Dieses Protokoll beschreibt ein dreidimensionales (3D) magnetisches Druckkultursystem, das die Dissektion des Umbaus von weißem Fettgewebe (WAT) ermöglicht, das durch ein konditioniertes Medium aus Krebszellen induziert wird. Die Verwendung eines 3D-Kultursystems von UCP1+-Adipozyten, die ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren, ermöglicht die Untersuchung von beigen Adipozyten, die zum Umbau des Fettgewebes beitragen.
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Methodenartikel
Dreidimensionale Adipozytenkultur als Modell zur Untersuchung des Kachexie-induzierten Umbaus von weißem Fettgewebe
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Kachexie bei Krebs (CC) präsentiert sich als ein Syndrom mit mehreren Manifestationen, das ein ausgeprägtes metabolisches Ungleichgewicht in mehreren Organen verursacht. Kürzlich wurde vorgeschlagen, dass die kachektische Auszehrung durch mehrere Entzündungsmediatoren stimuliert wird, die die integrative Physiologie von Fettgeweben und anderen Geweben wie Gehirn und Muskeln stören können. In diesem Szenario kann der Tumor auf Kosten des Wirts überleben. In neueren klinischen Forschungen wurde die Intensität der Erschöpfung der verschiedenen Fettdepots negativ mit dem Überlebensergebnis des Patienten korreliert. Studien haben auch gezeigt, dass verschiedene Stoffwechselstörungen den Umbau des weißen Fettgewebes (WAT) verändern können, insbesondere in den frühen Stadien der Kachexieentwicklung. Die WAT-Dysfunktion, die aus dem Gewebeumbau resultiert, trägt zur allgemeinen Kachexie bei, wobei die Hauptmodifikationen bei WAT aus morphofunktionellen Veränderungen, erhöhter Adipozyten-Lipolyse, Akkumulation von Immunzellen, Verringerung der Adipogenese, Veränderungen in der Vorläuferzellpopulation und der Zunahme von "Nischen" bestehen, die Beige/Brite-Zellen enthalten.
Um die verschiedenen Facetten des Kachexie-induzierten WAT-Umbaus, insbesondere die Veränderungen der Vorläuferzellen und des beigen Umbaus, zu untersuchen, war die zweidimensionale (2D) Kultur die erste Option für in vitro-Studien. Dieser Ansatz fasst die WAT-Komplexität jedoch nicht angemessen zusammen. Verbesserte Assays für die Rekonstruktion von funktionellem AT ex vivo helfen dabei, die physiologischen Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Zellpopulationen zu verstehen. Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes dreidimensionales (3D) Druck-Gewebekultursystem auf Basis magnetischer Nanopartikel. Das Protokoll ist optimiert für die Untersuchung von WAT-Remodeling, das durch Kachexie-induzierte Faktoren (CIFs) induziert wird. Die Ergebnisse zeigen, dass eine 3D-Kultur ein geeignetes Werkzeug für die Untersuchung der WAT-Modellierung ex vivo ist und für funktionelle Screens nützlich sein kann, um bioaktive Moleküle für einzelne Fettzellpopulationen zu identifizieren und die Entdeckung einer WAT-basierten zellantikachektischen Therapie zu unterstützen.
Einleitung
Lebende Organismen bestehen aus Zellen in 3D-Mikroumgebungen mit Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen und einer ausgeklügelten Transportdynamik für Nährstoffe und Zellen 1,2. Die meisten grundlegenden Erkenntnisse in der Zellbiologie wurden jedoch mit Hilfe von Monolayer-Zellkulturen (2D) gewonnen. Obwohl die 2D-Kultur einige der mechanistischen Fragen beantworten kann, rekapituliert dieser Ansatz die natürliche Umgebung, in der sich die Zellen befinden, unzureichend und ist möglicherweise nicht mit der Vorhersage einer komplexen Arzneimittelreaktion vereinbar
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Protokoll
1. Inkubation von 2D-Zellen mit magnetischen Nanopartikeln
- Züchten Sie adhärente 2D-Kulturen auf ~ 70 % Konfluenz mit Standard-Zellkulturverfahren.
- Bereiten Sie die magnetische Nanopartikelanordnung vor. Aus dem Kühlschrank nehmen und ca. 15 min auf Raumtemperatur (20-25 °C) erwärmen lassen1.
- Mischmedium: Geben Sie die magnetischen Nanopartikel direkt in 12 mL Medium in 100 mm Zellkulturplatten. Suspendieren Sie das Medium einige Male und resuspendieren Sie es, um eine homogene Verteilung der Nanopartikel zu erhalten.
HINWEIS: Das Medium erscheint aufgrund der braunen Farbe de....
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Ergebnisse
Adipospheroide aus 3D-Kultur von Zellen der stromalen Gefäßfraktion (SVF)
Sowohl 3D- als auch konfluente 2D-Kulturen wurden mit der gleichen Anzahl von SVF-Zellen aus demselben hautnahen WAT-Präparat der Maus (Abbildung 1A, Abbildung 1B) eingerichtet und dem gleichen experimentellen Protokoll unterzogen, um die Genexpressionsmarker zu vergleichen. Sphäroide, die mit Induktionsmedium stimuliert wurden, dehnten .......
