PCR-Mutagenese, Klonierung, Expression, schnelle Proteinreinigungsprotokolle und Kristallisation des Wildtyps und der mutierten Formen der Tryptophan-Synthase

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt eine Reihe von aufeinanderfolgenden Methoden zur Expression und Reinigung von Salmonella typhimurium tryptophan synthase vor, die dieses Protokoll zu einem schnellen System zur Reinigung des Proteinkomplexes an einem Tag machen. Abgedeckte Methoden sind ortsgerichtete Mutagenese, Proteinexpression in Escherichia coli,Affinitätschromatographie, Gelfiltrationschromatographie und Kristallisation.

Zusammenfassung

Strukturstudien mit Tryptophansynthase (TS) Bienzymkomplex (α₂β₂ TS) aus Salmonella typhimurium wurden durchgeführt, um seinen katalytischen Mechanismus, sein allosterisches Verhalten und Details der enzymatischen Umwandlung von Substrat in Ein produkt in PLP-abhängigen Enzymen besser zu verstehen. In dieser Arbeit ermöglichte ein neuartiges Expressionssystem zur Herstellung der isolierten α- und isolierten β-Untereinheit die Reinigung hoher Mengen reiner Untereinheiten und α₂β₂StTS-Komplexes aus den isolierten Untereinheiten innerhalb von 2 Tagen. Die Reinigung erfolgte durch Affinitätschromatographie, gefolgt von Spaltung des Affinitäts-Tags, Ammoniumsulfat-Fällung und Größenausschlusschromatographie (SEC). Um die Rolle von Schlüsselrückständen am Enzym β besser zu verstehen, wurde in früheren Strukturstudien eine ortsseitige Mutagenese durchgeführt. Ein weiteres Protokoll wurde erstellt, um den Wildtyp und die Mutanten α₂β₂StTS-Komplexen zu reinigen. Ein einfaches, schnelles und effizientes Protokoll mit Ammoniumsulfatfraktionierung und SEC ermöglichte die Reinigung von α₂β 2StTS-Komplexes an_einemeinzigen Tag. Beide in dieser Arbeit beschriebenen Reinigungsprotokolle haben erhebliche Vorteile im Vergleich zu früheren Protokollen zur Reinigung desselben Komplexes mit PEG 8000 und Spermin, um den α₂β₂StTS-Komplex entlang des Reinigungsprotokolls zu kristallisieren. Die Kristallisation von Wildtyp- und einigen Mutiertenformen erfolgt unter leicht unterschiedlichen Bedingungen, was die Reinigung einiger Mutanten mit PEG 8000 und Spermin beeinträchtigt. Um Kristalle vorzubereiten, die für röntgenkristallographische Untersuchungen geeignet sind, wurden mehrere Anstrengungen unternommen, um Kristallisation, Kristallqualität und Kryoprotektion zuoptimieren. Die hier vorgestellten Methoden sollten allgemein zur Reinigung von Tryptophansynthase-Untereinheiten und Wildtyp- und Mutanten-α₂β₂StTS-Komplexen anwendbar sein.

Einleitung

Der Tryptophansynthase (TS) Bienzymkomplex (α₂β₂₎ist ein allosterisches Enzym, das die letzten beiden Schritte in der Biosynthese der Aminosäure L-Tryptophan in Bakterien, Pflanzen und Pilzen katalysiert^1,2,3. Das Bakterium Salmonella enterica serovar typhimurium (St) verursacht eine schwere Magen-Darm-Infektion bei Menschen und anderen Tieren. Da Menschen und höhere Tiere kein TS (EC 4.2.1.20) haben, wurde die Hemmung von S. typhimurium α₂β₂ TS-Komplex (α₂β₂StTS) als potenzielles Wirkstoffziel für die Behandlung von Kryptosporidiose und Tuberkulose⁴, Genital- und Augeninfektionen⁵und für den möglichen Herbizideinsatz in der Landwirtschaft⁶untersucht. Die α-Untereinheit katalysiert die aldolytische Spaltung von Indol-3-Glycerinphosphat (IGP) zu Glyceraldehyd-3-phosphat (GAP) und Indol, durch die Bildung eines Indolenin-Tautomer-Zwischen- und anschließenden Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungsspaltungsspaltung zur Herstellung von GAP und Indol^3,6. Die β-katalytische Stelle enthält ein pyridoxalen 5′-Phosphat (PLP)-Cofaktormolekül, das über eine Schiff-Base an β-Lys87 gebunden ist, das im Verlauf der Reaktionen am Enzym β-Untereinheit^3,7als Elektronensenke fungiert. Die β-Stelle katalysiert den Ersatz des L-Serin-Seitenkettenhydroxyls durch Indol, um L-Tryptophan und ein Wassermolekül in einer PLP-abhängigen Reaktion zu erhalten. St. TS dient als langjähriges Modell zur Untersuchung der Substratkanalisierung und allosterischen Kommunikation innerhalb von Multienzymkomplexen^2,3. Die bidirektionale allosterische Kommunikation zwischen den α- und β-Untereinheiten von TS ist notwendig, um die katalytischen Schritte zu synchronisieren und die Indolfreisetzung während der L-Tryptophan-Synthese zu verhindern³. Um diese Bemühungen zu erweitern, haben wir mehrere Mutanten (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr und β-Ser377Ala) durch Einzelpunktmutation vorbereitet, die bei weiteren Untersuchungen der Beziehung zwischen Enzymstruktur, Mechanismus und Funktion an der katalytischen Stelle der St.TS-β-Untereinheit verwendet werden sollen.

Detaillierte Forschungen zum katalytischen Mechanismus von α₂β₂StTS wurden von der Forschungsgruppe von Edith W. Miles initiiert. Frühe Studien mit nativen Escherichia coli α₂β₂ TS-Komplex konzentrierten sich auf die Reinigung und Charakterisierung der isolierten α-Untereinheit^8,9, isolierten β-Untereinheit^10,11 und die Rekonstitution des α₂β₂ TS-Komplexes aus den isolierten Untereinheiten¹². Die Reinigung erfolgte durch Ammoniumsulfatfällung, Probendialyse, DEAE-Sephadex-Chromatographie, Dialyse und eine zweite chromatographische Runde auf einer DEAE-Sephadex-Säule^12. In einem anderen Protokoll wurde die Reinigung desselben Komplexes verbessert, indem das geklärte Zelllysat auf eine DEAE-Sephadex-Säule geladen wurde, gefolgt von einem chromatographischen Schritt auf einer Sepharose-4B-Säule, Ammoniumsulfatfällung und Dialyse^13. Beide Reinigungsprotokolle dauern 4-5 Tage. Escherichia coli α₂β₂ TS Komplex kristallisiert, aber Kristalle waren zu dieser Zeit nicht für die Röntgenbeugung geeignet.

