Methodenartikel

Ein Murinschwanz-Lymphödem-Modell

DOI:

10.3791/61848

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10. Februar 2021

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1Department of Surgery, Indiana Center for Regenerative Medicine and Engineering, Indiana University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Lymphödem ist eine Schwellung der Extremität, die durch lymphatische Dysfunktion verursacht wird. Wir beschreiben ein chronisches murines Schwanzmodell des Lymphödems und die neuartige Verwendung der Gewebe-Nanotransfektionstechnologie (TNT) für die genetische Frachtabgabe an den Schwanz.

Zusammenfassung

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Lymphödem ist eine Schwellung der Extremität, die durch lymphatische Dysfunktion verursacht wird. Die betroffene Extremität vergrößert sich aufgrund der Ansammlung von Flüssigkeit, Fett und Fibrose. Es gibt keine Heilung für diese Krankheit. Ein Mausschwanzmodell, das eine fokale Hautexzision in voller Dicke in der Nähe der Schwanzbasis verwendet, was zu einer Schwanzschwellung führt, wurde zur Untersuchung von Lymphödemen verwendet. Dieses Modell kann jedoch zu vaskulärer Nekrose und daraus resultierender Schwanznekrose und einer frühen Schwanzschwellungsauflösung führen, was seine klinische Übersetzbarkeit einschränkt. Das chronische Mausschwanzlymphödemmodell induziert ein anhaltendes Lymphödem über 15 Wochen und eine zuverlässige Perfusion des Schwanzes. Zu den Verbesserungen des traditionellen Mausschwanzlymphödemmodells gehören 1) präzise Exzision in voller Dicke und Lymphschnitt mit einem Operationsmikroskop, 2) Bestätigung der postoperativen arteriellen und venösen Perfusion mit hochauflösendem Lasersprenkel und 3) Funktionelle Beurteilung mit indocyaningrüner Nahinfrarot-Laserlymphangiographie. Wir verwenden auch die Gewebe-Nanotransfektionstechnologie (TNT) für neuartige nicht-virale, transkutane, fokale Abgabe genetischer Fracht an das Mausschwanzgefäß.

Einleitung

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Lymphödem ist eine Schwellung der Extremität, die durch lymphatische Dysfunktion verursacht wird. Die betroffene Extremität vergrößert sich aufgrund der Ansammlung von Flüssigkeit, Fett und Fibrose1. Lymphödem betrifft 250 Millionen Menschen weltweit2,3,4. Es wird geschätzt, dass 20-40% der Patienten, die sich einer Behandlung für solide Malignome wie Brustkrebs, Melanom, gynäkologische/urologische Tumoren oder Sarkome unterziehen, lymphödemisch2,4,5entwickeln . Morbidität durch Lymphödem umfasst wiederkehrende Infektionen, Schmerzen und Deformitäten6. Es gibt keine Heilung für diese fortschreitende, lebenslange Krankheit. Aktuelle Therapien sind variaby wirksam7 und umfassen Kompression, vollständige entstauende Therapie durch Physiotherapeuten, Exzisionsverfahren und mikrochirurgische Operationen, einschließlich vaskularisierter Lymphknotentransfer und lymphovenöser Bypass7,8,9,10,11,12,13,14. Die ideale Behandlung von Lymphödemen muss noch entdeckt werden.

Die Untersuchung des Mechanismus und der Therapie von Lymphödemen war begrenzt. Es gibt einen durchschnittlichen verzögerten Beginn von einem Jahr nach der Lymphverletzung15,16 und die meisten Personen, die eine iatrogene Beleidigung mit Bestrahlung und Operationerfahren,entwickeln kein Lymphödem4,6,17. Obwohl große Tiermodelle, einschließlich Hunde, Schafe und Schweine,18,19,20beschrieben wurden, wurde das Mausschwanzmodell aufgrund von Leichtigkeit, Kosten und Reproduzierbarkeit am häufigsten angewendet. Mausmodelle zur Untersuchung von Lymphödemen umfassen ein Schwanzmodell, Diptherie-Toxin-vermittelte Lymphablation und axilläre oder popliteale Lymphknotendissektion21,22,23,24,25,26. Die meisten Schwanzmodelle verwenden eine fokale, volldicke Hautexzision mit Lymphkanalschnitt, die in der Nähe der Schwanzbasis22durchgeführt wird, was zu Schwanzschwellungen und histologischen Merkmalen ähnlich dem menschlichen Lymphödem24,27,28,29führt . Das Standard-Murinenschwanzmodell löst sich jedoch typischerweise spontan in nur 20 Tagen auf und wird von periodischer Schwanznekrosebegleitet 30. Das Lymphödem-Mausschwanzmodell verlängert ein anhaltendes Lymphödem über 15 Wochen hinaus, zeigt eine bestätigte arterielle und venöse Durchgängigkeit und ermöglicht die Beurteilung funktioneller lymphatischer Dysfunktionen.

