Ein Murinschwanz-Lymphödem-Modell

Lymphödem ist eine Schwellung der Extremität, die durch lymphatische Dysfunktion verursacht wird. Die betroffene Extremität vergrößert sich aufgrund der Ansammlung von Flüssigkeit, Fett und Fibrose¹. Lymphödem betrifft 250 Millionen Menschen weltweit^2,3,4. Es wird geschätzt, dass 20-40% der Patienten, die sich einer Behandlung für solide Malignome wie Brustkrebs, Melanom, gynäkologische/urologische Tumoren oder Sarkome unterziehen, lymphödemisch^2,4,5entwickeln . Morbidität durch Lymphödem umfasst wiederkehrende Infektionen, Schmerzen und Deformitäten⁶. Es gibt keine Heilung für diese fortschreitende, lebenslange Krankheit. Aktuelle Therapien sind variaby wirksam⁷ und umfassen Kompression, vollständige entstauende Therapie durch Physiotherapeuten, Exzisionsverfahren und mikrochirurgische Operationen, einschließlich vaskularisierter Lymphknotentransfer und lymphovenöser Bypass^{7,8,9,10,11,12,13,14}. Die ideale Behandlung von Lymphödemen muss noch entdeckt werden.

Die Untersuchung des Mechanismus und der Therapie von Lymphödemen war begrenzt. Es gibt einen durchschnittlichen verzögerten Beginn von einem Jahr nach der Lymphverletzung^15,16 und die meisten Personen, die eine iatrogene Beleidigung mit Bestrahlung und Operation^erfahren,entwickeln kein Lymphödem⁴,^6,17. Obwohl große Tiermodelle, einschließlich Hunde, Schafe und Schweine,¹⁸,^19,20beschrieben wurden, wurde das Mausschwanzmodell aufgrund von Leichtigkeit, Kosten und Reproduzierbarkeit am häufigsten angewendet. Mausmodelle zur Untersuchung von Lymphödemen umfassen ein Schwanzmodell, Diptherie-Toxin-vermittelte Lymphablation und axilläre oder popliteale Lymphknotendissektion^{21,22,23,24,25,26}. Die meisten Schwanzmodelle verwenden eine fokale, volldicke Hautexzision mit Lymphkanalschnitt, die in der Nähe der Schwanzbasis²²durchgeführt wird, was zu Schwanzschwellungen und histologischen Merkmalen ähnlich dem menschlichen Lymphödem^24,27,28,29führt . Das Standard-Murinenschwanzmodell löst sich jedoch typischerweise spontan in nur 20 Tagen auf und wird von periodischer Schwanznekrose^{begleitet 30}. Das Lymphödem-Mausschwanzmodell verlängert ein anhaltendes Lymphödem über 15 Wochen hinaus, zeigt eine bestätigte arterielle und venöse Durchgängigkeit und ermöglicht die Beurteilung funktioneller lymphatischer Dysfunktionen.

Ein murines Schwanzmodell des Lymphödems ermöglicht die Bewertung neuartiger Therapeutika zur Behandlung von Lymphödemen. Genbasierte Strategien wurden im Mausmodell verwendet, das durch virale Vektoren vermittelt wurde^31,32. Wir verwenden auch eine neuartige Gewebe-Nanotransfektionstechnologie (TNT) für die genetische Frachtabgabe an den lymphödematösen Mausschwanz. TNT ermöglicht die direkte, transkutane Genabgabe mit einem Chip mit Nanokanälen in einem schnell fokussierten elektrischen Feld^33,34,35,36. Das Modell beinhaltet die Verwendung von TNT_2.0, um die fokale Genabgabe potenzieller genbasierter Therapeutika an die lymphatische Verletzungsstelle des Mausschwanzes zu ermöglichen³⁵.

Das Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Tierforschung der Institution. Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Indiana University School of Medicine genehmigt. Die Tiere wurden unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit Nahrung und Wasser ad libitum untergebracht.