In einer neuartigen Studie wurden rekombinante und Wildtypformen von S. typhimurium α₂β₂ TS-Komplex gereinigt und^{kristallisiert 14,15}. Der rekombinante α₂β₂StTS-Komplex wurde im E. coli-Stamm CB149 überexprimiert, der den pEBA-10-Expressionsvektor trug. Erste Kristallisations- und Röntgenbeugungsdatenerfassung und Analyse des α₂β₂StTS-Komplexes wurden berichtet¹⁴. Lange und dünne Nadeln wie α₂β₂StTS-Kristalle beeinträchtigten jedoch die Strukturstudien. In einem Versuch, bessere Röntgenbeugungsdaten zu sammeln, wurde ein anderes Reinigungsprotokoll beschrieben, um den Wildtyp und die mutierten Formen des α₂β₂StTS-Komplexes¹⁵zu reinigen. Die Reinigung erfolgte mit einer anfänglichen Ausfällung mit Spermin und PEG 8.000 in das geklärte Zelllysat und ein großer sperriger Niederschlag wurde durch Zentrifugation entfernt. Die überstandige Fraktion, die hohe Mengen an α₂β₂StTS-Komplex enthielt, wurde 16-48 h bei 4 °C gelagert, bis gelbe Kristalle ausbrachen. Kristalle wurden gewaschen und ausgiebig gegen verschiedene Puffer dialysiert. Proteinkomplex wurde in Ammoniumsulfat enthaltenden Puffer rekristallisiert und dialysiert¹⁵. Obwohl die Proteinkristallisation von den Protein- und Fällungsmittelkonzentrationen in Lösung abhängt, ist es schwierig, die Reinigung für andere mutierte Formen des α₂β₂StTS-Komplexes in Lösung zu überwachen, vorherzusagen und zu reproduzieren. Dieses Protokoll hat den Vorteil, dass es keine chromatographischen Methoden verwendet; Die Nachteile sind jedoch die lange Reinigungszeit, die zum Kristallisieren, Dialysieren und Rekristallisieren erforderlich ist und typischerweise 5-7 Tage benötigt. Um Kristalle zu erhalten, die für die Röntgendatenerfassung geeignet sind, wurden mehr als 600 Kristallisationsbedingungen unter Verwendung einer Kombination und Variation von Proteinkonzentration, Temperatur, Fällungsmitteln (PEG 4.000, 6.000 und 8.000) und Additiven (CaCl₂, MnCl₂, ZnCl₂, Cadaverin, Putrescin, Spermin oder Spermidin)^{bewertet 15}. Kristalle hatten eine bessere kristalline Form und wuchsen schneller unter Bedingungen, die 12% PEG 8.000 und 2 mM Spermin enthielten. Die Kristallisation war bei 25 °C günstiger als bei 4, 30 oder 42 °C und wuchs innerhalb von 3 Tagen auf maximale Abmessungen^{an 15}. Mehrere α₂β₂StTS Kristallstrukturen wurden damals (1996-1999) berichtet^{16,17,18,19,20,21} und viele andere Strukturen wurden bis heute veröffentlicht.

Hier besteht der Hauptzweck darin, alternative Protokolle zur Reinigung der Tryptophansynthase und zur Optimierung der Proteinkristallisation vorzustellen. Die vorliegende Arbeit zeigt signifikante Verbesserungen zur Reinigung des Wildtyps isoliert α-Untereinheit (αStTS), isolierter β-Untereinheit (βStTS), rekonstituiert α₂β₂StTS-Komplexes aus den isolierten Untereinheiten, und Wildtyp- und Mutantenformen des α₂β₂StTS-Komplexes. Die Vorteile gegenüber früheren Protokollen sind beträchtlich, da die Reinigungszeit deutlich verkürzt und Kristallisation und Kryoprotektion optimiert wurden. Mutantenformen von α₂β₂StTS-Komplexes, die in dieser Arbeit entwickelt wurden, haben sich in der Nähe des gleichen Zustands kristallisiert, der für die Wildtypform verwendet wird. Eine Feinkristallisationsoptimierung war jedoch notwendig, um große Einkristalle von ausreichender Qualität für die Strukturbestimmung bei nahezu atomarer Auflösung zu erhalten. Bis heute sind in der Protein Data Bank (PDB) 134 Tryptophansynthase-Kristallstrukturen hinterlegt, die 101, 31 bzw. 2 Kristallstrukturen für Bakterien, Archaeen und Eukaryoten ausmachen. Schönerweise gehören 73 Strukturen zu S. enterica serovar typhimurium und 5 Kristallstrukturen des α₂β₂StTS-Komplexes haben Auflösungsgrenzen von mehr als 1,50 Angström. Es überrascht nicht, dass 4 von 5 in unserer Forschungsgruppe vorbereitet wurden (PDB IDs: 5CGQ bei 1,18 Å, 4HT3 bei 1,30 Å, 4HPJ bei 1,45 Å, 6DZ4 bei 1,45 Å Auflösung). Die raffinierten Kristallstrukturen der mutierten Form von α₂β₂StTS-Komplexes sollen neue Einblicke in den Mechanismus und die Rolle liefern, die essentielle Aminosäurereste bei der L-Tryptophan-Synthese spielen.

