Dieses Protokoll zielt darauf ab, das Herz und die Lunge von Mäusen zu dezellularisieren. Die resultierenden Gerüste der extrazellulären Matrix (ECM) können immungefärbt und abgebildet werden, um die Position und Topologie ihrer Komponenten abzubilden.
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Methodenartikel
Dezellularisation des murinen Kardiopulmonalkomplexes
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Wir präsentieren hier ein Dezellularisierungsprotokoll für Mausherz und -lunge. Es produziert strukturelle ECM-Gerüste, die zur Analyse der ECM-Topologie und -Zusammensetzung verwendet werden können. Es basiert auf einem mikrochirurgischen Verfahren, das entwickelt wurde, um die Luftröhre und Aorta einer eingeschläferten Maus zu katheterisieren, um Herz und Lunge mit Dezellularisierungsmitteln zu durchdringen. Der dezellularisierte kardiopulmonale Komplex kann anschließend immungefärbt werden, um die Position struktureller ECM-Proteine aufzudecken. Das gesamte Verfahren kann in 4 Tagen abgeschlossen werden.
Die aus diesem Protokoll resultierenden ECM-Gerüste sind frei von Dimensionsverzerrungen. Das Fehlen von Zellen ermöglicht die strukturelle Untersuchung von ECM-Strukturen bis hin zur Submikronauflösung in 3D. Dieses Protokoll kann auf gesundes und krankes Gewebe von Mäusen im Alter von 4 Wochen angewendet werden, einschließlich Mausmodellen für Fibrose und Krebs, was den Weg zur Bestimmung des ECM-Remodelings im Zusammenhang mit kardiopulmonalen Erkrankungen ebnet.
Einleitung
Das ECM ist ein dreidimensionales Netzwerk aus Proteinen und Glykanen, das alle Zellen in einem vielzelligen Organismus beherbergt, Organen ihre Form verleiht und das Zellverhalten während des gesamten Lebens reguliert1. Ab der Eizellbefruchtung bauen und modellieren Zellen das ECM und werden wiederum streng von ihm kontrolliert. Der Zweck dieses Protokolls ist es, eine Möglichkeit zur Analyse und Kartierung von Maus-ECM zu eröffnen, da Mäuse der am häufigsten verwendete Modellorganismus in der Pathophysiologie von Säugetieren sind.
Die Entwicklung dieser Methode wurde durch die Notwendigkeit vorangetrieben, Metastasen-assoziiertes natives ECM2 zu charakterisieren und zu isolieren. Da Tumoren keine richtige anatomische Vaskularisierung fehlt und Mäuse relativ kleine Organismen sind, wurden mikrochirurgische Verfahren entwickelt, um die Aorta retrograd zu katheterisieren, während die Zirkulation des Hauptgefäßes, das zu einem Tumor führt (z. B. die Lungenvenen), isoliert wird, wodurch der Reagenzfluss fokussiert und die Tumordezellularisation ermöglicht wird. Diese Methode erzeugt ECM-Gerüste mit einer konservierten Struktur2, die immungefärbt und abgebildet werden können, was eine ECM-Strukturkartierung im Submikrometer-Detail ermöglicht. Um dieses Protokoll durchzuführen, ist es notwendig, chirurgische und mikrochirurgische Fähigkeiten (Dissektion, Mikroernährung und Katheterisierung) zu erwerben, die eine mögliche Einschränkung seiner Verwendung darstellen können. Unseres Wissens stellt diese Methode den Stand der Technik für die native ECM-Strukturbildgebung dar2,3.
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Protokoll
Alle hier enthaltenen Verfahren wurden von der Ethikkommission zur Regulierung der experimentellen Medizin an der Universität Kopenhagen überprüft und genehmigt und stimmen mit der dänischen und europäischen Gesetzgebung überein. Um dieses Protokoll zu demonstrieren, haben wir weibliche BALB/cJ-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen und eine MMTV-PyMT-Maus im Alter von 11 Wochen verwendet.