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Diskussion
Dieses Protokoll richtet ein 3D-Zellkultursystem ein, um die Adipozytendifferenzierung in Adipospheroiden zu untersuchen, die aus primären SVF-Zellen aus WAT gewonnen werden. Im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Adhärentkulturen ermöglicht dieses 3D-System das AT-Remodeling, das den In-vivo-Bedingungen sehr ähnlich ist. In den letzten Jahren haben Studien gezeigt, dass die Kultivierung von Zellen in 3D im Vergleich zu einem 2D-Kultursystem eine unterschiedliche zelluläre Morphologie und Sign.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des NIH DK117161, DK117163 an SRF und P30-DK-046200 an Adipose Biology and Nutrient Metabolism Core des Boston Nutrition and Obesity Research Center sowie durch die São Paulo Research Foundation (FAPESP) Grants: 2018/20905-1 und CNPq 311319/2018-1 an MLBJr.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 3-Isobutyl-1-methylxanthin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | I-5879 | Zellkultur |
| 96-Well Bioprinting Kit, schwarz | Greiner (Monroe, NC, USA) | 655841 | Zellkultur |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-606-152 | Immunfluoreszenzfärbung, sekundär, 1:400 in TBS mit 0,1 % Tween-20-ZELLKULTUR-MIKROPLATTE |
| , 96 WELL, PS, F-BOTTOM UND MIKRO; KLAR, SCHWARZ, CELLSTAR, ZELLABWEISENDE OBERFLÄCHE, DECKEL, STERIL, 8 STK./BEUTEL | Greiner (Monroe, NC, USA) | 655976 | Zellkultur |
| Dexamethason | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D-1756 | Zellkultur |
| DMEM | Corning (Manassas, VA, USA) | 10-017-CV | Zellkultur |
| Fötales Rinderserum (Tova) | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 100-500 | Zellkultur |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | I-7378 | Zellkultur |
| Insulin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | I0516 | Zellkultur |
| LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642) | American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) | CRL-1642 | Lewis Lungenkarzinom-Zelllinie |
| NanoShuttle-PL | Greiner (Monroe, NC, USA) | 657843 | Zellkultur |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagenz (DAPI) | ThermoFisher (Waltham, MA, USA) | R37606 | Immunfluoreszenzfärbung gemäß den Anweisungen des Herstellers |
| Pen | strep Corning (Manassas, VA, USA) | 30-002-CI | Zellkultur |
| Perilipin-1 (D1D8) XP Kaninchen-mAb-Zellsignaltechnologie | (Danvers, MA, USA) | 9349 | Immunfluoreszenzfärbung, primär, 1:1000 bei TBS mit 0,1 % Tween-20 |
| Rosiglitazon | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | R-2408 | Zellkultur |
| Trypsin-EDTA, 0,05 % | Corning (Manassas, VA, USA) | 25-052-CI | Zellkultur |
| Reverse-Transkriptions-PCR-Primer | |||
| Primer | Forward | Reverse | |
| Adipoq | GTTCCCAATGTACCCATTCGC | TGTTGCAGTAGAACTTGCCAG | |
| Col4a1 | TCCAAGGGCGAAGTGGGTTT | ACCCTTGCTCGCCTTTGACT | |
| em>Cyclophilin a | ATGGCACTGGCGGCAGGTCC | TTGCCATTCCTGGACCCAAA | |
| Fabp4 | TGGTGACAAGCTGGTGGTGGAATG | TCCAGGCCTCTTCCTGGCTCA | |
| em>Fn1 | GCTTCCCCAACTGGTTACCCT | GGGTTGGTGATGAAGGGGGT | |
| Pgc1a | GAAAACAGGAACAGCAGCAGAG | GGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG | |
| em>Ucp1 | TCCTAGGGACCATCACCC | AGCCGGCTGAGATCTTTTCC | |
| strong>Mouse genotyping | |||
| Primer name | Description | Sequence | |
| Cre F | Generic Cre forward | GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC | |
| Cre R | Generic Cre | GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT | |
| oIMR7318 | mT/mG forward | CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT | |
| oIMR7319 | mT/mG Wildtyp reverse | CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA | |
| oIMR7320 | mT/mG mutant reverse | TCA ATG GGC GGG GGT CGT T | |
| WH336 | UCP1 Mutante vorwärts | CAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC | |
| WH337 | UCP1 Mutante reverse | GTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG | |
| WH338 | UCP1 Wildtyp vorwärts | GGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT | |
| WH339 | UCP1 Wildtyp reverse | GAT CTC CAG CTC CTC CTC CTC TGT C C |
Referenzen
- Haisler, W. L., et al. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nature Protocol. 8 (10), 1940-1949 (2013).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Na....
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Nachdrucke und Genehmigungen
