Summary
우리는 스캐닝 전자 현미경의 자동화 된 이미징 절차와 함께 배열 단층 촬영 샘플로 사용하기 위해 대형 전송 지원에 직렬 섹션의 리본과 컬렉션의 준비를 설명합니다. 이 프로토콜을 통해 로컬, 희귀 한 이벤트의 스크리닝, 검색 및 표적 이미징및 대량 데이터 볼륨을 수집 할 수 있습니다.
Abstract
전자 현미경 검사는 나노미터 해상도에서 세포 및 구조 적 세부 사항의 이미징을 위한 생물학 및 의학에서 적용됩니다. 역사적으로, 전염 전자 현미경 검사법 (TEM)은 세포 초음파 구조에 대한 통찰력을 제공했지만, 최근 10 년 동안 현대 스캐닝 전자 현미경 (SEM)의 개발은 세포 내부를 찾는 방식을 변화시켰습니다. 단백질 수준의 구조적 세부 사항이 필요할 때 TEM의 해상도가 우수하더라도, SEM 해상도는 세포 수준 세포 생물학 관련 질문의 대다수에 충분합니다. 기술의 발전으로 직렬 블록 페이스 이미징(SBF-SEM) 및 포커스이있는 이온 빔 SEM(FIB-SEM)과 같은 자동 볼륨 획득 솔루션이 활성화되었습니다. 그럼에도 불구하고, 현재까지 이러한 방법은 관심 지역에 대한 식별 및 탐색이 중요할 때 비효율적이지 않습니다. 이미징 전에 대상 영역을 정확하게 현지화할 수 있는 수단이 없으면 운영자는 필요한 것보다 훨씬 더 많은 데이터를 확보해야 합니다(SBF-SEM) 또는 더 나쁜 경우 많은 그리드를 준비하고 모든 것을 이미지화해야 합니다(TEM). 관심 영역의 국소화를 용이하게 하는 SEM의 Array 단층 촬영을 사용하여 "측면 스크리닝"의 전략을 제안하고, 그 다음으로 전체 샘플 볼륨의 관련 부분의 자동화된 이미징을 제안합니다. 배열 단층 촬영 샘플은 이미징 중에 보존되며 반복 이미징을 위한 섹션 라이브러리로 배열할 수 있습니다. 측면 스크리닝을 통해 다른 방법으로 액세스하기가 매우 어려운 구조적 세부 사항을 분석할 수 있는 몇 가지 예가 표시됩니다.
Introduction
EM 관련 기술의 중요성에도 불구하고 이를 마스터하는 데 필요한 노력은 소수의 전문가로 제한된 전체 분야를 유지합니다. 한 가지 중요한 어려움은 EM에 대해 보존된 샘플에서 관심 영역(ROI)을 식별하고 검색하는 것입니다. 동일한 샘플의 외관은 광학 현미경 검사법에 의해 분석될 때 와 EM 관찰을 위한 처리 후에 상당히 다릅니다. 화학적으로 제조된 시료에 대한 변화는 탈수 단계(각 차원에서~10%)와 고정 및 염색 프로토콜에서 osmium을 사용할 때 형광손실(도1A)을포함한다. 초박형 단면의 경우, 샘플은 상이한전략(도 1B)을사용하여 에폭시 또는 아크릴 수지에 내장되어 있습니다. 이 준비의 성공적인 결과를 얻으려면 전체 샘플을 1mm x 1mm를 초과하지 않는 조각으로 분별해야 합니다. 표준 전송 전자 현미경 검사법 (TEM) 관측 조건의 요구 사항을 충족하기 위해, 샘플의이 작은 부분은 추가 50-150 nm 두께의 조각으로 단면된다. 결과 그레이스케일 이미지는 다른 현미경기술(도 1C)보다더 자세하게 전체 샘플의 분분의 조직 조직 및 세포기관 구조를 보여줍니다. 일반적인 TEM 데이터 집합은 이론적으로 세포 및 조직의 3D 공간에서 발생하는 프로세스를 이해하기 위해 추정된 2D 정보를 제공합니다. 도 1D는 초구조적 볼륨 획득의 과제를 제시합니다: 측면 1,000 μm의 큐브가 50nm 두께로 단면되는 경우, 전체 부피를 커버하기 위해 20,000개의 섹션이 필요합니다. 500 μm 측면 큐브의 경우 10,000개의 섹션이 됩니다. 50 μm x 50 μm x 50 μm 부피를 커버하려면 1,000개의 섹션이 "만" 필요할 수 있습니다. 이 볼륨을 수동으로 얻는 것은 실질적으로 불가능하고 자동화로 수행하기가 매우 어렵습니다. 시료 깊이 이외에, 우리는 이러한 가상 큐브의 전체 표면을 커버해야하는 경우, 합리적인 해상도에 1 μm2 표면의 범위는 심각한 물류 문제가된다(도 1E). 커넥토믹스 접근법과 같은 비범한 대규모 프로젝트의 경우 많은 섹션이 중요하지만, 대부분의 "평범한" EM 프로젝트에서 관찰에 필요한 더 많은 섹션을 생성하는 것은 상당한 단점을 제시합니다.
3D 초구조 적 정보를 획득하는 몇 가지 방법이 있습니다 : 직렬 변속기 전자 현미경 검사법 (TEM), TEM 단층 촬영, 배열 단층 촬영 (AT), 직렬 블록 얼굴 이미징 스캐닝 전자 현미경 검사 (SBF-SEM), 집중 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 검사 (FIB-SEM). 이러한 메서드 간의 주요 차이점은 단면 화 전략과 이미지 수집이 섹션생성 1과결합되는지 여부입니다. 직렬 단면 TEM에서 순차적인 섹션은 슬롯 그리드에서 수집되며, TEM 이미지는 이러한 시퀀스에서 생성되고정렬된 2,3,4,5. TEM 단층 촬영에서, 그리드의 150-300 nm 섹션에서 틸트 계열, 그리고 직렬 단면에 결합 할 때, 상대적으로 작은 볼륨6,7,8하지만,매우 높은해상도를제공합니다 . AT 접근 방식은 유리 커버슬립, 실리콘 웨이퍼 또는 특수 테이프와 같이 상대적으로 큰 지지에 다양한 수동 및 반자동 섹션 컬렉션의 물리적 단면을 사용합니다. 이미지 수집의 경우, 다양한 이미지 수집 전략이9,10,11,12,13,14,15로 SEM에서 분석된다. SBF-SEM의 경우, 물리적 단면은 SEM 챔버 내부에 직접 설정된 다이아몬드 나이프가 있는 미니 마이크로토메를 사용하여달성되며, 수지블록(16,17,18,19)의표면에서 생성된 SEM 영상을 갖는다. FIB-SEM의 경우, 이온 소스는 샘플의 얇은 층을 제거하고, 그 다음에 는 SEM20, 21에의해 노출된 표면의 자동 이미징이뒤따릅니다. TEM 단층 촬영 및 AT는 필요한 경우 다시 이미지화 할 수있는 물리적 섹션을 생성하며 FSBF-SEM 및 FIB-SEM은 이미징 후 섹션을 제거합니다. 멀티 빔 SEM에 의해 이미지된 물리적 섹션의 최근 조합은 이미지 수집속도(22)의"병목 현상" 문제를 해결하는 방법의 조합을 제공한다. 이러한 각 기술은 EM 데이터를 획득하고 분석하는 방식에 혁명을 일으켰으며 각 접근 방식은 주어진 연구 질문과 관련된 실질적인 영향을 미칩니다.
초구조적 차원의 준비 의 특성과 스케일을 감안할 때, 시료블록(Figure1D,E)에특정 대상 구조가 어디에 있는지 예측하는 것은 간단하지 않다. ROI 지역화의 한 가지 솔루션은 처음부터 원하는 해상도로 전체 블록의 이미지를 기록하는 것입니다. 관심구조는 현미경으로부터 멀어질 때 획득된 데이터 볼륨에 있을 수 있다. 이 전략과 관련된 수집 시간 및 데이터 처리는 문제가 됩니다. 기록된 데이터의 양을 감소시키는 것이 바람직하며, 특히 ROI가 조직 블록보다 훨씬 작은 경우, 즉 관심있는 개체가 특정 유형의 세포(전체 장기가 아님)인 경우. 상이한 상이한 상이한 상반되는 광및 전자 현미경기술(CLEM)은 동일한 샘플23,24,25,26,27,28,29내에서 제조 전후에 형광이 보존되고 국한될 때 성공할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 많은 세포 구조는 알려진 초구조에 기초한 형광 상관관계 없이도 인식할 수 있다. 이러한 경우 측면 스크리닝 어레이 단층 촬영은 ROI 현지화에 투자된 노력과 초구조적 정보 품질 사이의 균형 절충을 제공한다고 생각합니다. 이 전략을 사용하여 웨이퍼의 하위 섹션 집합은 ROI의 크기와 특성에 따라 설정할 수 있는 일정한 간격으로 검사됩니다. ROI가 발견되면, 데이터 수집은 앵커 섹션 전후부터 종료되는 일련의 섹션으로 설정되어 관련 정보를 대상으로 수집합니다.
