PCR-Mutagenese, Klonierung, Expression, schnelle Proteinreinigungsprotokolle und Kristallisation des Wildtyps und der mutierten Formen der Tryptophan-Synthase

Eduardo Hilario; Li Fan; Leonard  J. Mueller; Michael  F. Dunn

doi:10.3791/61839

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Methodenartikel

PCR-Mutagenese, Klonierung, Expression, schnelle Proteinreinigungsprotokolle und Kristallisation des Wildtyps und der mutierten Formen der Tryptophan-Synthase

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DOI:

10.3791/61839

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26. September 2020

Eduardo Hilario¹ , Li Fan² , Leonard J. Mueller¹ , Michael F. Dunn²

¹Department of Chemistry, University of California-Riverside, ²Department of Biochemistry, University of California-Riverside

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt eine Reihe von aufeinanderfolgenden Methoden zur Expression und Reinigung von Salmonella typhimurium tryptophan synthase vor, die dieses Protokoll zu einem schnellen System zur Reinigung des Proteinkomplexes an einem Tag machen. Abgedeckte Methoden sind ortsgerichtete Mutagenese, Proteinexpression in Escherichia coli,Affinitätschromatographie, Gelfiltrationschromatographie und Kristallisation.

Zusammenfassung

Strukturstudien mit Tryptophansynthase (TS) Bienzymkomplex (α₂β₂ TS) aus Salmonella typhimurium wurden durchgeführt, um seinen katalytischen Mechanismus, sein allosterisches Verhalten und Details der enzymatischen Umwandlung von Substrat in Ein produkt in PLP-abhängigen Enzymen besser zu verstehen. In dieser Arbeit ermöglichte ein neuartiges Expressionssystem zur Herstellung der isolierten α- und isolierten β-Untereinheit die Reinigung hoher Mengen reiner Untereinheiten und α₂β₂StTS-Komplexes aus den isolierten Untereinheiten innerhalb von 2 Tagen. Die Reinigung erfolgte durch Affinitätschromatographie, gefolgt von Spaltung des Affinitäts-Tags, Ammoniumsulfat-Fällung und Größenausschlusschromatographie (SEC). Um die Rolle von Schlüsselrückständen am Enzym β besser zu verstehen, wurde in früheren Strukturstudien eine ortsseitige Mutagenese durchgeführt. Ein weiteres Protokoll wurde erstellt, um den Wildtyp und die Mutanten α₂β₂StTS-Komplexen zu reinigen. Ein einfaches, schnelles und effizientes Protokoll mit Ammoniumsulfatfraktionierung und SEC ermöglichte die Reinigung von α₂β 2StTS-Komplexes an_einemeinzigen Tag. Beide in dieser Arbeit beschriebenen Reinigungsprotokolle haben erhebliche Vorteile im Vergleich zu früheren Protokollen zur Reinigung desselben Komplexes mit PEG 8000 und Spermin, um den α₂β₂StTS-Komplex entlang des Reinigungsprotokolls zu kristallisieren. Die Kristallisation von Wildtyp- und einigen Mutiertenformen erfolgt unter leicht unterschiedlichen Bedingungen, was die Reinigung einiger Mutanten mit PEG 8000 und Spermin beeinträchtigt. Um Kristalle vorzubereiten, die für röntgenkristallographische Untersuchungen geeignet sind, wurden mehrere Anstrengungen unternommen, um Kristallisation, Kristallqualität und Kryoprotektion zuoptimieren. Die hier vorgestellten Methoden sollten allgemein zur Reinigung von Tryptophansynthase-Untereinheiten und Wildtyp- und Mutanten-α₂β₂StTS-Komplexen anwendbar sein.

Einleitung

Der Tryptophansynthase (TS) Bienzymkomplex (α₂β₂₎ist ein allosterisches Enzym, das die letzten beiden Schritte in der Biosynthese der Aminosäure L-Tryptophan in Bakterien, Pflanzen und Pilzen katalysiert¹^,²^,³. Das Bakterium Salmonella enterica serovar typhimurium (St) verursacht eine schwere Magen-Darm-Infektion bei Menschen und anderen Tieren. Da Menschen und höhere Tiere kein TS (EC 4.2.1.20) haben, wurde die Hemmung von S. typhimurium α₂β₂ TS-Komplex (α₂β₂StTS) al....