HINWEIS: Die Vermeidung einer bakteriellen Kontamination des dezellularisierten ECM-Gerüsts liefert das beste Bildgebungsergebnis und ermöglicht eine langfristige Probenlagerung. Es ist daher wichtig, alle Schritte steril zu halten. Daher müssen alle Instrumente und chirurgischen Materialien, einschließlich Naht, Mikronaht, Lösungen, Schläuche, Luer-Konnektoren und Katheter, steril sein. Oberflächen, einschließlich einer Polystyrolschale, müssen mit 70% Ethanol desinfiziert werden, und die Perfusion sollte vorzugsweise unter einer Laminar-Flow-Haube erfolgen. Alle Eingriffe finden bei Raumtemperatur statt, sofern nicht anders angegeben.
1. Postmortale Mikrochirurgie
- Die Maus wird mit einer CO2-Kammer eingeschläfert .
- Legen Sie die Maus in eine 4-Liter-Kammer und beginnen Sie, sich mit 100% CO2 zu füllen, beginnend bei 0,2 l / min für 2 minuten, bis sie nach 3 Minuten einen Durchfluss von 0,8 l / min erreicht. Die Maus sollte während der ersten 2 Minuten bewusstlos werden, und dann sollte die Atmung aufhören (normalerweise etwa 5 Minuten, aber der Fluss kann bei Bedarf aufrechterhalten werden). Bestätigen Sie den Tod, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Rasieren Sie Thorax, Bauch und Rücken der Maus mit der Haarschneidemaschine und desinfizieren Sie sie mit 70% Ethanol. Die Rasur reduziert die Anzahl der Artefakte aufgrund des Vorhandenseins von Haaren entweder auf Proben zur Bildgebung oder zur biochemischen Analyse erheblich.
- Befestigen Sie die Maus an einer Styroporschale und strecken Sie ihre Vorder- und Hinterbeine sowie kopf- und schwanz aus. Legen Sie es unter das mikrochirurgische Mikroskop.
- Mit einer Mayo-Schere mit geradem Muster stellen Sie einen chirurgischen Zugang mit einem Hautschnitt her, der von der submandibulären Region zum Unterbauch verläuft, und seziert subkutan, um die Brustwand und das Peritoneum freizulegen.
- Schneiden Sie mit einer mikrochirurgischen Schere die Muskeln Pectoralis major und Pectoralis minor entlang des sechsten Interkostalraums auf beiden Seiten der Brustwand ab.
- Schneiden Sie mit einer Schere mit geradem Muster das Brustbein entlang der vorherigen Schnitte ab und vervollständigen Sie dann eine Sternotomie, indem Sie das Brustbein entlang seiner langen Achse schneiden, dann beide Seiten der Brustwand anheben und festnageln, um den Kardiopulmonalkomplex freizulegen.
- Entfernen Sie mit einer rundspitzigen Mikrozange (oder Dumont-Mikrozange) den Thymus und das umgebende Fettgewebe, indem Sie sie vorsichtig von ihren Anbauteilen abziehen. Dies wird die wichtigsten Schiffe enthüllen.
- Verwenden Sie die Kauterisation, kauterisieren Sie die absteigende Cava-Vene und schneiden Sie mit einer geraden Musterschere die Speiseröhre.
- Trennen Sie mit einer scharfen Mikrozange die brachiozephalen Venen und die brachiozephalen, linken gemeinsamen Halsschlagadern und linken Subclaviaarterien vom darunter liegenden Gewebe, um die Ligatur und Kauterisation zu erleichtern.
- Mit einem Mikronadelhalter, einer scharfen Mikrozange und einer 9-0-Naht werden Die Stiche über die Entstehung der brachiozephalen, linken gemeinsamen Halsschlagader und der linken Arteria subclavia gelegt.
- Kauterisieren Sie die brachiozephalen Venen.
- Trennen Sie die submandibulären Speicheldrüsen entlang der Mittellinie, um die Nackenmuskulatur und die Luftröhre freizulegen. Trennen Sie die Muskeln, um das Cricothyroid-Band freizulegen. Öffnen Sie mit einer Mikroschere einen Eingang, indem Sie das Band schneiden.