우리는 다양한 섹션에서 지역 또는 관심의 이벤트의 인수를 단순화하고 가속화하고 더 잘 정렬 된 이미지 볼륨을 산출 AT에 대한 프로토콜을 제시한다. 측면 스크리닝 및 다단계 획득은 정밀타겟팅 된 지역에서 매우 높은 해상도의 데이터를 생성합니다. 우리가 설명하는 절차는 3D EM 데이터 수집의 몇 가지 과제를 해결합니다: 샘플 준비 워크플로우를 근본적으로 변경하지 않고 광범위한 표본과의 호환성; 단면 및 SEM 인수를 위한 대상 현지화; 설정 시 시간과 노력이 줄어듭니다. 결과 볼륨의 더 나은 정렬과 여러 섹션에서 영역의 이미징; 그리고 스티치 모자이크 그림으로 다른 이미지를 컴파일하는 부드러운 스티치 및 정렬 절차. 우리는 출판 및 진행 중인 프로젝트에서 여러 샘플로 방법의 강도를 입증하기로 결정했습니다. 우리는 이 접근 방식이 EM 경험이 제한된 조사관에게도 표적 EM 데이터의 생성 및 수집을 크게 촉진할 수 있다고 믿습니다.
Protocol
참고: 샘플 준비 방법은14,30,31의다른 곳에서 설명되며 이 출판물에서는 다루지 않습니다. 요컨대, 표시된 예는 글루타랄데히드로 화학적으로 고정되었고, 1% OsO4로고정된 다음, 포함된 수지에 포함되기 전에 1% 수성 우라일 아세테이트로 처리하였다. 또는, 시료는 고압 동결, 아세톤에 0.1% 우라일 아세테이트로 대체된 동결, 아크릴 수지에 내장된 동결을 사용하여 제조될 수 있다. 샘플 블록은 시료의 명확한 뷰를 허용하는 플랫 임베딩 방법을 사용하여 제조되었으며, 단면에 대한 방향을 용이하게하였다(도 1B).
1. 어레이 생성 절차
- 임베디드 샘플 방향 및 트리밍
- 쌍안경/현미경을 사용하여 면도날로 블록 표면을 가볍게 긁음으로써 임베디드 블록 표면에 ROI를 식별하고 표시합니다. 이것은 초미세토메 내부의 샘플을 방향을 지정하는 데 도움이되며 단면 표면을 줄일 수 있습니다.
- 초미세토메홀더(그림 2A)에샘플을 고정합니다.
- 시료 주위의 수지(수지 트리밍)를 먼저 면도날(거친 트리밍)으로 자르고 다이아몬드 트리밍 도구(미세 트리밍)를 계속합니다. 그림 2A). 블록의 상단 및 하단 표면이 칼의 절삭날과 평행하도록 20° 또는 90° 가장자리 경사가 있는 칼을 사용합니다.
참고: 이 단계는 직렬 리본의 직렬 단면 화 및 획득에 매우 중요합니다. - 자일렌과 접착제를 3:1 비율로 섞습니다. 이쑤시개에 속눈썹이 부착되어 이 혼합물을 트리밍 된 블록의 상단과 아래쪽 가장자리에 바하십시오. 건조하게 하십시오.
- 배열 장착 지지대 A(예: 실리콘 웨이퍼)를 준비합니다.
- 웨이퍼 클리빙 도구(EMS)를 사용하여 웨이퍼 조각을 잘라 프로젝트 목표에 맞게 크기를 조정합니다. 2cm x 4cm는 빛과 전자 현미경 관찰 모두에 편리합니다.
- 잔해를 제거하기 위해 증류수로 웨이퍼를 청소하십시오.
- 표준 장비를 사용하여 표면을 청소하는 글로우 방전/플라즈마. 정확한 매개 변수는 사용된 컴퓨터에 따라 달라집니다. 그리드 방전의 매개 변수로 시작하여 시간을 경험적으로 조정합니다. 이 단계는 섹션이 건조하고 생략되어서는 안되는 동안 지지층의 섹션을 잘 확산시키는 데 중요합니다.
- 배열 장착 지지대 B(예: 유리 커버슬립)를 준비합니다.
- 멀티플렉스 면역 라벨링 실험을 계획하는 경우 커버슬립에 샘플을 전송하여 형광 신호를 더 잘 감지합니다. 커버슬립 접착제를 개선하기 위해, 상세한 젤라틴 코팅 절차를 사용하여 이전에 설명된9.
- 증발에 의한 인듐 주석 산화물(ITO) 또는 금으로 슬라이드를 코팅하여 전도도를 증가시다. 준비된 커버립을 깨끗한 환경에서 유지합니다. 글로우는 1.2.3에 설명된 바와 같이 샘플을 배출한다.
2. 샘플의 절제
- 칼 준비시
참고: 배열을 생성하려면 긴 리본을 쉽게 수집할 수 있도록 설계된 수정된 칼(ATS)을 사용합니다. 히스토 점보 나이프 또는 대형 지지대의 섹션 생성을 위해 고안된 이와 유사한 칼은 AT 단면에도 사용할 수 있습니다.- 거품이 끈적 끈적한 테이프를 사용하여 칼의 바닥에 바늘을 부착하고 관통(도 2B). ATS 나이프를 초미세토메 홀더에 0°로 놓습니다. 표준 절차를 사용하여 칼의 가장자리를 블록 표면에 평행하게 조정합니다.
- 트리밍된 블록을 칼 가장자리에 놓고 단면에 대비한 위치에 놓습니다.
- 웨이퍼/커버슬립을 칼 분지 내부에 놓고 칼로 가장자리를 같은 수준으로 채웁니다. 칼의 다이아몬드 가장자리가 제대로 가습하고 필요한 경우 부착 된 주사기(도 2C)를사용하여 물을 철회하십시오.
- 배열 단면 및 전송
- 원하는 절단 매개 변수에 마이크로토메를 설정합니다. ATS 나이프의 경우 50-100 nm의 범위와 0.6-1 mm/s의 절삭 속도를 내는 것이 좋습니다. 시작 단면(그림 2Di).
- 대상 z 볼륨을 커버하고 컬렉션을 중지하는 길이의 리본을 가져옵니다. 블록 크기, 조직의 균질성 및 수지 의 종류에 따라 리본은 비교적 직선(도 2D-ii)이될 것입니다. 많은 샘플은 투자 된 노력과 칼의 종류가 사용에도 불구하고 직선 리본을 생성하지 않습니다.
- 최종 목표에 따라 길게 또는 여러 개의 짧은 리본을 나란히 정렬합니다. 2cm x 4cm 지지대는 100~1,000개의 섹션을 편리하게 보관할 수 있습니다. 지원 단계에 리본의 배열은 손재주가 필요하고 꾸준한 손을 필요로하는 단계입니다. 그러나 이 기술에 대한 학습 곡선은 빠르게 획득됩니다.
- 이쑤시개에 붙어 있는 속눈썹의 깨끗하고 끈적끈적한 끝을 사용하여 칼 날로부터 리본을 분리합니다(그림2Diii).
- 속눈썹을 사용하여 리본을 지지 매체의 중앙 위로 부드럽게 이동합니다. 이 시점에서 필요한 경우 섹션의 스트레칭을 위해 클로로폼 또는 가열 펜을 사용합니다. 그러나,이 조작은 리본 파괴 및 변형을 유도 할 수 있음을 기억하십시오.
- 주사기를 당겨 물을 배수하기 시작합니다. 더 섬세한 리본이나 느린 물 회수를 위해 호스에서 주사기를 분리하여 물을 떨어 뜨립니다. 수위가 웨이퍼 레벨로 낮아지면 리본을 제어하고 필요한 경우 리본을 중앙으로 부드럽게 밀어 내십시오. 웨이퍼 표면에 리본을 정착한 후, 나머지 물이 분지에서 완전히 후퇴될 때까지 계속 배수합니다.