Protokoll

1. Schnelles Protokoll zur Reinigung der α- und β-Untereinheit und des rekombinierten α₂β₂StTS-Komplexes

1. DNA subklonieren in pETSUMO-Expressionsvektor
   1. Erhalten Sie das translational koppelnde Gen (trpA und trpB), das für die α-und β-Untereinheitender Tryptophansynthase aus dem Bakterium Salmonella enterica serovar typhimurium kodiert, das im pEBA-10-Expressionsvektor²²geklont ist. Verwenden Sie den pEBA-10-Vektor als DNA-Vorlage.
      HINWEIS: Alternativ können die unten aufgeführten Primer verwendet werden, um beide Gene aus dem Genom von Salmonella enterica serovar typhimurium zu amplifizieren. Alle molekularbiologischen Schritte wurden wie in Molecular Cloning: A Laboratory Manual²³beschrieben befolgt.
   2. Verwenden Sie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um die Polynukleotidsequenz der α-Untereinheit(αStTS) mit Primern αStTS-FW-Bam und αStTS-Rev-Eco und die vollständige Sequenz der β-Untereinheit (βStTS) mit Primern βStTS-FW-Bam und βStTS-Rev-Hind einzeln zu verstärken. Verwenden Sie eine Schmelztemperatur von ca. 55 °C und eine Polymerase-Verlängerungszeit von 2 min.
      1. Verwenden Sie High-Fidelity-DNA-Polymerase (z. B. Phusion) und das Protokoll des Herstellers, um die DNA-Sequenzen zu amplifizieren. Für eine 50 μL PCR-Reaktion werden 34 μL nukleasefreies Wasser, 10 μL 5x Reaktionspuffer, 1 μL 10 mM dNTPs, 1 μL 10 μM Vorwärtsprimer, 1 μL 10 μM Reverse Primer, 1 μL Template DNA (200 ng), 1,5 μL DMSO, 0,5 μL Phusion DNA Polymerase hinzugefügt.
      2. Verwenden Sie für das PCR-Programm einen Warmstart (180 Sekunden bei 98 °C), gefolgt von 30 Amplifikationszyklen (30 Sekunden bei 98 °C, 30 Sekunden bei 55 °C und 120 Sekunden bei 72 °C) und einer abschließenden Verlängerung (300 Sekunden bei 72 °C).
         HINWEIS: Die kursiv formatierten Sequenzen entsprechen den Einschränkungen BamHI, EcoRI, BamHI und HindIII. Die Enzymspaltungseffizienz in der Nähe der Termini von PCR-Fragmenten wurde durch Zugabe zusätzlicher Basen (Kleinbuchstabensequenzen) erhöht.
         αStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGGAACGCTACGAAAA-3′
         αStTS-Rev-Eco: 5′-ccgGAATTCTTATGCGCGGCTGGC-3′
         βStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGACAACACTTCTCAAC-3′
         βStTS-Rev-Hind: 5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCCCTC-3′
   3. Laden Sie das PCR-Produkt auf 0,8% Agarosegel in 1x TAE-Puffer (40 mM Tris, 20 mM Essigsäure und 1 mM EDTA) bei 6 V / cm, extrahieren Sie das interessierende DNA-Band und reinigen Sie das PCR-Fragment mit einem Silica-Perlen-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      1. Verdauen Sie mindestens 200 ng jedes DNA-Fragments mit geeigneten Restriktionsenzymen und vom Hersteller empfohlenen Bedingungen für 2 Stunden bei 37 °C.
      2. Um eine 50 μL Restriktionsaufschlussreaktion einzurichten, fügen Sie 34 μL nukleasefreies Wasser, 10 μL DNA (200 ng), 5 μL 10x Reaktionspuffer, 0,5 μL Restriktionsenzym 1 und 0,5 μL Restriktionsenzym 2 hinzu.
      3. Laden Sie das Verdauungsprodukt auf 0,8% Agarosegel auf 1x TAE bei 6 V / cm, Gelextrakt und Gel reinigen Sie das verdaute Fragment mit einem kommerziellen Kit.
   4. Subklon einzeln jedes Fragment in den E. coli Expression modifizierten Vektor pET SUMO, zuvor mit entsprechenden Enzymen verdaut und Gel gereinigt.
      HINWEIS: Dieser Vektor ist eine modifizierte Version des kommerziellen pET SUMO. Dieser Vektor wurde für das Klonen von Restriktionsenzymen optimiert. Die Multi-Cloning-Site (MCS) des pET28b-Vektors(BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI und XhoI) wurde in die pET SUMO-Klonierungsstelle eingefügt. Dieser Vektor enthält ein N-terminales 6x-Histidin-Tag im Rahmen mit dem Small Ubiquitin-like Modifier Protein (SUMO) und mehreren Klonstellen.
   5. Ligate 100 ng modifiziertes pET SUMO und 50 ng PCR-Fragment mit T4-DNA-Ligase für 2 Stunden bei 25 °C.
   6. Wandeln Sie das konstruierte Plasmid in kompetente Zellen des E. coli-Stammes DH10Bα Zellen um. Plattenzellen auf LB-Agarplatten mit 35 μg/ml Kanamycin. Inkubieren Sie die Platte über Nacht invertiert bei 37 °C.
   7. Wählen Sie aus jeder Transformation eine einzelne Kolonie aus, bereiten Sie hochreine Plasmid-DNA vor und führen Sie eine DNA-Sequenzierung durch, um zu überprüfen, ob αStTS oder βStTS im Frame mit dem N-terminalen His6-SUMO-Tag geklont wurden.
      HINWEIS: Bereiten Sie Glycerinvorräte der Zellkultur vor (drehen Sie die Zellsuspension in 16% Endkonzentration von sterilem Glycerin) und lagern Sie sie langfristig bei -80 °C.
   8. Wandeln Sie das Expressionsplasmid SUMO-αStTS oder SUMO-βStTS einzeln in kompetente Zellen des E. coli-Expressionsstamms Rosetta (DE3) pLysS mit einem T7-Promotor-basierten System um. Die rekombinanten Zellen werden auf Luria Bertani (LB)-Agarplatten mit 35 μg/ml Kanamycin und Chloramphenicol plattiert. Inkubieren Sie die Platte über Nacht invertiert bei 37 °C.
   9. Nach erfolgreicher Koloniebildung wählen Sie eine einzelne Kolonie (ohne Satellitenkolonien) und verteilen Sie sie in 5 ml LB-Medium mit beiden Antibiotika. Kulturzellen über Nacht mit Schütteln bei 200 U/min bei 37 °C.
      HINWEIS: Bereiten Sie Glycerinvorräte der Zellkultur vor, lagern Sie sie langfristig bei -80 °C oder verwenden Sie sie sofort für die rekombinante Proteinexpression.
2. Ausdruck der Untereinheiten SUMO-αStTS und SUMO-βStTS
   1. Impfen Sie frische E. coli-Stämme Rosetta (DE3) pLysS-Zellen, die SUMO-αStTS oder SUMO-βStTS beherbergen, konstruiert oder kratzt einen Teil des gefrorenen Glycerinbestands in eine 50-ml-LB-Kultur mit 35 μg / ml Kanamycin und Chloramphenicol. Züchten Sie die Zellen über Nacht mit Schütteln bei 200 U / min bei 37 °C.
   2. Am nächsten Morgen impfen Sie 5 ml der Übernachtzellkultur in einem frischen und sterilen 2x 1000 ml LB mit 2% Glycerin plus Kanamycin und Chloramphenicol (2,8 L Fernbachkolben). Zellkultur mit Schütteln bei 200 U/min bei 37 °C züchten.
      HINWEIS: Die Expression von SUMO-αStTS oder SUMO-βStTS in LB-Brühe ergibt 125-150 mg markiertes Protein pro Liter. Erwägen Sie, das Protokoll nach oben oder unten zu skalieren, um bestimmte Anforderungen zu erfüllen.
   3. Rekombinante Proteinexpression induzieren, wenn der OD₆₀₀ 0,6-0,8 durch Zugabe von Isopropyl β-D-1 Thiogalactopyranosid (IPTG) bei einer Endkonzentration von 0,4 mM erreicht, gefolgt von inkubation bei 30 °C über Nacht mit Schütteln bei 200 U /min.
   4. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 4.000 x g bei 4 °C für 20 min. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellpellets mit kalter Lysepuffer 1 (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, enthaltend 500 mM NaCl, 5% Glycerin, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 40 mM Imidazol-Cl) auf ein Endvolumen von 60 ml.
