidynamik, Wechselwirkungen mit MAPs oder molekularen Motoren und die Krafterzeugung d...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die hier beschriebene Methode bietet eine Plattform, um schnell hochwertiges, montagekompetentes Tubulin in mittelgroßen Mengen aus Zelllinien und einzelnen Mausgehirnen zu erzeugen. Es basiert auf dem Gold-Standard-Protokoll der Tubulinreinigung von Rinderhirnen, die seit vielen Jahren im Feld verwendet werden16,17. Ein besonderer Vorteil des Ansatzes ist die Verwendung von Suspensionskulturen von HeLa S3-Zellen, die, sobald sie etabliert sind, große Mengen an Z...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde unterstützt durch den ANR-10-IDEX-0001-02, den LabEx Cell'n'Scale ANR-11-LBX-0038 und das Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. Cj wird vom Institut Curie, der französischen National Research Agency (ANR) vergeben ANR-12-BSV2-0007 und ANR-17-CE13-0021, dem Institut National du Cancer (INCA) Grant 2014-PL BIO-11-ICR-1 und der Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) Grant DEQ2017036756. MMM wird durch das Fondation Vaincre Alzheimer Stipendium FR-16055p und durch das France Alzheimer Grant AAP SM 2019 n°2023 unterstützt. JAS wurde durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skodowska-Curie-Zuschussvereinbarung Nr. 675737 und des FRM-Zuschusses FDT201904008210 unterstützt. SB wurde durch den FRM-Zuschuss FDT201805005465 unterstützt.

Wir danken allen Mitgliedern des Janke-Labors, insbesondere J. Souphron, sowie G. Lakisic (Institut MICALIS, AgroParisTech) und A. Gautreau (Ecole Polytechnique) für die Hilfe bei der Erstellung des Protokolls. Wir danken der Tieranlage des Institut Curie für die Hilfe bei der Mauszucht und -pflege.