참고: 바닥 물 회수 ATS 나이프를 사용하지 않는 경우 ATS 나이프의 측면에서 물을 조심스럽게 줄여 난기류를 유발하지 않습니다. - 욕조 내부에 지지부분에 섹션을 두어 완전히 건조시다. 지지층의 소수성 및 환경 습도 수준에 따라, 물은 다른 속도로 증발한다(도2Div). 시료가 천천히 건조하여 점감하거나 완전히 샘플의 모든 주름을 피하는 것이 중요합니다.
- 건조 시료를 단단히 닫힌 상자에 옮겨 먼지 오염으로부터 보호하고 최소 30분 동안 60°C 오븐에 놓습니다. 필요한 경우, 전체 대비를 향상시키기 위해 중금속을 사용하여 카운터 스테인 섹션.
- 절차가 끝나면 제조업체의 지시에 따라 조심스럽게 칼을 청소하십시오.
참고: 슬롯 그리드(그림2F)에서의전송과 비교하여 웨이퍼(그림2E)에여러 또는 직렬 섹션의 전송이 EM 준비 환경을 완전히 변화시다. 단일 지원에 대한 섹션의 중단 없는 단면 및 컬렉션은 직렬 단면에서 자주 찾는 섹션 및 섹션 컬렉션 관련 실수의 양을 줄입니다. 하나의 웨이퍼에 수집된 1000 μm x 500 μm의 100개 섹션에 해당되는 것은 33개의 슬롯그리드(그림 2G)에해당한다.
3. 샘플 관찰
참고: 이 섹션에서는 상용 소프트웨어를 사용하여 구현된 워크플로 단계를 설명합니다(재료 표참조). 올바른 검출기가 장착된 모든 SEM의 모든 이미지 수집 소프트웨어를 사용할 수 있지만 특정 사용자 작업은 다르며 종종 더 많은 수동 작업이 될 수 있습니다.
- 웨이퍼의 섹션 위치를 보여주는 SEM 이미지의 개요 맵을 획득합니다. 내장된 광학 카메라 이미지는 섹션 또는 모든 섹션의 리본을 덮는 SEM 이미지 모자이크를 정의하는 데 도움이 됩니다. 샘플의 카메라 이미지 오른쪽에 마우스로 클릭 드래그하여 모자이크를 만들고 자동 수집을시작합니다.
참고: 매우 거친 이미징 설정, 즉 1-2 μm 픽셀 크기와 1 μs가 충분합니다. 이 과정은 보충 자료(2-7쪽)에 설명되어 있습니다. - 섹션 파인더 자동 탐지 기능이 있는 섹션을 찾거나 수동으로 찾을 수 있습니다. 섹션 위치 및 윤곽선은 이미지 일치를 기반으로 이 소프트웨어로 자동으로 검색됩니다. 이 프로세스의 그림은 보충 자료(8쪽 - 15쪽)를 참조하십시오.
- 개요 이미지가 ROI를 명확하게 표시하지 않는 경우 섹션의 고해상도 이미지를 얻습니다. 섹션 미리 보기 함수를 사용하여 이미지를 자동으로 만들고 획득합니다. 이 과정은 보충 자료,16-18 페이지에 설명되어 있습니다. 이미징 설정은 사용자가 검색하는 ROI의 특성 과 크기에 따라 선택해야 합니다.
- 최적의 설정을 찾으려면 현미경 제어 소프트웨어에서 라이브 이미징을 활성화하고 하나의 ROI로 이동합니다. 이미지가 ROI를 명확하게 표시할 때까지 이미징 설정을 변경하지만 이미지 수집이 지나치게 길지 않습니다.
- 이미징 영역 정의
참고: 몇 가지 다른 전략이 제안됩니다.- 몇 섹션만 이미지화해야 하는 경우 지금까지 생성된 섹션의 이미지를 사용하여 관련 섹션으로 탐색하고 원래 상대 위치에 있는 모든 획득된 이미지를 보여 주는 Zoomable Viewer를 사용하여 모든 섹션을 살펴봅니다. 고해상도로 이미지화해야 하는 섹션이 발견되면 클릭 드래그가 있는 이미징 영역을 만듭니다. 고해상도 이미징 설정을 선택하고 템플릿에 설정을 저장합니다. 이 템플릿을 다시 사용하여 추가 섹션에 사용할 수 있습니다.
- 희귀 한 이벤트를 감지하기 위해 특히 작거나 어렵다는 것을 찾으려면 측면 검사 방법을 사용합니다. 10분의 1섹션마다 고해상도 이미징 설정이 있는 이미징 영역을 리본당 한 섹션에 수동으로 만들고 이미지를 수집합니다. 소프트웨어에 ROI가 포함된 이미지 및 표시 섹션을 검토하거나 메모를 작성합니다.
- ROI를 포함하는 섹션에서 시작하여 섹션 집합을 앞뒤로 탐색하고 구조가 섹션에 여전히 표시되는 한 동일한 상대 위치에 고해상도 이미징 영역을 만듭니다. 수동으로 또는 다음 단계에서 설명된 프로시저를 사용하여 수행할 수 있습니다.
- 10개 이상의 연속 섹션에서 이미지를 수집합니다. 이미지를 확대한 후 위치 구체화를 시작하여 설명서에 설명된 대로 등록된 섹션 위치의 정밀도를 높입니다. 이렇게 하면 이미지 시리즈의 위치 가변성이 줄어듭니다. 절차는 설명 및 보충 자료 페이지 19-21에 설명된다.
- 모든 섹션을 클릭하여 Alt 키를 누르고 이미징 영역을 정의하고 마우스 버튼이 해제될 때 열리는 컨텍스트 메뉴에서 타일 세트 배열 만들기를 선택합니다. 그런 다음 소프트웨어는 이전에 발견되거나 표시된 모든 섹션에서 동일한 상대 위치에 이미징 영역을 만듭니다. 이미징을 섹션 스팬 슬라이더를 사용하여 특정 섹션 범위로 제한할 수 있습니다.
참고: 이 절차는 이미징 영역의 수와 함께 반복될 수 있으므로 각 섹션에 하나의 더 큰 이미지를 기록하는 대신 많은 작은 고해상도 이미지를 기록할 수 있습니다. - 일단 만들어지면 필요에 따라 각 이미지 시리즈에서 픽셀 수, 픽셀 크기, 타일링 레이아웃, 픽셀 거주 시간 등을 설정합니다. 이미징 시리즈가 만들어지고 설정되면 모두 작업 큐에 나열됩니다.
- 자동 기능 구성 및 이미지 수집 시작
- 이전 단계에서 설명하는 것과 동일한 메서드를 사용하여 자동 기능에 대한 별도의 이미지 시리즈를 만듭니다. 이미지 계열을 고대비 구조가 포함된 섹션의 위치로 이동합니다.
- 이미지 시리즈를 1024 x 884 픽셀로 설정하고 이전 단계에서 설정된 이미지 계열에서 사용되는 가장 높은 해상도에 해당하는 픽셀 크기를 선택합니다. 자동 기능 목록에서 자동 초점 및 자동 낙인을확인합니다.
- 획득 시퀀스 컨트롤의 섹션별로 선택하고 자동 함수 이미지가 목록의 첫 번째 항목인지 확인합니다. 작업 큐 옆에 있는 실행 단추를 클릭하여 이미지 수집을 시작합니다. 이러한 절차는 보충 자료,22-23 페이지에 설명되어 있습니다.
참고: 각 섹션에 수동으로 사전 집중할 필요는 없습니다. 기록 세션 동안 현미경이 새 섹션으로 진행될 때마다 이 섹션에 다른 모든 이미지가 기록되기 전에 자동 기능이 실행됩니다.
4. 데이터 정렬 및 분석
- 데이터 내보내기
- 데이터가 .tif 형식으로 저장되어 있는지 확인하므로 전용 내보내기 기능이 필요하지 않습니다. 레이어 트리의 레이어 및 요소에 직접 해당하는 폴더 구조로 데이터를 정렬합니다.
- 이미지 모자이크가 기록되면 StitchAll 함수를 사용하여 모든 타일을 자동으로 스티치합니다.
- 피지에서 스택 정렬 및 자르기
메모. 많은 소프트웨어 패키지(무료 및 상용)를 사용하여 배열 단층 촬영 데이터로 작업할 수 있습니다. 아래 단계는 널리 사용할 수 있기 때문에 오픈 소스 프로그램 피지와 함께 표시됩니다32 필요한 모든 기능을 포함.- 가상 스택으로 피지에 이미지 (또는 스티치 이미지)의 스택을 가져옵니다.
- 대비/밝기를 정규화해야 하는 경우 향상된 콘트라스트를선택하십시오... 프로세스 메뉴에서. 포화 픽셀을 0.1 이하로 설정하고 모든 슬라이스 프로세스를 확인합니다.