      HINWEIS: Zellen können langfristig bei -80 °C gelagert oder sofort zur Proteinreinigung verwendet werden. Um Zellen zu lagern, teilen Sie die Zellsuspension in 2 x 50 mL Einwegzentrifugen-Konienröhrchen auf und halten die Zellpellets bis zum Proteinreinigungsschritt bei -80 °C.
3. Reinigung der α- und β-Untereinheiten der Tryptophan-Synthase
   HINWEIS: Alle Verfahren sind bei 4 °C durchzuführen, sofern nicht anders angegeben. Um die Reinigungszeit zu verkürzen, equilibrieren Sie Ni-NTA-Agarose-Nickel-geladene Affinitätssäulen und Größenausschlusssäulen im Puffer vor der Proteinreinigung oder während der rekombinanten Proteinexpression.
   1. Unterbrechen Sie Zellpellets durch Beschallung mit einem digitalen Sonifier mit 1/2 "Hornsonde (oder einem ähnlichen Gerät). Führen Sie 20 Zyklen bei 80% Amplituden-Tastverhältnis im Eiswasserbad mit 10 s Puls und 20 s Ruhe oder bis zur vollständigen Zellstörung durch.
   2. Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 30.000 x g für 30 min. Saugen Sie den Überstand an, um sicherzustellen, dass sich das Pellet nicht aus dem Röhrchen löst. Filtern Sie den Überstand mit einer 0,45 μm Filtereinheit auf Eis und fließen Sie ihn durch eine 15 mL Ni-NTA-Agarose-Nickel-geladene Affinitätssäule, die im Lysepuffer 1 vorgleich ist.
      HINWEIS: Jede Ni-NTA-Agarosesäule wird verwendet, um entweder SUMO-αStTS oder SUMO-βStTS rekombinantes Protein zu reinigen. Die Reinigung kann in einer 2x 5 mL Ni-NiTA-Säule durchgeführt werden, die an ein schnelles Proteinflüssigkeitschromatographiesystem angeschlossen ist. Reinigen Sie ein Protein nach dem anderen.
   3. Ni-NTA-Agarosesäule in 100 ml Lysepuffer 1 waschen.
   4. Fahren Sie mit einer 80 mL einstufigen Elution mit Puffer E1 fort (25 mM Tris-Cl-Puffer, pH 7,8, enthält 200 mM NaCl, 5% Glycerin und 400 mM Imidazol-Cl).
      HINWEIS: SUMO-Protease verträgt bis zu 300 mM Imidazol und die Membran von Zentrifugalfiltergeräten verträgt bis zu 100 mM Imidazol. Wir empfehlen, eine Ammoniumsulfatfällung durchzuführen, um hohe Mengen an Imidazol zu entfernen und die Reinigungszeit zu verringern, anstatt die Proteinprobe zu verdünnen und Zeit mit der Proteinkonzentration zu verschwenden.
   5. Beurteilen Sie das Anfangsvolumen der Überstandsfraktion. Langsam kleine Mengen Ammoniumsulfat gleichzeitig hinzufügen, bis eine Sättigung von 60% (39,48 g/ 100 ml) bei 25 °C erreicht ist. Rühren Sie die Lösung 30 Minuten lang vorsichtig um und vermeiden Sie Blasen. Zentrifuge bei 10.000 x g für 15 min.
   6. Saugen Sie die Überstandsfraktion vorsichtig an und entsorgen Sie sie. Die Pelletfraktion wird in 20 mL Probenpuffer (20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 300 mM NaCl und 5% Glycerin) resuspendiert.
   7. Für die His-SUMO-Tag-Spaltung mit SUMO-Protease das rekombinante Fragment der Ubl-spezifischen Protease 1 aus Saccharomyces cerevisiae im Verhältnis 1:1000 hinzufügen und die Mischung 2 Stunden bei 4 °C inkubieren.
   8. Zentrifugieren Sie das Aufschlussprodukt bei 10.000 x g bei 25 °C für 20 minuten, um Proteinaggregate zu entfernen, bevor Sie die Probe durch eine Affinitätschromatographiesäule laden.
   9. Entfernen Sie Spuren des His6-SUMO-Tags, das die 20 ml resuspendierte Probe an einer 15 mL Ni-NTA-Agarosesäule passiert, die zuvor im Lysepuffer 1 ausgeglichen war.
   10. Sammeln Sie die Pass-Through-Probe, die die nicht markierten αStTS oder βStTS enthält.
   11. Waschen Sie die Ni-NTA-Säule in 20 ml Puffer 1, um Reste von nicht markierten αStTS oder βStTS zu sammeln.
   12. Konzentrieren Sie jede Untereinheit separat mit einer 15 mL 10 kDa Trennzentrifugalfiltereinheit durch Spinnen bei 3.000 x g bei 4 °C. Das konzentrierte Protein wird in ein frisches 2,0 ml Röhrchen und eine Mikrozentrifuge (10.000 x g, 10 min, 4 °C) gegeben, um Aggregate zu entfernen. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration^24,bereiten Sie 1 ml Aliquoten bei 20-25 mg ml^-1vor, kennzeichnen Sie sie, gefrieren Sie sie in flüssigem Stickstoff und lagern Sie sie bei -80 °C.
       HINWEIS: Vorgereinigte Proteinproben können langfristig bei -80 °C gelagert oder sofort zur Proteinreinigung auf einer Größenausschlusschromatographiesäule (SEC) verwendet werden.
   13. Nehmen Sie ein Protein aliquot (20 mg) und Mikrozentrifuge bei 10.000 x g für 10 min, um Aggregate vor SEC zu entfernen.
   14. Laden Sie die Probe auf eine Größenausschlusschromatographiesäule (z. B. HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR), die an eine schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie mit einer Durchflussrate von 0,5 ml^min-1angeschlossen ist, zuvor im SEC-Puffer ausgeglichen (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% Glycerin, 0,1 mM Pyridoxalphosphat).
       HINWEIS: Um höhere Mengen isolierter αStTS oder βStTS-Untereinheit zu reinigen und die Anzahl der SEC-Geschosse zu verringern, laden Sie eine 5-ml-Probe bei 20-25 mg ml^-1 auf eine Größenausschlusschromatographiesäule mit einer Durchflussrate von 1,5 ml min^-1.
   15. Beurteilen Sie die Qualität von αStTS oder βStTS in der Spitzenfraktion mit einer 12% igen bzw. 15% Natriumdodecylsulfat-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), die mit Coomassie brillantblauer^{Färbung 25 gefärbt}ist.
   16. Protein mit frischen 15 mL 10 kDa cutoff Zentrifugalfiltereinheiten konzentrieren, Proteinkonzentration²⁴bestimmen, 0,5 mL Aliquoten bei 20-25 mg ml^-1vorbereiten, etikettieren, in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.
4. Reinigung des α₂β₂StTS Komplexes aus den α- und β-Untereinheiten
   HINWEIS: Gleichgewichten Sie die Größenausschlusschromatographiesäule (Sephadex S-200 HR oder Superdex 200 pg) im SEC-Puffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% Glycerin, 0,1 mM Pyridoxalphosphat).
   1. Um den Wildtyp-komplex α₂β₂StTS aus den α- und β-Untereinheiten zu reinigen, konzentratieren Sie Proben von αStTS- und βStTS-Untereinheiten bei 4 °C auf.
   2. Aliquots kombinieren (1,2 αStTS: 1,0 βStTS Molarverhältnis) und bei 4 °C für 1 h inkubieren.
      HINWEIS: Ein Überschuss an αStTS ist notwendig, um sicherzustellen, dass der größte Teil βStTS in den α₂β₂StTS-Komplex integriert wird.
   3. Proteinaggregate durch Mikrozentrifugation entfernen (10.000 x g, 10 min, 4 °C).
   4. Laden Sie den geklärten Überstand auf die Größenausschlussspalte.
   5. Beurteilen Sie die Qualität von αStTS oder βStTS in der Spitzenfraktion mit einer 12% igen bzw. 15% Natriumdodecylsulfat-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), die mit Coomassie brillantblauer^{Färbung 25 gefärbt}ist.
   6. Proteinkonzentration²⁴bestimmen, 250-1000 μL Aliquoten bei 15-20 mg ml^-1vorbereiten, in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.