1. Chirurgische Störung der Mausschwanzlymphen

1. Verwenden Sie acht Wochen alte C57BL/6-Mäuse gleicher Geschlechterverteilung.
2. Legen Sie eine Maus unter Vollnarkose in eine Induktionskammer mit 3-4% Isofluran in 100% Sauerstoff, gefolgt von einer Erhaltungssedierung bei 1-3% während des Eingriffs.
3. 0,5 mg/kg Retflin(SR)-Buprenorphin subkutan zur Schmerzkontrolle verabreichen.
   HINWEIS: Zusätzliche Analgetika, die nach der Operation verabreicht werden: Carprofen einmal alle 24 Stunden für mindestens 48 h und Bupivacain einmal entweder nach dem Schnitt oder vor dem Schließen des Schnitts, aufgetragen durch Tropfen auf die Hautränder (dauert bis zu 4 – 6 h).
4. Positionieren Sie die Maus dorsal und bereiten Sie den Schwanz mit 70% Isopropylalkohol vor.
5. Messen Sie den Schwanzdurchmesser vor dem Eingriff in Schritten von 5 mm, beginnend 20 mm von der Basis des Leitwerks mit einem Bremssattel. Diese Messungen werden verwendet, um das Volumen mit der kegelstumpfenden Gleichung³⁷zu berechnen.
6. Markieren Sie eine 3 mm umfangsumfangsen Exzision am Schwanz 20 mm von der Basis entfernt.
7. Führen Sie eine sorgfältige 3 mm Hautexzision in voller Dicke mit einer sterilen chirurgischen Klinge (Größe 15) durch, wobei alle darunter liegenden Gefäße unter chirurgischer mikroskopischer Vergrößerung intakt bleiben. Schneiden Sie die obere Umfangsmarkierung (20 mm von der Schwanzbasis) zuerst durch die Dermis, gefolgt von einem umlaufenden Einschnitt in voller Dicke 3 mm vom ersten Schnitt.
   1. Machen Sie einen senkrechten vertikalen Schnitt in voller Dicke, um die beiden Einschnitte zu verbinden. Verwenden Sie einen gezahnten feinen Tonabnehmer, um eine Vorderkante zu greifen, und verwenden Sie Mikroschneidezähne, um vorsichtig tief in der avaskulären Ebene zur Dermis und oberflächlich zur Venenadventitien zu sezieren.
8. Injizieren Sie 0,1 ml Isosulfanblau (1%) subkutan proximal zur Schwanzspitze.
9. Identifizieren Sie die beiden Lymphkanäle neben den seitlichen Schwanzvenen unter dem Operationsmikroskop. Die Lymphe erscheint blau wegen der Isosulfan-Injektion. Transektieren Sie die Lymphgefäße mit einer geraden mikrochirurgischen Schere. Verwenden Sie die Schere, um eine Ebene zwischen der Seitenvene und der Lymphe vorsichtig zu sezieren. Dann passieren Sie die Spitze einer Scherenklinge zwischen dem Lymphgefäß und der Seitenvene und schließen Sie die Klingen, um das Lymphgefäß zu transektieren.
10. Kleiden Sie die Schwanzwunde mit einem sterilen, anhaftend klaren Verband. Überprüfen Sie die Schnitte nach der Operation täglich, um sicherzustellen, dass sie nicht infiziert sind oder bluten, und bieten Sie eine Wundversorgung für 2 Wochen.
11. Beherbergen Sie die Tiere nacheinander, um weitere Verletzungen am Schwanz zu vermeiden und zu verhindern, dass sich die Tiere gegenseitig beißen, was zu chirurgischen Komplikationen führen würde.