- 플러그인 메뉴에서 등록 | 선택 SIFT와 선형 스택 정렬.
- 예상 변환 드롭다운 메뉴에서 강성 또는 Affine을 선택합니다. 그렇지 않으면 기본 설정을 유지합니다. 확인을클릭하여 정렬을 시작합니다.
참고: 데이터를 가상 스택으로 로드하면 피지가 모든 크기의 스택을 처리할 수 있습니다. 선형의 출력은 RAM에서 만들어집니다. 그러나 처리할 수 있는 스택의 최대 크기를 제한할 수 있습니다. 이 경우 동일한 등록 알고리즘의 폴더 간 구현인 가상 스택 조각 등록을사용합니다. 등록이 완료되면 출력 데이터를 가상 스택으로 로드합니다. - ROI만 포함되도록 자르기(Crop)를 클릭하여 이미지 스택을 자르게 합니다.
- 스택을 단일 .tif 이미지 또는 일련의 .tif 이미지로 저장합니다.
참고: 배열 단층 촬영의 중요한 단계는 그림 3에표시됩니다.
Representative Results
아래 예제는 권장 워크플로의 다재다능함을 입증하는 것을 목표로 합니다. 사례 연구 일러스트레이션은 다른 기술로 만족스러운 결과를 얻는 데 어려움을 겪었던 프로젝트입니다. 우리는 Drosophila 성인을 선택하여 수많은 유형 의 샘플과 발생할 수있는 일반적인 도전을 설명했습니다. 이 관 기관은 약 6mm 길이, 단면에서 500-1000 μm, 독특한 기능 및 세포조성(도 4A)33을가진 다른 영역으로 나뉩니다. 단면 방향에 따라 직감 프로파일의 크기와 섹션의 모양은 다양합니다. 횡방향 또는 세로 지향 섹션은 상대적으로 크고, 단 몇 개만 단일 TEM 그리드(그림2F)에배치할 수 있다. 조직의 작은 부분만이 FIB에서 심화될 수 있으며, SBF-SEM의 경우, 난이도는 비균질성 샘플과 유사하다. AT는 이러한 샘플의 분석을 위한 효율적인 절충을 제공하고 평평한 포함은 ROI 국소화를 용이하게 합니다. 선택한영역(도 4B)주위의 수지 의 과잉을 신중하게 트리밍하는 것은 관련영역(도 4C)으로부터배열의 효율적인 수집에 중요하다. 수백 개의 단면은 단일 웨이퍼에서 순차적으로 또는 무작위로 수집할 수있습니다(그림 4D). 연구 질문에 따라 샘플 검사 및 획득에는 여러 시나리오로 임의로 분할된 다른 전략이 필요합니다. 보다 타겟팅된 다양한 시나리오를 설명하기 위해 다양한 연구 프로젝트에서 여러 사례 연구를 선택했습니다.
수많은 무작위로 분포된 대형 구조물 1-10 μm 범위의분석(도 4E)
종종 초구조 데이터는 표준 및 실험적으로 변경된 조건을 비교하여 여러 실험 적 접근법에서 발생한 가설을 검증해야 합니다. 이러한 경우 여러 섹션은 일반적으로 그리드에서 무작위로 수집되고 관심 영역을 지역화하고 이미지화하도록 스크리밍됩니다. 이 전술은 일반적으로 덜 체계적이고 분석 된 섹션의 소수로 제한됩니다. 지정된리본(그림 4D)에서수십/ 수백 개의 중간 해상도 섹션의 개요를 기록하는 것이 좋습니다. 70nm의 전형적인 섹션의 경우, 200개의 섹션은 약 14μm에 걸쳐 있으며, 이는 완전히 또는 부분적으로, 반 시간 이내에 완성된 수많은 세포를 포함할 것이다. 첫 번째 단계로 전체 리본의 저해상도 개요가 기록되고 개요는 준비 유물(예: 접기, 먼지)을 표시하는 섹션을 생략하는 데 도움이 됩니다. 그 후, 단일 또는 모자이크 이미징을 사용하여 섹션의 선택된 부분 또는 전체 섹션에서 수동으로 또는 자동으로 수행한 다음 스티치(그림4E)를수행할 수 있다. 그런 다음 선택한 영역의 이미지를 고해상도 매개 변수를 사용하여 획득할 수 있습니다. 예를 들어, 미토콘드리아, 핵 및 마이크로빌리는 통계적으로 개선된방법(도 4Ei-iii)으로부터유익할 수 있다.
여러 개의 작고 드물게 분산된 구조물 500-1,000 nm 범위의 분석(추가 영화 1)
이 시나리오에서는 저배율 개요 검사에서 ROI를 간단하게 식별할 수 없으며 고해상도 이미지가 필요합니다. 기존의 TEM 샘플에서는 필요한 피쳐가 발견될 때까지 섹션의 지루한 확대/축소가 필요합니다. 종종 여러 샘플에서 여러 독립적인 위치를 이미징하는 것은 단일 대량의 생성보다 통계적으로 더 관련성이 높습니다. 이러한 경우 수동 수집의 복잡성은 기하급수적으로 증가합니다. 여러 TEM 솔루션으로 자동 인수 또는 여러 그리드의 스크리닝을 가능하게 하지만 그리드 및 직렬 단면 문제의 크기는 많은 샘플에 대해 호환되지 않는 경우가 많습니다. 유사한 경우 관심 구조를 식별할 수 있는 해상도로 여러 섹션에서 전체 ROI의 전체 중간 해상도 맵을 생성합니다. 이 측면 검사 단계 동안, 무작위로 접근 할 때 관심구조의 적어도 일부를 공격하는 것을 목표로 한 번에 여러 섹션을 도약하는 것이 좋습니다. 이는 구조의 전체 치수에 크게 좌우됩니다: 예를 들어, 구조의 전체 크기가 500nm이고 단면이 50nm 두께인 경우, 적어도 9개의 순차적인 섹션이 연달아 관심 구조의 일부를 포함할 가능성이 높다. 이렇게 하면 6-7개의 단면을 건너뛰는 것이 여러 영역에서 다양한 종류의 구조물을 찾는 데 효율적입니다. 선택한 섹션의 해결된 모자이크 맵을 자동으로 획득하면 획득 후 이러한 섹션을 신중하게 선별할 수 있습니다. 이러한 고해상도 맵을 획득하면 여러 ROI를 잘라내거나 ROI(보조동영상 1)에서추가 로컬 이미징 영역을 정의하는 데 사용할 수 있습니다. 골기, 센트리올, 접합, 마이크로투룰, 다양한 유형의 소포는 이시나리오(보충 영화 1)로부터유익할 수 있는 구조의 좋은 예입니다.
큰 샘플에서 드물게 분포된 대형 ROI 분석(그림 4F-4H)
이 시나리오에는 문제가 ROI 식별이 아니라 현지화에 있는 "건초 더미의 바늘"으로 자주 설명되는 드문 이벤트가 포함됩니다. 많은 샘플의 경우 상관 관계 접근 방식은 유효한 옵션이 아니지만 ROI는 노출되는 초구조를 가지며 국소화될 때 높은 신뢰성으로 식별할 수 있습니다. 이러한 샘플의 경우 중간 해상도에서 수십~수백 개의 섹션이 있는 사전 선별된 샘플부터 시작하여 다단계 인수를 적용하는 것이 필수적입니다. 여기에 사용되는 소프트웨어에는 여러 섹션의 이미지 집합을 얻기위한 두 가지 전략이 있습니다: 더 높은 해상도로 미리 보기 이미지를 기록하거나 적절한 설정으로 배열 타일세트(그림 4F)를획득합니다. Drosophila 창자에 있는 다른 특화된 세포 모형은 무작위로 분포됩니다 (예를 들면 줄기, 장내 분비 세포), 및 임의의 방향으로 단면얇은 단면. 그러나 단일 섹션에서 또는 직렬 이미지의 컬렉션으로 고해상도 매개 변수를 사용하여 얻은 이미지를 선별 한 후 시각적으로 구별 될 수 있습니다(그림 4G). 정렬 후 스택은 다른 소프트웨어 솔루션을 사용하여 렌더링할 수있습니다(그림 4H,보충 동영상 2).