2. Reinigung des Wildtyps oder der mutierten Form des α₂β₂StTS-Komplexes

1. Standortgesteuerte Mutagenese zur Herstellung mutierter βStTS
   1. Verwenden Sie das Konstrukt pEBA-10-Expressionsvektor²² als DNA-Vorlage während der zweistkschrittigen Polymerase-Kettenreaktion, um spezifische Punktmutationen in die β-Ketten-TS-Polynukleotidsequenz einzuführen.
      HINWEIS: Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine Einzelpunktmutation in α- oder β-Untereinheit aus der Salmonella typhimurium tryptophan-Synthase einzuführen. Für zusätzliche, neue Oligonukleotidprimer, die die gewünschte Mutation enthalten, müssen entsprechend gestaltet werden. In dieser Arbeit werden Mutationen βQ114A, βK167T βS377A aufgelistet.
   2. Führen Sie PCR-Reaktionen mit Paaren von Nukleotidprimern TS-FW-NcoI/Q114A-Rev, TS-FW-NcoI/K167T-Rev und TS-FW-NcoI/S377A-Rev durch, um die Fragmente A1, B1 und C1 zu erzeugen.
      HINWEIS: Oligonukleotid TS-NcoI-FW bzw. TS-SacI-Rev glühen vor und nach der αβ St TS-Polynukleotidsequenz, die im pEBA-10-Vektor geklont wurde.
      1. Verwenden Sie High-Fidelity-DNA-Polymerase (z. B. Phusion) und das Protokoll des Herstellers, um die DNA-Sequenzen zu amplifizieren. Für eine 50 μL PCR-Reaktion werden 34 μL nukleasefreies Wasser, 10 μL 5x Reaktionspuffer, 1 μL 10 mM dNTPs, 1 μL 10 μM Forward Primer, 1 μL 10 μM Reverse Primer, 1 μL Template DNA (200 ng), 1,5 μL DMSO, 0,5 μL DNA-Polymerase hinzugefügt.
      2. Verwenden Sie für das PCR-Programm einen Heißstart (180 Sekunden bei 98 °C), gefolgt von 30 Verstärkungszyklen (30 Sekunden bei 98 °C, 30 Sekunden bei 55 °C und 120 Sekunden bei 72 °C) und einer abschließenden Verlängerung (300 Sekunden bei 72 °C).
         HINWEIS: Alle molekularbiologischen Schritte wurden wie in Molecular Cloning: A Laboratory Manual²³beschrieben befolgt. Während eine Kleinbuchstabensequenz einer Einschränkungsstelle entspricht, entspricht eine fette und kursive Sequenz einer Mutation.
         TS-FW-NcoI: 5'-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3'
         Q114A-Rev: 5'-C AGA GGC GAC GCC GTG CGC ACC GGC GCC GGT TTC-3'
         K167T-Rev: 5'-CTC GTT ACA GGC ATC TGT TAG CGT AGC GGA GCC-3'
         S377A-Rev: 5'-C TTT ATC TCC GCG GCC AGC GAG ATT GAC CAC CAG-3'
   3. Führen Sie PCR-Reaktionen mit Paaren von Nukleotidprimern TS-Rev-SacI/Q114A-FF, TS-Rev-SacI/K167T-FF und TS-Rev-SacI/S377A-FF durch, um die Fragmente A2, B2 und C2 zu erzeugen.
      TS-Rev-SacI (5'-TTA tgc gcg GCT GGC GGC TTT CAT GGC TGA G-3'
      Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GCG CAC GGC GTC GCC TCT G-3'
      K167T-FF 5'-GGC TCC GCT ACG CTA ACA GAT GCC TGT AAC GAG-3'
      S377A-FF 5'-CTG GTG GTC AAT CTC GCT GGC CGC GGA GAT AAA G-3'
   4. Verwenden Sie die Polymerase-Kettenreaktion, um die Teilfragmente einzeln zu verstärken. Verwenden Sie eine Schmelztemperatur von 55 °C und eine Polymerase-Verlängerungszeit von 2 min.
   5. Um die zweite Runde von PCR-Reaktionen durchzuführen, laden Sie das PCR-Produkt oben auf 0,8% Agarosegel auf 1x TAE bei 6 V / cm und Gelextrakt und Gel reinigen die interessierenden Fragmente.
      1. Die Fragmente A1/A2, B1/B2 und C1/C2 separat in äquimolaren Mengen mischen, das Gemisch 10 min bei 96 °C erhitzen und bei 25 °C glühen. Erweitern Sie die rekombinanten Stränge mit einer High-Fidelity-Polymerase und Desoxyribonukleotiden gemäß dem Protokoll des Herstellers.
   6. Um eine hohe Kopienzahl des mutierten DNA-Fragments in voller Länge zu erzeugen, fügen Sie die Oligoprimer TS-FW-NcoI und TS-Rev-SacI hinzu, um eine zweite PCR durchzuführen.
   7. Laden Sie das PCR-Produkt auf 0,8% Agarose in 1x TAE-Puffer bei 6 V / cm, extrahieren Sie das interessierende DNA-Band, reinigen Sie das PCR-Fragment und fahren Sie mit einer geeigneten Restriktionsverdauung für 2 Stunden bei 37 ° C unter den entsprechenden Puffern und vom Hersteller empfohlenen Bedingungen fort.
      1. Verdauen Sie mindestens 200 ng jedes DNA-Fragments mit geeigneten Restriktionsenzymen und vom Hersteller empfohlenen Bedingungen für 2 Stunden bei 37 °C. Um eine 50 μL Restriktionsaufschlussreaktion einzurichten, fügen Sie 34 μL nukleasefreies Wasser, 10 μL DNA (200 ng), 5 μL 10x Reaktionspuffer, 0,5 μL Restriktionsenzym 1 und 0,5 μL Restriktionsenzym 2 hinzu. Laden Sie das Aufschlussprodukt auf 0,8% Agarose in 1x TAE-Puffer bei 6 V/cm und reinigen Sie das verdaute PCR-Fragment.
   8. Verdauen Sie 200 ng pEBA-10-Konstrukt mit Restriktionsenzymen NcoI und SacI nach Empfehlung des Herstellers. Laden Sie das Aufschlussprodukt auf 0,8% Agarosegel in 1x TAE-Puffer bei 6 V / cm, schneiden Sie das dem Vektor entsprechende Band heraus und reinigen Sie den verdauten Vektor.
   9. Ligate 100 ng Vektor mit 50 ng PCR-Fragment, zuvor verdaut und gereinigt, mit T4-DNA-Ligase für 2 Stunden bei 25 °C. Wandeln Sie das konstruierte Plasmid in kompetente Zellen um E. coli Stamm DH10B Zellen. Plattenzellen auf LB-Agarplatten mit 50 μg/ml Ampicillin. Inkubieren Sie die Platte über Nacht invertiert bei 37 °C.
   10. Wählen Sie eine einzelne Kolonie (ohne Satellitenkolonien) aus jeder Zelltransformation und dispergieren Sie sie in 5 ml LB-Medium, das Ampicillin enthält. Züchten Sie die Zellen über Nacht mit Schütteln bei 200 U / min bei 37 °C. Bereiten Sie 10 μg hochreine Plasmid-DNA aus jedem entwickelten Konstrukt vor. Bereiten Sie Glycerinvorräte der Zellkultur vor (Zellsuspension in 16% Endkonzentration von sterilem Glycerin drehen) und lagern Sie sie langfristig bei -80 °C.
   11. Führen Sie eine DNA-Sequenzierung durch, um die Sequenz in voller Länge zu bestätigen, die die α- und β-Untereinheiten der Tryptophan-Synthase kodiert. Bestätigen Sie jede einzelne Mutation und verwerfen Sie jedes Plasmidkonstrukt, das unerwünschte zufällige Mutationen enthält. Die in dieser Studie verwendeten Oligonukleotidprimer sind unten aufgeführt.
       TS-1F: 5'-ATGACAACACTTCTCAAC-3'
       TS-1R: 5'-GAAATGCCAGAACATTAC-3'
       TS-2F: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
       TS-3F: 5'-GATGATGCAAACAGC-3'
       TS-4F: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3'
       TS-5F: 5'-CGTTGCATCATCTCATTG-3'
       HINWEIS: Oligonukleotidprimer TS-1F, TS-1R, TS-2F und TS-3F glühen auf der Polynukleotidsequenz der β-Untereinheit (GenBank-Beitrittscode: CP051286.1). Die Primer TS-4F und TS-5F glühen auf der Polynukleotidsequenz der α-Untereinheit (GenBank-Beitrittscode: CP053865.1).
   12. Verwenden Sie 200 ng jedes Plasmidkonstrukts (pEBA-10-βQ114A, pEBA-10-βK167T und pEBA-10-βS377A), um kompetente Zellen des E. coli-Expressionsstamms CB149 ohne das trp-Operon ²⁶zu transformieren. Nach erfolgreicher Koloniebildung wählen Sie eine einzelne Kolonie und züchten die Zellen in 5 ml LB-Medium mit 50 μg / ml Ampicillin. Kultur im Bakterieninkubator bei 37 °C über Nacht. Bereiten Sie Glycerinvorräte der Zellkultur vor, lagern Sie sie langfristig bei -80 °C oder verwenden Sie sie sofort für die rekombinante Proteinexpression.