Ein murines Schwanzmodell des Lymphödems ermöglicht die Bewertung neuartiger Therapeutika zur Behandlung von Lymphödemen. Genbasierte Strategien wurden im Mausmodell verwendet, das durch virale Vektoren vermittelt wurde31,32. Wir verwenden auch eine neuartige Gewebe-Nanotransfektionstechnologie (TNT) für die genetische Frachtabgabe an den lymphödematösen Mausschwanz. TNT ermöglicht die direkte, transkutane Genabgabe mit einem Chip mit Nanokanälen in einem schnell fokussierten elektrischen Feld33,34,35,36. Das Modell beinhaltet die Verwendung von TNT2.0, um die fokale Genabgabe potenzieller genbasierter Therapeutika an die lymphatische Verletzungsstelle des Mausschwanzes zu ermöglichen35.

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Protokoll

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Das Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Tierforschung der Institution. Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Indiana University School of Medicine genehmigt. Die Tiere wurden unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit Nahrung und Wasser ad libitum untergebracht.

1. Chirurgische Störung der Mausschwanzlymphen

  1. Verwenden Sie acht Wochen alte C57BL/6-Mäuse gleicher Geschlechterverteilung.
  2. Legen Sie eine Maus unter Vollnarkose in eine Induktionskammer mit 3-4% Isofluran in 100% Sauerstoff, gefolgt von einer Erhaltungssedierung bei 1-3% während des Eingriffs.
  3. 0,5 mg/kg Retflin(SR)-Buprenorphin subkutan zur Schmerzkontrolle verabreichen.
    HINWEIS: Zusätzliche Analgetika, die nach der Operation verabreicht werden: Carprofen einmal alle 24 Stunden für mindestens 48 h und Bupivacain einmal entweder nach dem Schnitt oder vor dem Schließen des Schnitts, aufgetragen durch Tropfen auf die Hautränder (dauert bis zu 4 – 6 h).
  4. Positionieren Sie die Maus dorsal und bereiten Sie den Schwanz mit 70% Isopropylalkohol vor.
  5. Messen Sie den Schwanzdurchmesser vor dem Eingriff in Schritten von 5 mm, beginnend 20 mm von der Basis des Leitwerks mit einem Bremssattel. Diese Messungen werden verwendet, um das Volumen mit der kegelstumpfenden Gleichung37zu berechnen.
  6. Markieren Sie eine 3 mm umfangsumfangsen Exzision am Schwanz 20 mm von der Basis entfernt.
  7. Führen Sie eine sorgfältige 3 mm Hautexzision in voller Dicke mit einer sterilen chirurgischen Klinge (Größe 15) durch, wobei alle darunter liegenden Gefäße unter chirurgischer mikroskopischer Vergrößerung intakt bleiben. Schneiden Sie die obere Umfangsmarkierung (20 mm von der Schwanzbasis) zuerst durch die Dermis, gefolgt von einem umlaufenden Einschnitt in voller Dicke 3 mm vom ersten Schnitt.
    1. Machen Sie einen senkrechten vertikalen Schnitt in voller Dicke, um die beiden Einschnitte zu verbinden. Verwenden Sie einen gezahnten feinen Tonabnehmer, um eine Vorderkante zu greifen, und verwenden Sie Mikroschneidezähne, um vorsichtig tief in der avaskulären Ebene zur Dermis und oberflächlich zur Venenadventitien zu sezieren.
  8. Injizieren Sie 0,1 ml Isosulfanblau (1%) subkutan proximal zur Schwanzspitze.
  9. Identifizieren Sie die beiden Lymphkanäle neben den seitlichen Schwanzvenen unter dem Operationsmikroskop. Die Lymphe erscheint blau wegen der Isosulfan-Injektion. Transektieren Sie die Lymphgefäße mit einer geraden mikrochirurgischen Schere. Verwenden Sie die Schere, um eine Ebene zwischen der Seitenvene und der Lymphe vorsichtig zu sezieren. Dann passieren Sie die Spitze einer Scherenklinge zwischen dem Lymphgefäß und der Seitenvene und schließen Sie die Klingen, um das Lymphgefäß zu transektieren.
  10. Kleiden Sie die Schwanzwunde mit einem sterilen, anhaftend klaren Verband. Überprüfen Sie die Schnitte nach der Operation täglich, um sicherzustellen, dass sie nicht infiziert sind oder bluten, und bieten Sie eine Wundversorgung für 2 Wochen.
  11. Beherbergen Sie die Tiere nacheinander, um weitere Verletzungen am Schwanz zu vermeiden und zu verhindern, dass sich die Tiere gegenseitig beißen, was zu chirurgischen Komplikationen führen würde.