시나리오 1: 장 내장 (그림 5A)
오르가노이드는 현대 생명 과학의 가장 최첨단 도구 중 하나가 되고 있습니다. 이 거의 생리적인 3D 줄기 세포 유래 기관 모형은 조직 갱신, 약에 대한 반응 및 재생 의학을 포함하여 생체 내 생물학 프로세스의 범위에 대한 정확한 연구 결과 가능하게 합니다. 최근에 도입된 미니장관(34)은 생체 조직 생리학, 세포 형 조성 및 항상성을 밀접하게 닮은 차세대 오르가노이드 기술을 열어 질병 모델링, 숙주 미생물 상호 작용 및 약물 발견에 대한 광범위한 관점을 가능하게합니다. 그러나, 초구조적 특성화가 필요한 경우, 무작위 샘플을 이용한 이러한 큰 조직에서 상이한 세포 유형의 국소화가 어려울 수 있다. 또한, 가변 "감염"분석에서, 분석은 조직에 영향을 미치는 다른 발달 단계를 드러내는 것이 중요합니다. 이러한 연구에서는, 샘플의 통계적으로 유의한 범위는 중앙이지만 기존의 TEM 온 그리드 접근 방식을 사용하여 달성하기가 어렵습니다. AT-시나리오 1은 이러한 경우에 유익하다: 많은 순차적 섹션은 웨이퍼(그림5Aii)에서생성될 수 있으며, 저해상도 파라미터를 사용하여 심사하여 일반적인 관심 영역을 지역화할 수 있다(도5Aiii;arrows). 이러한 영역은 고급 획득 매개변수(그림 5Aiv 및 그림 5Av)를사용하여 추가 분석을 대상으로 할 수 있습니다. 관련 구조가 감지되면(일반적으로 100-300섹션마다 한 번씩 5~10개의 섹션의 클러스터)를 감지하면 관심 있는 각 구조에 집중하고 단일 이미지를 수동으로 수집하거나 자동화 기능을 사용하여 여러 섹션에서 이미지 볼륨을 획득하기 쉽습니다.
시나리오 2: 드로소필라 푸팔 노텀 (그림 5B)
세포 분열과 세포 주기를 통해 진행을 통제하는 기계장치를 공부하는 것은 다세포 유기체에 있는 표준 및 변경된 프로세스 둘 다 이해하는 데 중요합니다. 존재하는 정보는 종종 단세포 시스템에서 파생됩니다. 그러나, 이 해결책은 조직에 있는 세포 사이 3D 상호 작용의 중요한 문맥이 결여됩니다. 노텀의 단일 세포 단층, 드로소필라 유충의 발전 후면은, 특히35에서상피 세포와 세포 분열 사이의 상호 작용을 위한 완벽한 모델이다. 그것은 형광 현미경 검사법과 유전 조작에 의해 유효한 데이터의 조합을 사용하여 분자 및 세포 상호 작용 연구를 위한 확립된 모형입니다. 세포 분열의 마지막 단계인 압착은 두 개의 분할 세포 사이의 최종 분리를 보장하고, 복근 중에 발생하는 구조적 변화를 특성화하는 것은 미토시스에 대한 우리의 이해에 필수적입니다. 그러나, 노텀내의 미토틱 분단은 초구조적 수준에서 국소화하기 쉽지 않다: 세포는 상대적으로 크고, 복근영역(도 5B)에비해. 복근 영역의 전체 크기와 커버할 단면의 표면 사이의 비율은크다(도 5Bi). TEM 또는 SBF-SEM메서드(36)를사용하여 임침근 영역을 현지화할 수 있더라도 작업이 힘들다. 이 시나리오에서는 20-40개의 단면의 도약에 대한 자동 중간 해상도 개요 이미지를 사용하여 분할셀(그림 5Bii)을국소화할 수 있다. 이러한 세포가 확인되면, 섹션은 부근의 단면을 면밀히 검사하기 위한 앵커 역할을 하며, 추가 분석을 위해 수많은 분할 세포를 찾아서 선택할 수 있다. 이러한 방식으로, 복근 영역은전체(그림 5Biii)에위치및 이미지화될 수 있다. 질문에 따라 단일 고해상도 이미지 또는 3-7 이미지 시퀀스를 수집하여 구조의깊이(도 5Biv)를커버할 수 있습니다.
시나리오 3: 마우스 타니사이클 뉴런 (그림 5C)
마우스는 두뇌 발달을 위한 잘 확립된 모형을 제공하고 EM에 의해 포함하여 다른 수준에 잘 문서화됩니다. 다른 자동화 된 직렬 블록 얼굴 방법은 뇌 조직을 연구하기 위해 광범위하게 사용되었지만 AT가 필요한 데이터를 수집하기 위해 더 잘 적응되는 경우가 있습니다. 시상 하 부는 잘 설립 된 신경 과학 모델, 여러 신경 유형 기능을 포함 하는 뇌의 일부. 시상 하 부 타니 사이클은 제 3 심실의 바닥을 일렬로 세우는 ependymoglial 세포의 특정 하위 집합을 나타내며 비정상적으로 긴 과정 (최대 300 μm) 및 큰 끝점 (~5 μm)37을나타낸다. 이렇게 하면 TEM 또는 FIB 메서드로 분석하는 것이 불편합니다. 여러 개의 독립적인 타니사이클을 현지화하고 분석해야 할 때 작업이 더욱 복잡해질 수 있습니다. 이 작업을 용이하게 하기 위한 접근법 중 하나는 EM에 대한 고정 및 포함전에 형광 도가가 형광 표시 샘플로부터 얻어지는 반 상관 관계 타겟팅일 수 있다. 단면은 형광 시료 및 평면 임베디드 플라스틱 복제본으로부터의 위치 정보를 결합하여 캡처된 영역에서 수행됩니다. 그 후 AT 시나리오 3을 사용할 수 있습니다: 높은 수준의 개요 모자이크 이미지가 생성되어 타니시테 엔드피트 클러스터가 있는 영역을 드러냅니다. 그 후 소프트웨어의 자동화 기능은 단일 이미지 또는 타일 모드에서 하나 또는 여러 영역에서 이미지 시퀀스 의 수집을 설정하는 데 사용됩니다. 이러한 이미지는 정렬된 스택으로 개별적으로 분석하거나 그 후에 렌더링할 수 있습니다.
AT 방법의 힘은 2D에서 3D로 데이터의 비교적 쉽게 "업그레이드"를 허용합니다: 맵은 기본 획득에서 사용할 수 있으며, 볼륨은 선택한 영역과 그 주변에서 얻을 수 있습니다. 결과 스택을 정렬하고 이후에 렌더링할 수 있습니다. ROI를 찾는 데 필요한 해상도와 이미지 품질을 미리 결정하는 것이 필수적입니다. 이미징은 ROI를 인식할 수 있어야 하지만 획득 시간이 픽셀 거주 시간과 픽셀 크기의 역 사각형에 비례적으로 확장되기 때문에 이 값을 넘어서는 것은 아닙니다.