       HINWEIS: Eine einzelne Einzelpunktmutation in α- oder β-Untereinheit aus der Salmonella typhimurium tryptophan-Synthase kann die Enzymfunktion oder die geringere Synthese von L-Tryptophan im E. coli-Stamm CB149 beeinträchtigen. Bitte erwägen Sie, entweder den E. coli-Stamm BL21(DE)pLys-S oder Rosetta (DE3)pLys-S zu verwenden, wenn in_einemSDS-PAGE-Gel keine Expression oder geringere Mengen rekombinanter α 2 β₂StTS-Komplexes nachgewiesen werden.
2. Expression von Wildtyp und mutierter Form von α₂β₂StTS Komplex in E. coli
   1. Züchten Sie E. coli Expressionsstamm, der das gewünschte Konstrukt beherbergt, in einem frischen und sterilen 50 ml LB-Medium, das 50 μg / ml Ampicillin enthält. Züchten Sie die Zellen über Nacht mit Schütteln bei 200 U / min bei 37 °C.
   2. 5 ml der Übernachtzellkultur in einen frischen und sterilen 2x 1000 ml LB mit 2% Glycerin plus Ampicillin (2,8 L Fernbachkolben) geben. Zellkultur mit Schütteln bei 200 U/min bei 37 °C züchten.
   3. Induzieren Sie die rekombinante Proteinexpression, wenn der OD₆₀₀ 0,6-0,8 erreicht, indem IPTG bei einer Endkonzentration von 0,4 mM zu gegeben wird, gefolgt von einer Inkubation bei 30 °C über Nacht mit Schütteln bei 200 U / min.
   4. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 4.000 x g bei 4 °C für 20 min. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellpellets mit Kaltlysepuffer 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7,80, enthaltend 100 mM NaCl, 5 mM Dithiothreitol, 1 mM EDTA und 1 mM PMSF) auf ein Endvolumen von 50 mL Puffer.
      HINWEIS: Zellen können langfristig bei -80 °C gelagert oder sofort zur Proteinreinigung verwendet werden. Um Zellen zu lagern, teilen Sie die Zellsuspension in 2 x 50 mL Einwegzentrifugen-Konienröhrchen auf und halten die Zellpellets bis zum Proteinreinigungsschritt bei -80 °C. Die Expression von mutanten und Wildtyp-Formen von α₂β₂StTS-Komplex in LB-Brühe ergibt 125-150 mg Protein pro Liter. Erwägen Sie, das Protokoll nach oben oder unten zu skalieren, um bestimmte Anforderungen zu erfüllen.
3. Reinigung des Wildtyps oder der mutierten Form des α₂β₂StTS-Komplexes
   HINWEIS: Das folgende Protokoll soll den nicht markierten rekombinanten Wildtyp oder die mutierte Form des rekombinanten α₂β₂StTS-Komplex innerhalb von 1 Tag, abhängig von Fähigkeiten und Anstrengungen. Um die Reinigungszeit zu verkürzen, gleicht die Größenausschlussspalte in der Pufferreinigung/-expression aus. Reinigung von Wildtyp- oder Mutanten α₂β₂StDer TS-Komplex erfolgt durch eine zweistufige Reinigung, umfassend Ammoniumsulfatfraktionierung und Größenausschlusschromatographie. Dieses Protokoll ergibt 60-100 mg reinen Komplex aus 1 L LB-Medium.
   1. Unterbrechen Sie Zellpellets durch Beschallung mit einem digitalen Sonifier mit 1/2 "Hornsonde (oder einem ähnlichen Gerät). Führen Sie 20 Zyklen bei 80% Amplituden-Tastverhältnis im Eiswasserbad mit 10 s Puls und 20 s Ruhe oder bis zur vollständigen Zellstörung durch.
   2. Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 30.000 x g für 30 min bei 25 °C. Saugen Sie den Überstand an, um sicherzustellen, dass sich das Pellet nicht aus dem Röhrchen löst. Filtern Sie die geklärte Überstandsfraktion mit einem 0,45 μm Filter bei Raumtemperatur.
   3. Beurteilen Sie das Anfangsvolumen der geklärten Überstandsfraktion. Fügen Sie langsam kleine Mengen Ammoniumsulfat auf einmal hinzu, bis eine Sättigung von 20% erreicht ist (11,51 g / 100 ml). Führen Sie die Ammoniumsulfatfraktionierung bei 25 °C durch. Rühren Sie die Lösung 10 Minuten lang vorsichtig um und vermeiden Sie Blasen.
   4. Zentrifuge bei 30.000 x g für 10 min bei 25 °C. Die 20% Überstandsfraktion in einen reinen Kolben geben. 20% Pelletfraktion in 20 mL Probenpuffer 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7,80, enthält 100 mM NaCl, 1 mM EDTA und 2 mM Dithiothreitol) vorsichtig resuspendieren und eine Probe vorbereiten, um SDS-PAGE Gel auszuführen. Verwerfen Sie die 20% Pelletfraktion.
   5. Beurteilen Sie das Anfangsvolumen der 20% Überstandsfraktion. Ammoniumsulfat hinzufügen, um eine Sättigung von 30% (5,94 g / 100 ml) zu erreichen, Lösung zu rühren, Blasen zu vermeiden und wie zuvor zu zentrifugieren. Die 30% Überstandsfraktion in einen reinen Kolben geben. 30% Pelletfraktion in 20 ml Probenpuffer 2 vorsichtig wieder aufbereiten und eine Probe für den Betrieb von SDS-PAGE-Gel vorbereiten. Entsorgen Sie die 30% Pelletfraktion.
   6. Beurteilen Sie das Anfangsvolumen der 30% Überstandsfraktion. Ammoniumsulfat bei erreichter Sättigung von 40% (6,14 g / 100 ml) hinzufügen, Lösung umrühren, Blasen vermeiden und wie zuvor zentrifugieren. Die 40%ige Überstandsfraktion in einen reinen Kolben geben. 40% Pelletfraktion in 10 ml Probenpuffer 2 vorsichtig wieder aufbereiten und eine Probe für den Betrieb von SDS-PAGE Gel vorbereiten. Verwerfen Sie den Überstandsanteil von 40 %.
      HINWEIS: Beurteilen Sie die Qualität des αβStTS-Komplexes anhand von Proben der 30% und 40% Überstands- und Pelletfraktionen in einem 12% SDS-PAGE Gel25. Wenn Sie überprüfen, ob ein anderer mutierter αβStTS-Komplex in der 40% igen Überstandsfraktion enthalten ist, fahren Sie mit einer 60% igen Sättigung von Ammoniumsulfat (13,0 g / 100 ml) fort. Vorgereinigte Proteinaliquoten des vorgereinigten α₂β₂ StTS-Komplexes können langfristig bei -80 °C gelagert oder sofort zur Proteinreinigung auf einer Größenausschlusschromatographiesäule (SEC) verwendet werden.
   7. Mikrozentrifugieren Sie die Proteinprobe bei 10.000 x g,20 min, 4 °C und laden Sie die Überstandsfraktion auf eine HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR-Säule, die an eine schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie mit einer Durchflussrate von 0,5 ml^min-1angeschlossen ist, zuvor im SEC-Puffer ausgeglichen (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% Glycerin, 0,1 mM Pyridoxalphosphat).
      HINWEIS: Um große Mengen an komplexen Mengen zu reinigen, laden Sie eine 5-ml-Probe mit 20-25 mg ml^-1 auf eine HiLoad 26/600 Superdex 200 pg-Säule mit einer Durchflussrate von 1,5 ml min^-1.
   8. Beurteilen Sie die proben, die entlang der Ammoniumsulfatfraktionierung und der Spitzenfraktionen aus der SEC-Säule gesammelt wurden, auf einem 12% SDS-PAGE-Gel, das mit Coomassie brilliant blue^{stain 25 gefärbt}ist.
   9. Konzentrieren Sie den Wildtyp oder die Mutante α₂β₂StTS-Komplex mit einer 15 mL 100 kDa Cutoff-Zentrifugalfiltereinheit durch Spinnen bei 3.000 x g bei 4 °C. Das konzentrierte Protein wird in ein frisches 2,0 ml Röhrchen und eine Mikrozentrifuge (10.000 x g, 10 min, 4 °C) gegeben, um Aggregate zu entfernen.
   10. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration^24,bereiten Sie 0,5 ml Aliquoten bei 20-25 mg ml^-1vor, kennzeichnen Sie sie, gefrieren Sie sie in flüssigem Stickstoff und lagern Sie sie bei -80 °C.