2. Schwanzgefäßuntersuchung mit Laser-Speckle-Kontrastbildgebung

  1. Betäuben Sie die Maus wie in Schritt 1.2.
  2. Um die Laser-Speckle-Kontrastbildgebung zur Visualisierung der Schwanzvaskularität zu verwenden, stellen Sie die Breite auf 0,8 cm, die Höhe auf 1,8 cm, die Punktdichte auf hoch, die Bildrate auf 44 Bilder / Sekunde, die Zeit auf 30 Sekunden und das Farbfoto auf 1 pro 10 Sekunden ein.
  3. Bewerten Sie die venöse und arterielle Perfusion auf Durchgängigkeit. Qualitativ sollte die Kontinuität des Flusses visualisiert werden.

3. Funktionelle lymphatische Beurteilung mit Nahinfrarot-Laserangiographie

  1. Betäubung des Tieres wie in Schritt 1.2
  2. Rekonstituieren Sie Indocyaningrün (ICG) (25 mg/10 ml) und verabreichen Sie 0,1 ml subkutan in den distalen Mausschwanz in der Nähe der Spitze.
  3. Dimmen Sie die Raumlichter. Platzieren Sie die Nahinfrarot-Laser-Angiographie in einer Puffereinstellung, gefolgt von einer Live-Aufnahme.

4. Fokale Abgabe von Nukleinsäurefracht an Mausschwanz mit TNT

  1. Betäuben Sie das Tier wie in Schritt 1.2.
  2. Peelen Sie den Mausschwanz mit topischer Hautpeelingcreme.
  3. Tauchen Sie den Mausschwanz 5 Minuten lang bei 37 °C in Kollagenaselösung (10 mg/ml).
  4. Laden Sie DNA in das TNT2.0 Chip Reservoir35.
  5. Platzieren Sie das TNT2.0 Silikonchip-Gerät über der gewünschten Brennstelle der Abgabe auf dem Schwanz mit Nanonädeln in Kontakt mit dem Schwanz.
  6. Legen Sie eine positive elektrische Sonde in den Behälter. Befestigen Sie die negative Sonde an einer 30 G-Nadel und führen Sie die Nadel subkutan in den Schwanz an der Entbindungsstelle ein.
  7. Anwenden von Rechteckwellenpuls elektrische Stimulation (10 x 10 ms Impulse, 250 V, 10 mA).

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Ergebnisse

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Die Technik für das Mausschwanzmodell für anhaltende Lymphödeme ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Figur zeigt die relevante Anatomie des Mausschwanzmodells. Abbildung 2 zeigt die fortschreitende Schwellung und das anhaltende persistierende Lymphödem im Mausschwanz nach Lymphödeminduktion. Das Schwanzvolumen der Maus, berechnet durch die verkürzte Kegelgleichung, erreicht seinen Höhepunkt in Woche 4 und plateaus bis Woche 6, gef...

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Diskussion

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Lymphödem wird als primäre (angeborene) oder sekundäre (iatrogene lymphatische) Verletzung kategorisiert38,39. Sekundäre Lymphödeme umfassen 99% der Fälle39. Sekundäre Lymphödeme werden am häufigsten durch Infektion (Filariose) oder postonkologische Behandlung mit Lymphadenektomie oder Bestrahlung verursacht4,39. Ein translationales Tiermodell ist für sekundäre Lymphödeme eine Hera...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessenkonflikte.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der American Association of Plastic Surgeons Academic Scholarship und des Verteidigungsministeriums W81XWH2110135   an AHH unterstützt. Stipendium der Aesthetic Surgery Education and Research Foundation an MS. NIH U01DK119099, R01NS042617 und R01DK125835 an CKS.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Tegaderm Film1626W
OperationsmikroskopLeica, Wetzlar, DeutschlandMSV266
Adhärenter Verband (Tegaderm)3M, St. Paul, Minnesota.1626W
Laser speckle (Pericam PSI System )Perimed AB, Stockholm, Schweden)PSIZ
Nahinfrarotlaser (LUNA)Stryker (ehemals Novadaq Technologies, Toronto, Kanada)LU3000
C57BL/6 MäuseJackson Laboratories000664
Micro-Adson Pinzette - 1x2 ZähneFine Science Tools (USA) Inc.11019-12
V-HookFine Science Tools (USA) Inc.18052-12
Skalpell SS NO15Fischer Scientific29556
Einwegnadel 30GX1Fischer Scientific305128
OperationsschereFischer Scientific12-460-796
Surgi-Or Juwelierzange, Sklar 4-1/2 ZollFischer Scientific50-118-4255
Federschere - gerade/scharf-scharf/ 8mm Cutting EdgeFine Science Tools (USA) Inc.15024-10
CardiogreenSigmaI2633-25MG
IsosulfanBlue (Lymphazurin)   50 mg/5mlMylan67457-220-05

Referenzen

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