그림 1: EM 샘플 제제 및 부피 획득의 과제. (A)샘플 준비 중 고중금속 농도 및 탈수로 인해 형광 및 수축의 손실이 발생합니다. (i) LM(ii) 하에서 관찰된 표본의 회로도도는 EM을 위해 준비된 동일한 시편으로, 이는 완전히 불투명해지고 부피의 약 10%를 잃는다. (B)샘플 포함은 전형적으로 에폭시 또는 아크릴 수지를 사용하여 수행됩니다. 기존 블록(i)은 특정 방향을 필요로 하지 않는 균일한 샘플에 성공적으로 사용될 수 있습니다. 플랫 블록 (ii)은 현미경, 예를 들어, 비 균일 한 샘플 또는 상관 현미경 절차에서 단면화를 목표로 정확한 영역, 현미경에서 대상 및 방향을 하는 것이 필수적일 때 도움이됩니다. (C)전체 샘플 부피 중, 제한된 분수만이 단일 50nm 섹션에 표시되어 3D 샘플의 2D 이미지를 제공하는 데 익숙하지 않은 방향으로 자주 나타난다. (D)정밀 타겟팅 대 지나치게 대량 의 기록 문제를 설명하기 위해, 우리는 1000, 500 및 50 μm의 면을 가진 세 개의 동심 큐브를 선택하여 가상 1000 x 500 x 500 μm 샘플 (다크 적갈색)을 포함하도록 조직되었습니다. 이러한 가상의 샘플 큐브가 전체 부피를 커버하기 위해 50 nm 슬라이스로 철저하게 절제된 경우 총 20,000, 10,000 슬라이스 및 1,000 개의 슬라이스, 800 tb, 100 tb 및 100gb가 필요합니다 (이미징 해상도 5 nm x 5 nm x 50 nm x 50 m 데이터) 이는 필요한 최소 볼륨을 획득하기 위해서만 EM 데이터 수집을 계획하는 것이 중요하다는 것을 보여줍니다. (E)고해상도로 큰 시료 표면적을 커버하는 것은 대용량과 유사한 문제점을 제시한다. 여러 고해상도 이미지를 하나에 배열하는 것은 이러한 문제에 대한 유용한 솔루션입니다. 그러나 10,000x 배율의 2024 x 1048 프레임을 사용하여 1mm x 1mm 표면을 커버하려면 많은 수의 타일이 필요하며, 이는 스티치에 도전이 될 수 있습니다. 또한 절단 중에 섹션이 다양하게 압축되거나 왜곡되면 결과 데이터 스택을 정렬하는 것이 거의 불가능해집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 큰 지지에 섹션의 배열의 직접 생성을위한 워크플로우. (A)트림 도구를 사용하여 꽉 트리밍의 경우, 블록은 마이크로 톤 홀더 내부에 고정된다. 이 단계는 블록의 평행면을 보장하고 샘플 주위의 빈 수지도 줄이는 데 도움이 됩니다. (B)AT 섹션 취득을 위한 변형된 칼. 대형 보트는 샘플 단면 화 및 지원에 전송하는 동안 섹션과 조작의 전송을 용이하게합니다. 큰 분지는 섹션의 조작을 가능하게한다; 배수 시스템은 배수 단계에서 리본의 움직임을 제한하고, 평평한 바닥은 지지체의 점진적 건조를 안정적으로 만듭니다. (C)칼은 분지 의 바닥에 배치 된 빛 배출 웨이퍼로 단면 할 준비가되어 있으며 물은 가장자리까지 수평됩니다. 칼의 구조는 지지에 방해하지 않고 바늘을 내장 유지합니다. (D)어레이 생성, 마이크로톤 단면 영역에서 의 상단 보기. (i) 첫 번째 섹션은 일반적으로 서로 붙어 일반 리본을 형성하기 때문에 쉽게 얻을 수 있습니다. (ii) 리본에 더 많은 섹션이 추가되고 더 길어지면 리본의 안정성이 상실되고 자주 곡선이 됩니다. 이미지 수집 단계에 대비하여 시퀀스 트랙을 순서대로 순서대로 정리하는 것이 중요합니다. (iii) 섹션리본이 원하는 길이에 도달하면 속눈썹을 사용하여 칼 가장자리에서 조심스럽게 분리됩니다. (iv) 물은 분지에서 배수된다; 웨이퍼는 완전히 공기가 건조 할 때까지 내부에 남아 있습니다. 이 단계는 섹션을 곧게 펴고 마이크로 폴드의 형성을 피하는 데 도움이되기 때문에 필수적입니다. 웨이퍼는 60°C의 오븐에 30분 이상 오븐에 배치되어 지지편을 부착합니다. (E)전송된 섹션의 예제 웨이퍼. 직선적이고 정확한 리본을 얻는 것이 편리하지만 실제 샘플은 대부분의 경우 이러한 이상적인 리본의 형성을 방지합니다. 그럼에도 불구하고, "조잡한"리본조차도 방대한 경우에 매우 유익하며, "깔끔한"리본의 중요성은 섹션이 수집되는 연구 전략에 달려 있습니다. 배율 막대 1cm.(F)일련 섹션이 있는 예제 슬롯 그리드. 하나의 그리드에서 많은 섹션이 수집되는 경우에도 단일 웨이퍼에서 수집할 수 있는 부분중 극히 일부에 불과합니다. 그리드(특히 슬롯 그리드)에서 섹션의 전달을 마스터하는 데 필요한 기술은 전자 현미경 샘플 준비를 마스터하는 데 상당한 병목 현상을 나타냈다. 스케일 바 500 μm.(G)어떤 섹션 수집 방법이 사용되든 AT 접근 방식의 강점은 온 그리드 컬렉션에 비해 순차적 섹션의 생성의 상대적 용이성입니다. 1000 μm x 500 μm 샘플 블록을 고려하는 경우 2cm x 4cm 웨이퍼 (i)에 약 100 개의 섹션에 맞는 것은 문제가 없습니다. 슬롯 그리드의 동일한 크기 섹션은 최대(ii)의 세 섹션/그리드에만 맞습니다. 그리드에서 직렬 섹션을 수집하는 데 어려움을 언급하지 않고 동일한 수의 섹션을 커버하는 데 필요한 그리드 수를 표시하는 확장된 이미지를 제공합니다. 배율 막대 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 배열 단층 촬영 워크플로의 중요한 단계입니다. 고해상도 이미지 스택의 무인 획득을 위한 워크플로의 회로도. 모든 준비 단계는 자동화되어 있으며(녹색 기어 기호)이며 섹션별로 수동으로 수행할 작업이 필요하지 않습니다. 이미지 스택은 자동 강성 또는 상체 정렬이 가능한 모든 이미지 분석 소프트웨어에 정렬할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 드로소필라 성인 용기를 데모 모델로 삼는 시나리오. (A)전방, 중간 및 후방의 3개의 주요 지역이 서로 다른 색상으로 지정된 해부 된 드로소필라 미드구트의 그림. (B)직감이 횡방향 단면에 지향되는 플랫 블록을 다듬어 놓습니다. 빈 수지 량은 관심 영역(흰색 사각형)을 포함하는 조직 주위에 신중하게 균형을 잡습니다. (C)가로 직렬 섹션은 AT 칼의 분지 내부의 수면에 떠 있다. 모든 이미지는 역 대비를 가진 거울 검출기를 사용하여 보조 전자 SEM 모드에서 획득되었습니다. (D)웨이퍼에 횡연 직렬 섹션의 스티치 모자이크 이미지. 스케일 바는 1000 μm입니다.(E) 드로소필라 내장을 통해 단면. 스케일 바 20 μm. 이미지는 7 x 7 미드 레인지 이미지의 스티치 모자이크입니다. Inset - 관심있는 특정 영역의 높은 배율 및 해상도 이미지 : (ii) 핵, (iii) 브러시 테두리 및 (i) 미토콘드리아. 모두를 위한 배율 막대 5 μm. (F)발달 세포(square)의 위치를 목표로 하는 내장을 통해 횡방향 단면의 중간 범위 이미지. 스케일 바는 20 μm.(G)패널 F. Scale bar에 존재하는 섹션의 분석 중에 국소화된 영역에 기초하여 수집된 직렬 섹션의 표적 배열은 10 μm입니다.(H)3D 모델은 패널 G에서 표적 직렬 획득으로부터 얻은 50개의 섹션 스택 서열을 기반으로 렌더링된다.