- Führen Sie einen 27 G-Katheter in die Luftröhre ein und drücken Sie vorsichtig, bis sich die Luftröhre in die Bronchien verzweigt (d. H. Bis der Widerstand gegen den Katheter erreicht ist, und ziehen Sie sich dann 3 mm zurück). Achten Sie darauf, die Bronchien nicht zu stören. Legen Sie mit einer 6-0-Naht 3 Stiche um die Luftröhre, um den Katheter zu sichern.
- Schneiden Sie die Maus auf der Höhe des 12. Brustwirbels. Die absteigende Aorta verläuft anterior zur Wirbelsäule und sollte hier zusammen mit der Wirbelsäule geschnitten werden. Setzen Sie die untere Hälfte auseinander.
- Katheterisieren Sie die Aorta retrograd und drücken Sie den Katheter, bis er den Aortenbogen erreicht. Legen Sie mit einer 9-0-Naht 4 Stiche um die Aorta, beginnend 5 mm unter der Katheterspitze.
2. Dezellularisierung
- Schließen Sie die Maus über Silikonschläuche und Luer-Anschlüsse an ein Pumpensystem an. 15 min lang mit entionisiertem Wasser bei 200 μL/min perfundieren. Behalten Sie diese Durchflussrate während der Dezellularisation bei.
- Ändern Sie das Perfusionsmittel auf 0,5% Natriumdesoxycholat (DOC), verdünnt in entionisiertem Wasser, und perfundieren Sie es über Nacht.
- Ändern Sie das Perfusionsmittel auf 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), das in deionisiertem Wasser verdünnt ist, und perfundieren Sie es 8 Stunden lang.
- Über Nacht mit entionisiertem Wasser perfundieren, um SDS und DOC für 24 h wegzuspülen.
- Resezieren Sie das dezellularisierte Herz und die Lunge, indem Sie seine Anhaftungen am Thorax mit einer gekrümmten Schere schneiden und in einem sterilen Kryorohr mit deionisiertem Wasser mit 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin und 0,3 μM Natriumazid bei 4 °C lagern. ECM-Gerüste können mindestens 12 Wochen gelagert werden1. Wenn das Gerüst für die biochemische Analyse (z. B. Massenspektrometrie) verwendet wird, schockieren Sie in flüssigem Stickstoff.
3. Immunfärbung
- Planen Sie die Bildgebung: Bestimmen Sie den primären Antikörper (oder die Antikörper) und die Kombination von fluoreszierend konjugierten sekundären Antikörpern, um zueinander zu passen und die Laserlinien des Fluoreszenzmikroskops anzupassen.
- Blockieren Sie die Probe, indem Sie sie über Nacht in ein Kryotube mit 6% (v /v) Eselserum - 3% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) eintauchen.
- Inkubieren Sie mit primären Antikörpern (oder Antikörpern) in 3% Eselserum in PBS für 24 h.
- Waschen Sie 5 mal für 1 h jedes Mal in 0,05% Tween 20 in PBS (PBST).
- Inkubieren Sie die Probe mit fluoreszierend konjugierten sekundären Antikörpern (oder Antikörpern) in 3% Eselserum in PBS für 24 h.
- Waschen Sie 5 mal für 1 Stunde in 0,05% (PBST). Warten Sie 1 h zwischen den einzelnen Wäschen.
- Entionisiertes Wasser hinzufügen und bei 4 °C vor direktem Licht geschützt lagern. An diesem Punkt ist das Gerüst bereit zum Abbild.
4. Bildgebung
- Legen Sie die Probe in eine Glasbodenschale und befeuchten Sie sie mit zwei Tröpfchen Speicherlösung (PBS oder entionisiertes Wasser).
- Bereiten Sie das Ziel vor. Wir empfehlen die Verwendung eines Wasserimmersionsobjektivs.
- Untersuchen Sie die Probe mit Fluoreszenzlicht.
- Wechseln Sie zur Computersteuerung. Schalten Sie Laser ein und passen Sie Laserintensität, Lochöffnung, Wellenlängen der Detektoren, Verstärkung, Auflösung und Zoom an. Legen Sie die Anzahl und Schrittweite für z-stack fest und beginnen Sie mit der Erfassung. Wir empfehlen die Verwendung von Multiphotonen-Laseranregung, um die Gewebepenetration zu erhöhen und lichtstreuung, Bleichmittel und Gewebeschäden zu minimieren.