Der von J. Frankel und M. Nelson entwickelte Antikörper 12G10 wurde von der Developmental Studies Hybridoma Bank gewonnen, die unter der Schirmherrschaft der NICHD entwickelt und von der University of Iowa gepflegt wurde.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1  M MgCl2 Sigma#M1028
1-L ZellkulturgefäßeTechne F7610 Wird für Spinnerkulturen verwendet. Rühren Sie niemals die leeren Spinnerflaschen um. Wenn sich Spinnerflaschen im Zellkulturinkubator befinden, halten Sie die seitlichen Ventile der Spinnerflaschen immer leicht geöffnet, um das Gleichgewicht des Mediums mit dem Inkubator zu erleichtern. s Atmosphäre. Füllen Sie die Spinnerflaschen nach Gebrauch sofort mit Leitungswasser, um ein Austrocknen der verbleibenden Zellen an den Flaschenwänden zu vermeiden. Waschen Sie die Flaschen mit entionisiertem Wasser, fügen Sie ca. 200 ml entionisiertes Wasser hinzu und stellen Sie den Autoklaven auf. Unter einer sterilen Zellkulturhaube das Wasser entfernen und die Flaschen mehrere Stunden lang vollständig trocknen lassen, immer noch unter der Haube. Verwenden Sie niemals Reinigungsmittel zur Reinigung der Spinnerflaschen, da Spuren des Reinigungsmittels für die Zellen schädlich sein können.
1,5- und 2-ml-Röhrchen
mit rundem Boden
15 cm Durchmesser sterile Kulturschalen
15-ml-Röhrchen
2-Mercaptoethanol Sigma #M31482-Mercaptoethanol ist giftig und sollte unter der Motorhaube verwendet werden.
4-(2-Aminoethyl)-benzolsulfonylfluorid Sigma 
40% AcrylamidBio-Rad #161-0140
5-, 10- 20-ml-Spritzen
5-ml-, 10-ml-, 25-ml-sterile Pipetten
50-ml-Röhrchen
Ammoniumpersulfat (APS)Sigma#A3678
Anti-Alpha-Tubulin-Antikörper, 12G10 Entwickelt von J. Frankel und M. Nelson, bezogen von der Developmental Studies Hybridoma Bank, entwickelt unter der Schirmherrschaft des NICHD und gepflegt von der University of IowaVerdünnung: 1/500
Anti-glutamylierter Tubulin-Antikörper, GT335 AdipoGen #AG-20B-0020Verdünnung: 1/20.000
AprotininSigma 
Balance (0,1 – 10 g)
Beckman 1-l-Flaschen aus Polypropylen Zum Sammeln von Spinnerkulturen
Beckman Avanti J-26 XP ZentrifugeZum Sammeln von Spinnerkulturen
Biologischer RührerTechne MCS-104L Eingebaut in den Zellkultur-Inkubator (für Spinnerkulturen), 25 U/min für Hela S3 und HEK 293 Zellen
Bis N,N'-Methylen-Bis-Acrylamid Bio-Rad #161-0201
Mixer IKA Ultra-Turrax®  Verwenden Sie zum Lysieren von Hirngewebe eine 5-mm-Sonde, wobei das Gerät auf Leistung 6 oder 7 eingestellt ist. Das Hirngewebe 2-3 mal für 15 s auf Eis pürieren.
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma 
Bromphenolblau Sigma #1.08122
Carboxypeptidase A (CPA)Sigma#C9268Konzentration: 1.7  U/µ l
Zellkulturhaube
Zellkultur-Inkubator auf 37° eingestellt C, 5%
(DMSO)  Sigma #D8418DMSO kann die Zell- und Hautpermeabilität anderer Verbindungen verbessern. Vermeiden Sie den Kontakt und verwenden Sie Haut- und Augenschutz.
DMEM Medium Life Technologies #41965062
DVB-T, DL-Dithiothreitol Sigma 
EDTAEuromedex#EU0007-C
EGTASigma 
Ethanol absolut Fisher Chemical #E/0650DF/15
Fötales Rinderserum (FBS)Sigma 
französische Druckzellenpresse Thermo electron corporation #FA-078Amit einer #FA-032-Zelle; zum Lyse großer Mengen von Zellen. Auf mittleres Verhältnis und den Überdruck von 1.000 psi einstellen (entspricht 3.000 psi in der Sprengkammer).
Glycerin  VWR Chemicals #24388.295
GlycinSigma#G8898
GTP Sigma 
Heizblock Stuart 
Hela-Zellen ATCC® CCL-2&Handel;
Hela S3 Zellen ATCCATCC® CCL-2.2&Handel;
Salzsäure (HCl) VWR#20252.290
Inverses Mikroskop Mit Fluoreszenz, wenn die Zelltransfektion nachgewiesen werden soll
Isopropanol VWR #20842.298
jetPEIPolyplus #101
JLA-8.1000 BremsscheibeZum Sammeln von Spinnerkulturen
KOH Sigma #P1767KOH ätzend ist und Verbrennungen verursacht, verwenden Sie Augen- und Hautschutz.
L-Glutamin Life Technologies #25030123
Laborzentrifuge für 50-ml-RöhrchenSigma4-16 K 
Leupeptin Sigma#L2884
Flüssiger Stickstoff 
Mikropipetten p2.5, p10, p20, p100, p200 und p1000 und entsprechende Spitzen
MicropestlesEppendorf#0030 120.973
Hirngewebe der Maus Die Pflege und Verwendung der Tiere für diese Studie erfolgte in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Europäischen Gemeinschaft (2010/63/EU). Die experimentellen Verfahren wurden von der Ethikkommission des Institut Curie CEEA-IC #118 (Genehmigung Nr. 04395.03 der nationalen Behörde) in Übereinstimmung mit den internationalen Richtlinien ausdrücklich genehmigt.
Nadeln 18G x 1 ½ ” (1,2 X 38 mmTerumo#18G
Nadeln 20G x 1 ½ ” (0,9 X 38 mmTerumo#20G
Nadeln 21G x 4 ¾ ” (0,8 X 120 mmB.Braun#466 5643
Parafilm
PBS Life Technologies #14190169
Penicillin-Streptomycin Life Technologies #15140130
pH-Messgerät
Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)Sigma #P7626PMSF-Pulver ist gefährlich. Verwenden Sie bei der Zubereitung von PMSF-Lösungen Haut- und Augenschutz.
ROHRE Sigma 
Pipettenjunge
RotorenBeckman 70.1 Ti; TLA-100.3; und TLA 55
SDS-PAGE Elektrophorese-Gerät Bio-Rad 
SDS, Natriumdodecylsulfat VWR #442444HZur Zubereitung von Laemmeli Puffer 
SDS, Natriumdodecylsulfat Sigma #L5750Zur Herstellung von 'TUB' SDS-PAGE Gelen
Sonicator Branson#101-148-070Wird zum Lysieren von Zellen verwendet, die als adhärente Kulturen gezüchtet wurden. Verwenden Sie eine Sonde mit einem Durchmesser von 6,5 mm, stellen Sie den Ultraschallator auf " Steuerung der Ausgabe" 1, " Einschaltdauer" 10% und Zeit je nach verwendetem Zelltyp.
Tischzentrifuge für 1,5 ml GefäßeEppendorf5417R 
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylendiamin Sigma#9281
Trichostatin A (TSA)Sigma#T8552
Triton X-100 Sigma 
Trizma base (Tris)Sigma 
Trypsin Life Technologies#15090046
Ultrazentrifugen-Rotoren TLA-55, TLA-100.3 und 70.1 Ti Rotoreneingestellt auf 4°; C oder 30°; C basierend auf der Notwendigkeit des Experiments 
Ultrazentrifugen-Röhrchen Beckman#357448 zur Verwendung mit TLA-55 Rotor
Ultrazentrifugen-Röhrchen Beckman#349622zur Verwendung mit TLA-100.3 Rotor
Ultrazentrifugenröhrchen Beckman#355631 zur Verwendung mit 70,1 Ti Rotor
UltrazentrifugenBeckmanOptima L80-XP (oder gleichwertig) und Optima MAX-XP (oder gleichwertig)Auf 4° eingestellt C oder 30°; C basierend auf der Notwendigkeit des Experiments 
Vortex-Mischer
Wasserbad mit Schwimmern oder SchlauchhalternSet auf 30°; C 
14-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss#A8456mit Schraubverschluss#A1153#A7906 CO2-Dimethylsulfoxid #D9779#E3889#F7524#G8877#SBH130D#P6757#1658001FC#T9284#T1503

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Tubulin ReinigungTubulin IsotypenZelllinienkulturenLysis des MausgehirnsSDS PAGE AnalyseImmunoblot AnalyseMikrotubuli assoziierte ProteineIn vitro Rekonstitution

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