그림 5: AT 적용 시나리오에 대한 사례 연구. (A)장 가구형내의 상이한 세포 구조의 국소화. (i) 임베디드 실리콘 마이크로칩. 스케일 바 = 200 μm. (ii) 칩의 중앙 부분을 통해 127 개의 단면의 스티치 모자이크 이미지. 스케일 바 = 1500 μm (iii) 장 오르가노이드의 일부를 통해 전체 횡방향 섹션의 4개의 저해상도 이미지. 화살표는 관심의 잠재적 인 사이트를 가리킵니다. 스케일 바는 20 μm. (iv) 다른 ROI이며, 추가 분석을 위해 선택된 저해상도 현미경 그래프를 대상으로 합니다. 스케일 바 = 10 μm. (v) 관심있는 감염된 세포의 고해상도 이미지. 인접한 섹션에서 동일한 영역을 분석하면 필요한 경우 대상 3D 정보를 제공할 수 있습니다. 스케일 바 = 5 μm.(B) 드로소필라 멜라노가스터 푸팔 노텀의 미드바디 국소화. (i) 해부된 드로소필라 푸파의 회로도. 노텀은 보호 큐티클(brown)의 일부를 제거한 후 해부(베이지)에 노출되었다. 검은색 선은 단면(ii) 다이어그램에 제시된 영역을 통과하는 단면의 방향을 지정합니다. 이 이미지는 3x7을 순차적으로 촬영한 고해상도 SEM 이미지를 하나의 모자이크 패널에 결합합니다. 검은색 사각형은 분할 셀이 포함된 영역을 해제합니다. 스케일 바는 15 μm. (iii) 패널 ii로부터 분할 셀의 확대 된 이미지입니다. 이 배율 및 해상도에서 중간체는 분명합니다 (흰색 화살표). 전체 단면은 분할 세포를 찾기 위해 분석된다. 측면 스크리닝 단계 동안 20-30 섹션 간격에서 섹션의 다른 리본 사이를 뛰어 오르는 것은 수많은 분할 세포 쌍을 국소화하는 스토를 허용합니다. 스케일 바는 5 μm(iv)으로 분할 셀이 국소화될 때, 패널(iii)의 노란색 사각형에 의해 분리된 중간체 주변의 4개 섹션에서 수집된 중간체의 순차적 이미지이다. 스케일 바는 마우스 시상 하부에서 1 μm.(C)타니사이클 엔드피트 국소화이다. (i) 진동 슬라이스의 형광 이미지. 타니사이클은 tdTomato 형광 단백질(빨간색)을 표현합니다. 흰색 사각형은 관심 영역을 구분합니다. 규모 막대 500 μm. (ii) EM을 위해 준비된 동일한 진동 섹션은 패널(i)으로부터 형광 정보의 간접 상관관계에 기초하여 관심 영역 을 중심으로 신중하게 손질된다. 점선 흰색 선은 초박형 단면 영역을 나타냅니다. 스케일 바는 두 패널 모두에 대해 50 μm입니다. (iii) 관심 영역에서 진동 조각을 통해 단면. SEM 모자이크 이미지는 75개의 스티치 이미지로 구성됩니다. 여러 섹션은 측면 스크리닝을 대상으로 하며 유사한 매개 변수로 이미지됩니다. 단면도 종발 - 섹션은 ROI를 찾기 위해 "오프라인"으로 분석됩니다. 검은색 사각형은 타니시테 끝발을 포함하는 영역을 나타냅니다. 이 섹션은 추가 분석을 위한 앵커 역할을 합니다. 스케일 바는 혈관을 둘러싼 타니시테 엔드피트의 고해상도, 고해상도, 고배율 이미지입니다. 한 섹션에서 ROI의 초기 지역화 후, z-시퀀스는 인접한 섹션에서 앵커 섹션(panel iii)까지 상류로 수집된다. 배율 막대 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 초미세 절제술, 단면 수집 및 단면 저장 중 문제가 유물로 이어질 수 있습니다. 빈 수지의 대부분은 조직에서 분리하고 그 자체로 접혀 (세피아). 대선 된 블랙 박스는 전체 섹션을 포함하는 데 사용되는 영역을 지정합니다. 스케일 바 500 μm.(B)50nm 두께의 제브라피시 섹션의 표면에 작고 로컬 접힌다. 70nm 마우스 뇌 섹션의 표면에 비늘 바 1 μm.(C)칼 자국. 스케일 바 5 μm.(D)부분적으로 제브라피시 근육 섹션을 커버 웨이퍼의 표면에 머리카락 (별표). 노란색에서 조직은 분석을 대상으로합니다. 분홍색에서, 영향을받는 영역의 크기에 대한 참조 역할을하는 데 사용되는 세포. 스케일 바 50 μm.(E)얼룩말 피쉬 노토코드 오른쪽 아래 (검은 화살표)에 주름, 여기서 조밀 한 신경 조직 (파란색으로 그림자) 부드러운 근육 조직과 빈 수지 (검은 화살표)에 테두리. 스케일 바 10 μm.(F)E와 같이 50개의 이미지 스택의 볼륨 세분화는 이 영역이 대부분의 섹션에서 주름을 보였다는 것을 보여준다. 대시 다각형은 G. 스케일 바 10μm(G)XY 뷰가 F와 동일한 부피 세분화에 표시된 영역을 윤곽을 드러내며, 블록의 오른쪽 절반에 짧은 검은 색 스트로크로 주름을 나타낸다. 조직의 나머지 부분에 있는 스택의 정렬은 주름에 의해 영향을 받지 않습니다. G와 동일한 영역의 5 μm.(H)XZ 투영을 배율 막대 50개 섹션 모두에 주름을 나타낸다. 배율 막대 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 영화 1: 드로소필라 전방 미드구트를 통과하는 단면의 고해상도 몽타주 이미지. 반전된 SE-MD SEM 이미지의 모자이크 이미지입니다. 352개의 별도의 이미지 타일은 자동으로 5nm 해상도로 획득되어 전체 단면을 제시하기 위해 스티치되었습니다. 동일한 이미지를 사용하여 자세한 내용을 확대하고 데이터의 철저한 커버리지를 얻을 수 있습니다. 좁은 접합, 마이크로튜부리, 다양한 유형의 소포는 확대할 때 가능합니다. 스케일 바는 10 μm입니다.
보조 영화 2: 드로소필라 내장 세포 렌더링. 장 세포를 나누는 영역에서 섹션의 50 개의 정렬 된 모자이크 이미지. 세포 테두리(파란색, 청록색 및 주황색) 및 핵(흰색)의 IMOD 렌더링. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
전자 현미경 검사는 세포와 유기체의 초구조에 대한 통찰력을 제공하며, 이는 종종 3 차원 컨텍스트에 대한 관심구조를 이미지하는 것이 바람직합니다. 초구조 분석을 위한 수많은 EM 전술에도 불구하고 여전히 "골드 스탠다드" 솔루션은 없습니다. 주된 이유는 다양한 샘플, 많은 생물학적 질문으로, 종종 맞춤형 접근이 필요합니다. 제안된 AT 워크플로우는 샘플 처리, 데이터 수집, 평가 및 저장소에 필요한 시간을 최소화하도록 설계되었습니다. 또한 수정된 나이프는 배열 수집을 단순화하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 웨이퍼의 섹션의 컴팩트한 레이아웃은 샘플의 관찰 및 후속 저장모두에 편리합니다. 이 배열을 사용하면 리본에서 리본으로 수평으로 이동하고 각 섹션에 하나의 섹션만 스캔하여 샘플의 "측면 스크리닝"을 가능하게 하여 ROI를 국소화하는 데 필요한 시간을 크게 줄입니다. 제안된 데이터 수집 시나리오는 작고 무작위로 분산된 영역의 타겟팅을 용이하게 합니다. 일단 발견되면 AT/SEM은 수동으로 수행하든 자동 기능의 도움으로 고해상도 이미징을 관심 있는 볼륨으로 정확하게 제한합니다. 제한된 볼륨에 대한 AT는 작업자가 샘플을 탐색하고 이미징 영역을 하나씩 정의하는 것으로 수동으로 완료할 수 있습니다. 소프트웨어의 자동화된 모듈은 큰 섹션에서 작은 영역의 이미징을 위한 유연한 이미지 수집 전략을 제공합니다. 이 소프트웨어의 자동화를 통해 수백 개의 섹션에 대형 고해상도 이미지를 기록하여 SBFI와 유사한 볼륨을 달성할 수 있습니다. 모든 섹션의 개요 이미지를 기록하면 ROI 현지화가 간소화되고 현미경에서 소요되는 시간을 줄입니다. 오버뷰 및 고해상도 미리 보기 기록 중에 섹션이 손상되지 않으므로 AT/SEM은 샘플을 재사용하여 다른 ROI의 추가 데이터를 수집하거나 더 높은 해상도로 수집할 수 있도록 허용합니다.
이미지 수집 시간은 3D EM의 가장 중요하고 가장 비싼 측면 중 하나이므로 실험 설계에서 고려해야 합니다. 넓은 부위를 이미징하는 데 작은 영역보다 더 오래 걸리는 것은 놀라운 일이 아니지만, 선택한 이미징 매개 변수에 따라 각 섹션의 획득 시간이 초마다 다를 수 있습니다. 중요한 이미징 매개 변수에는 시야, 해상도 및 거주 시간의 크기가 포함됩니다. 픽셀당 10nm의 목표 해상도와 1 μs의 투지 시간을 가정할 때, 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm 또는 500 μm x500 μm의 필드를 이미징하는 데 4초, 100초 또는 2,500초가 소요됩니다. 우리는 전체 이미징 작업에 필요한 시간을 추정하기 위해 섹션 수로 이러한 섹션별 이미징 시간을 곱할 수 있습니다. 섹션 수가 적거나 현미경 도구 시간이 문제가 없는 경우 섹션당 긴 이미징 시간이 허용될 수 있습니다.
그러나 대부분의 경우 기록 시간을 야간 작업 또는 주말 작업으로 제한해야 합니다. 고려해야 할 3D EM의 똑같이 중요한 측면은 결과 이미지 데이터의 양과 구조입니다. 위에서 언급한 이미징 필드를 100개 섹션에서 기록하는 것은 각각 400MB, 10gb 또는 250gb의 이미지 데이터를 생성합니다. 500 μm x 500 μm 이미지는 각각 2gb보다 큰 추가 문제를 제기합니다. 데이터 평가에 사용되는 많은 소프트웨어 프로그램은 이 크기의 이미지를 열 수 없습니다.