2. Schwanzgefäßuntersuchung mit Laser-Speckle-Kontrastbildgebung

1. Betäuben Sie die Maus wie in Schritt 1.2.
2. Um die Laser-Speckle-Kontrastbildgebung zur Visualisierung der Schwanzvaskularität zu verwenden, stellen Sie die Breite auf 0,8 cm, die Höhe auf 1,8 cm, die Punktdichte auf hoch, die Bildrate auf 44 Bilder / Sekunde, die Zeit auf 30 Sekunden und das Farbfoto auf 1 pro 10 Sekunden ein.
3. Bewerten Sie die venöse und arterielle Perfusion auf Durchgängigkeit. Qualitativ sollte die Kontinuität des Flusses visualisiert werden.

3. Funktionelle lymphatische Beurteilung mit Nahinfrarot-Laserangiographie

1. Betäubung des Tieres wie in Schritt 1.2
2. Rekonstituieren Sie Indocyaningrün (ICG) (25 mg/10 ml) und verabreichen Sie 0,1 ml subkutan in den distalen Mausschwanz in der Nähe der Spitze.
3. Dimmen Sie die Raumlichter. Platzieren Sie die Nahinfrarot-Laser-Angiographie in einer Puffereinstellung, gefolgt von einer Live-Aufnahme.

4. Fokale Abgabe von Nukleinsäurefracht an Mausschwanz mit TNT

1. Betäuben Sie das Tier wie in Schritt 1.2.
2. Peelen Sie den Mausschwanz mit topischer Hautpeelingcreme.
3. Tauchen Sie den Mausschwanz 5 Minuten lang bei 37 °C in Kollagenaselösung (10 mg/ml).
4. Laden Sie DNA in das TNT_2.0 Chip Reservoir³⁵.
5. Platzieren Sie das TNT_2.0 Silikonchip-Gerät über der gewünschten Brennstelle der Abgabe auf dem Schwanz mit Nanonädeln in Kontakt mit dem Schwanz.
6. Legen Sie eine positive elektrische Sonde in den Behälter. Befestigen Sie die negative Sonde an einer 30 G-Nadel und führen Sie die Nadel subkutan in den Schwanz an der Entbindungsstelle ein.
7. Anwenden von Rechteckwellenpuls elektrische Stimulation (10 x 10 ms Impulse, 250 V, 10 mA).

Die Technik für das Mausschwanzmodell für anhaltende Lymphödeme ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Figur zeigt die relevante Anatomie des Mausschwanzmodells. Abbildung 2 zeigt die fortschreitende Schwellung und das anhaltende persistierende Lymphödem im Mausschwanz nach Lymphödeminduktion. Das Schwanzvolumen der Maus, berechnet durch die verkürzte Kegelgleichung, erreicht seinen Höhepunkt in Woche 4 und plateaus bis Woche 6, gefolgt von einer allmählichen Verbesserung, die bis Woche 15 angehalten wird. Das Schwanzvolumen kann als Ergebnisvariable verwendet werden, um die Wirkung therapeutischer Interventionen bei Lymphödemen im Modell zu bewerten. In Abbildung 3können hochauflösende Lasersprenkel zur Beurteilung der Durchgängigkeit von Schwanzgefäßen beobachtet werden. Dies erhöht die Strenge des Modells, um sicherzustellen, dass das Wohlbefinden eher auf lymphatische Dysfunktion als auf Venenverletzungen beruht. Die Wirkung von Interventionen kann dann möglicherweise mit größerer Sicherheit in eine Lymphödembehandlung umgesetzt werden. Abbildung 4 zeigt eine funktionelle lymphatische Beurteilung, die mittels Nahinfrarot-Laserlymphangiographie durchgeführt wurde. Diese zusätzliche Ergebnisvariable ermöglicht eine funktionelle lymphatische Wirkung von Interventionen. Abbildung 5 zeigt die fokale Abgabe genetischer Fracht transkutan an der Operationsstelle mittels Gewebe-Nanotransfektionstechnologie (TNT2.0). TNT2.0 erleichtert die Point-of-Care-Bereitstellung potenzieller genbasierter Therapeutika in diesem Lymphödemmodell.