3. Optimierte Kristallisation für Wildtyp und mutierte Form des α₂β₂StTS-Komplexes

HINWEIS: Die anfängliche Kristallisationsbedingung für den α₂β₂StTS-Komplex wurde zuvor unter Bedingungen berichtet, die 12% PEG 8.000 und 2 mM Spermin^{22 enthalten.}

1. Bereiten Sie vor den Kristallisationsassays Stammlösungen vor, um eine bessere Kristallisationsreproduzierbarkeit zu erreichen. Um Strukturstudien mit TS durchzuführen, kristallisieren Sie Protein mit Na⁺ oder Cs⁺ Ion an der Metallkoordinationsstelle des Bienzymkomplexes.
   1. Bereiten Sie 5 ml Stammlösung von 200 mM Spermin in Wasser vor und halten Sie 500 μL Aliquoten bei -20 °C.
   2. Bereiten Sie 50 ml Stammlösung von 30% (w/v) PEG 8000 in Wasser vor und halten Sie 25 ml Aliquoten in einem 50 ml Einwegzentrifugen-Konikalkolben bei 25 °C.
   3. Bereiten Sie eine 25 ml Stammlösung von 1 M CsCl in Wasser vor und halten Sie sie bei 25 °C.
   4. 25 ml Stammlösung von 1 M NaCl in Wasser vorbereiten und bei 25 °C aufbewahren.
   5. Bereiten Sie 3x 50 ml Stammlösung von 1 M Bicin vor und titrieren Sie mit CsOH oder NaOH, um gepufferte Lösungen bei pH 7,6, 7,8 und 8,0 zu erhalten. Halten Sie 25 ml Aliquoten bei 4 °C.
2. Tauen Sie eine Probe α₂β₂StTS-Komplexes (20-25 mg ml^-1)in einem Eisbad auf.
3. Mikrozentrifugenprobe bei 10.000 x g für 10 min bei 25 °C zur Entfernung von Proteinaggregaten.
4. Die geklärte Überstandsfraktion wird in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
5. Geschätzte Proteinkonzentration²⁴ und verdünnte Protein aliquots (150-200 μL) bei 15 mg ml^-1 mit 50 mM Bicin-CsOH oder -NaOH, pH 7,8 mit 50 mM CsCl oder NaCl. Proteinprobe bei 25 °C aufbewahren.
6. Bereiten Sie die 500 μL Reservoirlösungen für 3x 24-Well-Sitztropfenplatten in sterilen 1,5 ml markierten Mikrozentrifugenröhrchen vor. Die Reservoirlösung enthält 50 mM Bicin-CsOH oder -NaOH, 50 mM CsCl oder NaCl und PEG 8000. Variieren Sie die Konzentration von PEG 8000 (6-11%) auf den Plattensäulen und die Konzentration von Spermin (2-8 mM) auf den Plattenreihen. Ändern Sie den Puffer-pH-Wert (pH 7,6, 7,8 und 8,0) für jeden Satz.
7. Die Rohre und den Wirbel mindestens 10 Sek. kräftig verschließen. Zentrifugenröhrchen bei 10.000 x g für 10 min bei 25 °C zum Entfernen vonBlasen. Dosieren Sie 500 μL gepufferte Lösung in jedes markierte Reservoir.
8. Verwenden Sie eine P-10-Mikropipette und geben Sie 5 μL Proteinlösung bei 15 mg ml^-1 pro Sitzende gut ab. Vermeiden Sie Blasen. Fügen Sie 5 μL jeder entsprechenden Reservoirlösung zum Proteintropfen hinzu. Vermeiden Sie Blasen beim Mischen und pipetetten Sie nicht auf und ab, um die Mischung zu homogenisieren.
9. Kleben Sie die Platte mit einem transparenten Klebeband und lagern Sie die Platte bei 25 °C. Kristalle erscheinen in 2-5 Tagen und wachsen innerhalb von zwei Wochen zu ihren vollen Dimensionen.

4. Röntgenbeugungsdatenerfassung und α₂β₂StTS Komplexstrukturlösung

HINWEIS: Bereiten Sie vor der Erfassung von Röntgenbeugungsdaten die Kryoprotektorenlösung für jeden Kristall im Voraus vor. Verwenden Sie die spezifische Reservoirlösung, um 3 Aliquoten mit steigenden Konzentrationen von dImethylsulfoxid in Lösung (10, 20 und 30% v / v) und spezifischen Liganden (s) zu erhalten. Es wurde festgestellt, dass Dimethylsulfoxid ein besseres Kryoprotektivum ist als Glycerin, Ethylenglykol und PEG 200-300.