이미징 시간을 줄이기 위해 후속 데이터 평가(예: 재구성, 추적)에 대한 신호 대 잡음 비율 요구 사항을 충족하고 기록을 정의된 ROI로 제한하는 것이 중요합니다. 소프트웨어의 AT 확장은 직렬 섹션의 작은 영역에서 이미지 수집을 용이하게 합니다. 이 소프트웨어는 수동 및 자동 워크플로우및 많은 반자동 변형을 지원합니다: 이미징 영역은 수동으로 배치하고 각 섹션에 초점을 맞출 수 있으며, 사용자는 자동 단면 파인더 및 위치 정렬 기능을 사용할 수 있습니다. 샘플 유형 또는 이미징 목표에 의해 선택되고 지원되는 자동화 수준에 따라 수백 개의 섹션에서 이미지 수집을 설정하는 데 필요한 시간은 전체 근무일(수동으로 완료) 또는 몇 분밖에 걸리지 않습니다. 원칙적으로 배열 단층 촬영은 작은 ROI를 획득하는 다른 3D EM 방법보다 더 어려워집니다. 연속 구간의 부정확한 영역 배치는 더 큰 영역을 획득하여 보상해야 합니다. 예를 들어, ROI가 크기가 20 μm x 20 μm이고 이미징 필드의 단면 위치 가변성이 10μm인 경우, 각 섹션에서 ROI가 완전히 캡처되도록 하기 위해 40 μm x 40 μm 이미지를 획득해야 합니다. 실제 이미지 위치 가변성은 위치 정렬 또는 사용자의 인내심을 위한 소프트웨어 기능의 가용성 또는 품질에 따라 100 μm에서 <10 μm까지 다양합니다. 이 소프트웨어를 사용하면 대부분의 샘플에서 너무 많은 수동 개입없이 10 μm을 달성 할 수 있습니다.
다른 기술과 마찬가지로 AT는 성공적인 데이터 수집에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 약점을 가지고 있으며, 많은 사람들이 다른 단면 기반 방법과 유사합니다. 빈 수지대 조직의 균질분포가 부족하면 곡면또는 파손된 배열이 발생할 수 있습니다. 극단적인 경우, 단면은 지지에서 분리될 수있다(도 6A). 절단 공정 중 가변 압축 또는 스트레칭은 후속섹션(그림 6B)에서가변 영역에서 샘플을 방해할 수 있는 접이를 만들 수 있다. 칼 자국은 손상된 나이프(도6C)를사용하여 수집된 섹션의 표면에 나타날 수 있다. 단면 조건의 차이는 가끔 단면 압축 및 두께 차이를 유도할 수 있습니다. 먼지 또는 먼지 입자는 단면에 착륙하여 관심영역(도 6D)을부분적으로 모호하게 할 수 있습니다. 불완전한 자동 대비, 자동 초점 및 자동 낙인 기능으로 인해 이미지 수집이 실패할 수 있습니다. 자동으로 생성된 이미징 영역의 위치는 가변적일 수 있으며 모든 섹션에서 ROI를 캡처하지 못할 수 있습니다.
스티치 및 정렬 단계에서 몇 가지 문제가 발생할 수 있습니다. 예를 들어 샘플 내부의 큰 빈 공간으로 인해 모자이크 타일 획득의 자동 스티치가 실패할 수 있습니다. 3D의 모양이 급격한 변화로 인해 이미지 스택을 등록하기가 어려울 수 있습니다. 특별히 개발 된 프로그램 (예 : IMOD, 피지, TrackEM2, MIB 또는 MAPS-AT)는 반자동 정렬32,38,39,40을용이하게 할 수 있습니다. 사진 편집 소프트웨어를 사용하여 보다 까다로운 섹션을 수동으로 정렬할 수 있습니다. 안타깝게도 일부 데이터 집합은 올바르게 정렬하는 것이 불가능할 수 있습니다.
그리드에 맞는 TEM 직렬 섹션에는 큰 샘플이 까다롭습니다. 반면에 많은 프로젝트는 FIB/SEM 또는 SBF-SEM을 사용하여 긴 자동 인수를 정당화하지 않습니다. AT는 웨이퍼의 직렬 섹션의 수집 및 조작이 슬롯 그리드보다 더 간단합니다 지루한 직렬 섹션 TEM에 대한 간단한 대안입니다. 배열의 수집을 용이하게 하기 위해 여러 전략이 개발되었으며 기존 툴킷을 확장하는 방법을 공유합니다. ROI의 식별이 어려운 경우 AT-SEM은 50~500개 섹션에서 세포기관 스케일 분해능이 필요한 샘플의 효율적인 선별과 함께 근본적인 이점을 제공합니다. 더 많은 볼륨의 경우 더 많은 섹션이 필요한 경우 자동 컬렉션 AT 전략을 효율적으로 수집할 수 있습니다. AT 샘플은 이전에 획득한 개요 이미지를 기반으로 고해상도 영역의 표적 이미징을 용이하게 하여 여러 번 다시 이미지화할 수 있습니다. 여기에서 제안된 AT/SEM에 의한 목표 분석 및 축소된 오버샘플링이 인건비 및 데이터 저장 요구 사항을 감소시한다고 생각합니다. 궁극적으로, 섹션의 라이브러리를 수집하고 나중에 재사용 및 상담을 위해 유지 관리 할 수 있습니다. 볼륨 획득의 경우 FIB 또는 SBF-SEM 접근 방식은 ROI가 블록 면에서 쉽게 식별할 수 있거나 분석에 큰 3D 볼륨이 필요한 경우 탁월한 솔루션을 제공합니다. 그러나 FIB/SBF-SEM은 고해상도 스택 이미지를 대상으로 정의된 ROI에서 수집해야 할 때 효율성이 낮습니다. 결론적으로 AT 샘플을 선별하는 제안된 방법과 중간 해상도 개요 이미지를 사용하면 이미지 수집을 섹션 배열의 관련 부분으로 제한할 수 있습니다. 이미징 영역을 정밀하게 목표로 하면 데이터 간 속도가 빨라지고 데이터 평가를 간소화합니다.
요약하자면, AT/SEM의 개념은 참신하지는 않지만, 그 사용은 여전히 그 장점이 제안하는 만큼 광범위하지 않습니다. 전반적으로 다른 기존 EM 메서드에 대한 보완 적인 절차를 제공합니다. AT/SEM은 광범위한 샘플 준비 프로토콜 및 이미징 워크플로우와 호환되며 모든 FIB/SEM 또는 SBF-SEM 현미경에서 동반 된 기술로 수행 할 수 있습니다. 이 문서에서는 다른 방법으로 성공적으로 해결할 가능성이 적은 샘플의 초구조 데이터를 기록하기 위해 AT에 집중했습니다. 우리는 섹션의 편리한 수집에 대한 설명 된 절차와 상당히 자동화 된 인수 전략이 방법을 만난 적이없는 사람들을위한 첫 번째 시도에 도움이 될 것이며 이미 경험이있는 사람들을 위해 그것을 완벽하게 하는 데 도움이되기를 바랍니다.
Disclosures
저자 틸만 프랭크는 전자 현미경과 문서에 사용되는 파일럿 프로그램을 제조 Thermo Fisher의 직원입니다.
Acknowledgments
우리는 AT 절차의 다른 단계의 이 발달 도중 그들의 지원에 대한 로잔 대학의 EM 시설의 회원들에게 감사드립니다. 우리는 가레스 그리피스, 마르타 로드리게스, 우르스카 렙니크, 크리스텔 제노드, 헬무트 그네기, 에이나트 젤링거, 파올라 모레노 로마, 루시 오브라이언과 린지 르웰린에게 원고와 비판적 독서를 준비하는 동안 토론을 하고 싶습니다. 마티아스 루솔프, 미하일 니콜라예프, 데반잘리 두타, 틸 마자트, 패니 랭글렛 등 다양한 시나리오를 시연하는 데 사용된 샘플을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cutting | |||
| AT sectioning knife | Diatome | DUATS3530 | Diatome Jumbo knife |
| Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | Diatome trimming 20° Glass knife |
| Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | |
| Silicon wafer | Ted Pella | 16015 | Resistance: 1-30 Ohms Type P: (Boron) (1 primary flat) Roughness: 2 nm No SiO2 top coating TTV: = <20 µm Wafer is polished on one side |
| Ultramicrotome | Leica UC6 | Alternative: Leica UC7 | |
| Wafer cleaving kit | EMS | 7642 | EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652 |
| Image acquisition | |||
| FESEM | Thermo Fischer Helios | 1072419 | Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN |
| Maps 3 for SEM with Correlative Workflow & Array Tomography | Thermo Fisher Scientific | 1135932 | Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation. |
| Image analysis | |||
| Amira x.y | Thermo Fisher Scientific | 1131599 | Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction. |
| Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | IMOD, MIB (See text for refferences) |
References
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