Abbildung 1: Mausschwanzmodell für anhaltende Lymphödeme. (A) Eine 3 mm breite Hautexzision in voller Dicke wird an einem murinen Schwanz 20 mm von der Basis unter dem chirurgischen Mikroskop durchgeführt. Es wird darauf geachtet, das Gefäßsystem zu erhalten. (B) Schematische Darstellung des Querschnitts des Mausschwanzes. DV=Rückenvene, LV=Venen lateral, A=Schwanzarterie ventralis, CV=Schwanzwirbel, T=Sehne und Muskel, gelbe Pfeile zeigen die Lymphe. (C) Nach Verabreichung von Isosulfanblau in die Schwanzspitze, um die Lymphe zu lokalisieren, zeigen die Lymphe (gelber Pfeil) eine blaue Farbe. Die Lymphe wird gestört, während die angrenzenden Seitenvenen erhalten bleiben (weißer Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Progressive Schwellung des Mausschwanzlymphödemmodells. (A) Nach vollständiger Hautexzision und Lymphtransektion weist der Mausschwanz eine fortschreitende Schwellung auf, die über 15 Wochen anhielt. Die Halterung kennzeichnet 20 mm von der Basis des Schwanzes bis zum Beginn der chirurgischen Hautexzision in voller Dicke. (B-C) Quantifizierung der Veränderung des Schwanzvolumens über 15 Wochen dargestellt als (B) Balkendiagramme, wobei jeder Punkt ein Tier darstellt, n = 15 oder als (C) Liniendiagramm. Daten, die als ± SEM dargestellt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Hochauflösende Laser-Speckle-Kontrastbildgebung zur Bestätigung der Mausschwanzperfusion im Lymphödem-Mausschwanzmodell. Laser Speckle wird verwendet, um die Mausschwanzgefäße postoperativ zu beurteilen, um die Schwellung der lymphatischen Ätiologie zu validieren und die Schwanznekrose zu minimieren. (A) Ein Mausschwanz mit verletzten seitenseitigen Venen (schwarzer Pfeil), der durch Laserflecken erkannt wurde. (B) Intakte laterale Schwanzvene (schwarzer Pfeil) Post-Lymphödem-Operation durch Laser-Speckle erkannt. (n=5) Auflösung 0,02 mm; Der farbcodierte Balken zeigt die Durchblutung (blau: niedrig, rot: hoch) an, gemessen in beliebigen relativen Einheiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Beurteilung der Lymphfunktion mittels Nahinfrarot-Laserlymphangioraphie im Mausschwanzmodell. Indocyaningrün (ICG), das in die Spitze des Mausschwanzes injiziert wird, lokalisiert sich in den Lymphgefäßen. Präoperativ sind die Lymphe entlang des Mausschwanzes intakt. Postoperativ gibt es keinen ICG-Transit über die Operationsstelle hinaus, was bestätigt, dass schwellungen durch lymphatische Dysfunktion verursacht werden. Gelber Pfeil zeigt die Basis des Schwanzes an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Fokale Abgabe genetischer Fracht mittels Gewebe-Nanotransfektionstechnologie (TNT). (A) Abbildung der TNT-Lieferung. (B) Plasmide werden in das TNT2.0-Reservoir geladen. Die positiven und negativen elektrischen Sonden werden angebracht und eine kurze, rechteckige Impuls-elektrische Stimulation wird abgegeben (10 x 10 ms Impulse, 250 V, 10 mA), die eine fokale, nicht-virale, transkutane Transfektion erleichtert. (C) Effizienz der genetischen Frachtabgabe unter Verwendung von TNT2.0, beobachtet durch Fluorescein amidit (FAM) markierte DNA-Abgabe an den murinen Schwanz. Mausschwänze wurden zwei Tage nach der TNT-Behandlung durch Fluoreszenzmikroskopie abschnitten und beurteilt. Weiße gepunktete Linien zeigen das Epithel der Haut des murinen Schwanzes an. Weiße Pfeile zeigen die FAM-markierte DNA an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessenkonflikte.