Dieses Protokoll zielt darauf ab, das Herz und die Lunge von Mäusen zu dezellularisieren. Die resultierenden Gerüste der extrazellulären Matrix (ECM) können immungefärbt und abgebildet werden, um die Position und Topologie ihrer Komponenten abzubilden.
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Methodenartikel
Dezellularisation des murinen Kardiopulmonalkomplexes
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Wir präsentieren hier ein Dezellularisierungsprotokoll für Mausherz und -lunge. Es produziert strukturelle ECM-Gerüste, die zur Analyse der ECM-Topologie und -Zusammensetzung verwendet werden können. Es basiert auf einem mikrochirurgischen Verfahren, das entwickelt wurde, um die Luftröhre und Aorta einer eingeschläferten Maus zu katheterisieren, um Herz und Lunge mit Dezellularisierungsmitteln zu durchdringen. Der dezellularisierte kardiopulmonale Komplex kann anschließend immungefärbt werden, um die Position struktureller ECM-Proteine aufzudecken. Das gesamte Verfahren kann in 4 Tagen abgeschlossen werden.
Die aus diesem Protokoll resultierenden ECM-Gerüste sind frei von Dimensionsverzerrungen. Das Fehlen von Zellen ermöglicht die strukturelle Untersuchung von ECM-Strukturen bis hin zur Submikronauflösung in 3D. Dieses Protokoll kann auf gesundes und krankes Gewebe von Mäusen im Alter von 4 Wochen angewendet werden, einschließlich Mausmodellen für Fibrose und Krebs, was den Weg zur Bestimmung des ECM-Remodelings im Zusammenhang mit kardiopulmonalen Erkrankungen ebnet.
Einleitung
Das ECM ist ein dreidimensionales Netzwerk aus Proteinen und Glykanen, das alle Zellen in einem vielzelligen Organismus beherbergt, Organen ihre Form verleiht und das Zellverhalten während des gesamten Lebens reguliert1. Ab der Eizellbefruchtung bauen und modellieren Zellen das ECM und werden wiederum streng von ihm kontrolliert. Der Zweck dieses Protokolls ist es, eine Möglichkeit zur Analyse und Kartierung von Maus-ECM zu eröffnen, da Mäuse der am häufigsten verwendete Modellorganismus in der Pathophysiologie von Säugetieren sind.
Die Entwicklung dieser Methode wurde durch die Notwendigkeit vorangetrieben, Metastas....
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Protokoll
Alle hier enthaltenen Verfahren wurden von der Ethikkommission zur Regulierung der experimentellen Medizin an der Universität Kopenhagen überprüft und genehmigt und stimmen mit der dänischen und europäischen Gesetzgebung überein. Um dieses Protokoll zu demonstrieren, haben wir weibliche BALB/cJ-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen und eine MMTV-PyMT-Maus im Alter von 11 Wochen verwendet.
HINWEIS: Die Vermeidung einer bakteriellen Kontamination des dezellularisierten ECM-Gerüsts liefert das beste Bildgebungsergebnis und ermöglicht eine langfristige Probenlagerung. Es ist daher wichtig, alle Schritte steril zu halten. Daher müssen alle Instrumente ....
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Ergebnisse
Kardiopulmonale Dezellularisation
Nach erfolgreichem Abschluss des Protokolls werden Herz und Lunge sowie das Begleitgewebe wie der Aortenbogen frei von Zellen sein. Die Dezellularisation kann durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung (Abbildung 1) der ECM-Gerüste validiert werden, die die Entfernung der Kerne im Vergleich zum nativen Gewebe zeigen. Diese Gerüste behalten die Abmessungen frischer Organe bei und ihre unlösliche ECM-Struktur ist
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Diskussion
Dezellularisierungstechniken, die auf Gewebebewegung basieren, verändern die ECM-Struktur, wodurch sie für die ECM-Strukturanalyse ungeeignet sind4. Die Perfusionsdezellularisation unter Verwendung eines anatomischen Weges wie der Aorta der Luftröhre ermöglicht es, das Kapillarbett oder die terminalen Alveolen zu erreichen und erleichtert die Abgabe von Dezelluliermitteln im gesamten Organ. Die Verwendung von zwitterionischen, anionischen und nichtionischen Detergenzien zur Dezellularisierung von .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Wir danken Prof. Ivana Novak und Dr. Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Universität Kopenhagen) für den Zugang zum Mikroskop. Diese Arbeit wurde vom Europäischen Forschungsrat unterstützt (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR und JTE); ein Promotionsstipendium der Lundbeck Foundation (R286-2018-621; MR); der Schwedische Forschungsrat (2017-03389; CDM); die Schwedische Krebsgesellschaft, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj und 190007; CDM); Deutsche Krebshilfe(dpa) RR); und die Dänische Krebsgesellschaft (R204-A12454; RR).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 Naht, Nadel mit dreieckigem Schnitt (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 Mikronaht (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson Pinzette | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson-Pinzette mit | Zähnen Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo Mikronadelhalter | Fine Science Tools | Nr. 12061-01 | |
| CO2 Beatmungskammer für Mäuse-Euthanasie | |||
| Deionisiertes Wasser (Milli-Q IQ 7000, Reinst-Laborwassersystem) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Einweg-Tablett aus Polystyrol (~30 > 50 cm) | |||
| Seziermikroskop (Greenough, mit zweiarmigem Schwanenhals) | Leica | S6 D | |
| Doppelendiger Mikroskopspatel | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont Mikropinzette (zwei) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont Mikrozange mit 45°; Spitzen (zwei) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Haarschneider | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey-Nadelhalter (mit Wolframkarbid-Backen) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenöser 24-Gauge-Katheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenöser 26-Gauge-Katheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo-Schere (harter Schnitt, gerade) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Mikrozange mit Ringspitzen (zwei) | Aesculap | FM571R | |
| Mikrofederschere (Vannas, gebogen) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Häutung Periostotom | Aesculap | D0543R | |
| Nadeln (27 Gauge; Mikrolanze) | BD | 21018 | |
| Papiertuch (steril) oder chirurgische Serviette | |||
| Zackenschere (CeramaCut, gerade) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatel (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Spritzen (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Spritzen (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Sehnenschere (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 Esel Anti-Meerschweinchen IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 Esel Anti-Kaninchen IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(Albumin-Rinderfraktion V, Standardqualität, lyophilisiert) | Serva | 11930.03 | |
| Kollagen IV polyklonaler Antikörper (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Wirt: Kaninchen |
| PBS (pH 7,4, 10&fach;, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Wirt: |
| polyklonaler Ziegen-Periostin-Antikörper (ein freundliches Geschenk von Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Wirt: Meerschweinchen | ||
| Skalpell Einweg mit Klinge Nr.11 (Stk. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normales Eselsserum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| strong>IMAGING | |||
| Detektoren (Hybrid-Detektor (Leica, HyD S-Modell) und Photomultiplier-Röhren (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluoreszenz-Lichtquelle | Leica | EL6000 | |
| Mikroskop (inverses Multiphotonenmikroskop) | Leica | SP5-X MP | |
| Objektiv (Lambdablau, 20&fach;, 0,70 numerische Apertur (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Zwei-Photonen-Ti– Saphirlaser (Spectra-Physik, Mai Tai DeepSee Modell) | |||
| Weißlichtlaser (WLL) | Leica | ||
| DEZELLULARISIERUNG | |||
| 70% Ethanol (absoluter Alkoholgehalt 99,9%); absoluter Alkoholgehalt muss mit deionisiertem Wasser auf 70% (vol/vol) eingestellt werden | Pflaumen | 1680766 | |
| deionisiertes Wasser (Milli-Q IQ 7000, Reinstwassersystem für Labor) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-zu-Schlauch-Verschraubungen (1/8 Zoll) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7,4, 10-fach, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Schlauchpumpe (mit 12 Kanälen) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silikonschlauch (mit 2 mm Innendurchmesser und 4 mm Außendurchmesser) | Ole Dich | 31399 | |
| Natriumazid | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Natriumdesoxycholat (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Natriumdodecylsulfat | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H& E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute | ethanol Plum | 201152-1L | |
| Deckgläser (24x50mm; 1000 Stück) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 Stück) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Kryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX Eindeckmedium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y Lösung alkoholisch 0,5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather Mikrotomklinge Edelstahl, C35 (50 Stück) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Objektträger (25 x 75 mm; 144 Stück) | Thermofisher | ||
| Mayers Hämatoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT Verbindung | VWR | 361603E | |
| Objektträger (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylol | Sigma | 534056-4L |
Referenzen
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extrace....
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Nachdrucke und Genehmigungen