1. Ernten Sie einen großen Einkristall mit einer Kryoloop unter dem stereoskopischen Mikroskop.
2. 2 μL jeder Kryoprotektorenlösung, die die Fällungslösung sowie höhere Konzentrationen vond-Imethylsulfoxid und Liganden enthält, werden auf einen neuen Deckblatt pipetten.
3. Nacheinander cRystal in jedem Tropfen einweichen und den Kristall 30 s in der Kryoprotektorenlösung ausgleichen lassen.
4. Blitzkühlung des kryogeschützten Kristalls mit einem gasförmigen Stickstoffstrom bei -173 °C (100 K) oder Eintauchen in flüssigen Stickstoff zur Langzeitlagerung in Pucks.
   HINWEIS: Füllen Sie einen Schaum-Dewar mit flüssigem Stickstoff, kühlen Sie einen Kristallpuck vor, lagern Sie Kristalle im kryogenen Speicher Dewar und versenden Sie Kristalle mit einem Trockenversender an das Synchrotron.
5. Fahren Sie mit der Erfassung von Röntgenbeugungsdaten bei -173 °Cfort. Zeichnen Sie Röntgenbeugungsdaten mit einer Belichtungszeit von 0,5-4,0 s und 0,5°-Schwingungen auf. Kristall um 180-360° drehen.
6. Verarbeiten Sie die Röntgenbeugungsbilder mit iMosflm^27, um eine Reflexionsdatei in der entsprechenden Raumgruppe zu erzeugen. Im Allgemeinen gehören α₂β₂StTS Kristalle zur Raumgruppe C 121 (C2).
7. Skalieren Sie mehrere Beobachtungen von Reflexionen mit Scala²⁸, implementiert im CCP4-Paket²⁹.
8. Lösen Sie die Struktur des hochauflösenden α₂β₂StTS-Komplexes durch molekularen Ersatz mit MolRep³⁰ und einem geeigneten Suchmodell. Untersuchen Sie das Modell und die Elektronendichtekarte in Coot³¹ nach einer erfolgreichen Strukturlösung.
   HINWEIS: Es gibt viele TS-Kristallstrukturen, die in der Proteindatenbank mit unterschiedlichen Liganden abgelagert sind. Für einen besseren molekularen Ersatzschritt und eine verkürzte Zeit für die Anpassung der neueren Kristallstruktur verwenden Sie das beste Suchmodell, das Liganden von Interesse enthält. Fahren Sie mit der Kristallstrukturverfeinerung in CCP4^29,30 oder Phenix^{31 fort.}
9. Nehmen Sie manuelle Anpassungen am Modell mit Coot³²vor, gefolgt von automatischer Verfeinerung mit Refmac^29,33 oder phenix.refine^31,34. Erstellen und verfeinern Sie das endgültige Modell, indem Sie iterative Runden der Modellerstellung in Coot³² und der automatisierten Verfeinerung ausführen.
10. Fahren Sie mit der Ablagerung von Koordinaten- und Strukturfaktoren auf der Proteindatenbank-Website fort.

Ergebnisse

Reinigung der α-und β-Untereinheiten der Tryptophan-Synthase
Die α-Untereinheit(αStTS) und die β-Untereinheit (βStTS) der Salmonella typhimurium tryptophan synthase wurden im modifizierten pET SUMO-Vektor subkloniert. Abbildung 1A zeigt repräsentative SDS-PAGE-Ergebnisse von zwei starken Bändern, die dem Fusionsprotein His6-SUMO-αStTS (Lane α...

Diskussion

Wir haben erfolgreich mutierte Form α₂β₂ βQ114A, α₂β₂ βK167T und α₂β₂ βS377A StTS-Komplexe für Struktur-Funktions-Korrelationsstudien entwickelt. Zunächst haben wir versucht, die Mutanten mit einem früheren Reinigungsprotokoll²²zu reinigen, das α₂β₂StTS-Komplexkristallisation mit PEG 8000 und Spermin während der Reinigung erfordert. Obwohl die Kristallisationsrate von der mutanten Form und von...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15 mL 10 kDa Filter	MilliporeSigma	UFC901024	Zentrifugalfiltereinheit
15 mL 100 kDa Filter	MilliporeSigma	UFC910024	Zentrifugalfiltereinheit
2 mL Kryofläschchen	Corning	CLS430489	Kryofläschchen
2 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	05-408-141	Mikrozentrifugenröhrchen
24 Well Cryschem Plate	Hampton Research	HR3-158	24-Well-Tropfplatten
2-Mercaptoethanol	Fisher Scientific	O3446I-100	Chemical
50 mL konische Zentrifugenröhrchen	Thermo Scientific	12-565-270	konische Zentrifugenröhrchen
AB15 ACCUMET Basic	Fisher Scientific	13-636-AB15 pH-Messgerät
Agarose	Fisher Scientific	BP1356-100	Agarose-Gel-Ammoniumsulfat
	Fisher Scientific	A702-500	Chemisches
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5	Antibiotikum
Bakterien-Inkubator	Fisher Scientific	S35836	Inkubator.
BamHI	New England Biolabs	R0136S	Restriktionsenzym
	Bicin Fisher Scientific	BP2646100	Chemikalie
Branson 450 Digitaler Sonifikator	Brason	B450	Zelldisruptor
Cäsiumchlorid	Fisher Scientific	BP210-100	Chemikalie
Cäsiumhydroxid	Acros Organics	AC213601000	Chemikalie
Chloramphenicol	Fisher Scientific	BP904-100	Antibiotikum
Dimethylsulfoxid	Fisher Scientific	D1391	Chemisches
Dithiothreitol	Fisher Scientific	BP172-5	Chemische
DNA-Polymerase	Thermo Scientific	F530S	HF-Polymerase
dNTP-Set	Invitrogen	10-297-018	dNTPs-Set
EcoRI	New England Biolabs	R0101S	Restriktionsenzym
Ethylendiamintetraessigsäure	Fisher Scientific	S311-100	Chemical
Excella E25R Orbitalschüttler	Eppendorf New Brunswick	M1353-0004	Orbitalinkubator
GE AKTA Prime Plus	GE Healthcare	8149-30-0004	FPLC
Gel Extraktionskit	Invitrogen	K210012	DNA-Aufreinigungskit
Glycerol	Fisher Scientific	G33-500	Chemisches
HindIII	New England Biolabs	R0104S	Restriktionsenzym
His-Trap-Säulen	GE Healthcare	GE17-5255-01	5 mL Histrap Säule
Imidazol	Fisher Scientific	O3196-500	Chemisches
IPTG	Thermo Fisher Scientific	R0392	Induktor
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5	Antibiotikum
Kelvinator Serie-100	Kelvinator	abgekündigt	Ultratiefkühlschrank
LB Brühe	Fisher Scientific	BP1426-500	Flüssigbrühe
Luria Bertani	Agar Fisher Scientific	BP1425-2	Feste Brühe
NaCl	Fisher Scientific	S271-500	Chemisches
NcoI	New England Biolabs	R0193S	Restriktionsenzym
Ni-NTA-Affinitätskügelchen	Thermo Fisher Scientific	R90115	Ni-NTA Agarosekügelchen
PEG 8000	Fisher Scientific	BP233-100	Chemisches
Phenylmethylsulfonylfluorid	Fisher Scientific	44-865-0
Pyridoxalphosphat	Acros Organics	AC228170010	Chemical
S-200 HR	Cytiva	45-000-196	Größenausschlusssäule
SacI	New England Biolabs	R0156S	Restriktionsenzym
Natriumhydroxid	Fisher Scientific	S318-100	Chemisch
Sorvall RC-5B Zentrifuge	Sorvall	8327-30-1004	Bodenzytrifuge
Spermine	Acros Organics	AC132750010	Chemical
Superdex 200 Prep Grade	Cytiva	45-002-491	Größenausschlusssäule
T4 DNA-Ligase	New England Biolabs	M0202S	DNA-Liagse
Tris	Fisher Scientific	BP152-500	Chemisch
Ubl-spezifische Protease 1	Thermo Scientific	12588018	SUMO Protease