5. Hämatoxylin-Eosin-Färbung
- Entfernen Sie 1 Lungenlappen von einer eingeschläferten Maus.
- In eine 10 mm x 10 mm x 5 mm große Kryomform geben und mit ca. 500 μL OCT-Compound bedecken.
- Auf Trockeneis (-70 °C) einfrieren und die Probe auf dieser Temperatur halten.
- Schneiden Sie einen dezellularisierten Lungenlappen aus einer verarbeiteten Maus gemäß Schritt 2.5 aus.
- In eine Kryomol mit der größten Oberfläche nach unten geben und mit OCT-Verbindung gemäß Schritt 5.2 bedecken.
- Auf Trockeneis (-70 °C) einfrieren und die Probe auf dieser Temperatur halten, bis etwas anderes erforderlich ist. Die Probe kann mindestens 12 Wochen gelagert werden.
- Schneiden Sie gefrorene Gewebeblöcke bei -20 °C in einem Kryostaten mit 5 μm Dicke und legen Sie Abschnitte auf Objektträger aus Glas und lagern Sie sie bei -80 °C.
- Bringen Sie die Folien auf Raumtemperatur, bis sie an der Luft getrocknet sind (ca. 20 min).
- Tauchen Sie kurz in PBS ein und fixieren Sie es, indem Sie die Objektträger 15 Minuten lang in 4% Paraformaldehyd in PBS tauchen. Einmal in PBS für 5 min waschen, dann zweimal in destilliertem Wasser für 5 min.
- 10 Min. in Mayers Hämatoxylinlösung eintauchen. Diese Zeit kann je nach Gewebequelle und Fleckenvorbereitung optimiert werden.
- In einem Coplin-Glas unter fließendem destilliertem Wasser für 10 Min. waschen.
- 7 Min. in Eosin-Lösung eintauchen. Diese Zeit kann je nach Gewebequelle und Fleckenvorbereitung optimiert werden.
- Tauchen Sie in 50% Ethanol, um überschüssiges Eosin zu entfernen und zu dehydrieren, indem Sie kurz in 70% Ethanol und in 96% und 100% Ethanol für 30 Sekunden eintauchen. Mehrmals in Xylol tauchen.
- Tragen Sie einige Tropfen DPX-Montagemedium auf und legen Sie einen Glasdeckglas auf.
- Lassen Sie die Folien über Nacht unter einer chemischen Haube trocknen.
- Scannen Sie Dias in einem Diascanner.
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Ergebnisse
Kardiopulmonale Dezellularisation
Nach erfolgreichem Abschluss des Protokolls werden Herz und Lunge sowie das Begleitgewebe wie der Aortenbogen frei von Zellen sein. Die Dezellularisation kann durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung (Abbildung 1) der ECM-Gerüste validiert werden, die die Entfernung der Kerne im Vergleich zum nativen Gewebe zeigen. Diese Gerüste behalten die Abmessungen frischer Organe bei und ihre unlösliche ECM-Struktur ist
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Diskussion
Dezellularisierungstechniken, die auf Gewebebewegung basieren, verändern die ECM-Struktur, wodurch sie für die ECM-Strukturanalyse ungeeignet sind4. Die Perfusionsdezellularisation unter Verwendung eines anatomischen Weges wie der Aorta der Luftröhre ermöglicht es, das Kapillarbett oder die terminalen Alveolen zu erreichen und erleichtert die Abgabe von Dezelluliermitteln im gesamten Organ. Die Verwendung von zwitterionischen, anionischen und nichtionischen Detergenzien zur Dezellularisierung von ...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Wir danken Prof. Ivana Novak und Dr. Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Universität Kopenhagen) für den Zugang zum Mikroskop. Diese Arbeit wurde vom Europäischen Forschungsrat unterstützt (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR und JTE); ein Promotionsstipendium der Lundbeck Foundation (R286-2018-621; MR); der Schwedische Forschungsrat (2017-03389; CDM); die Schwedische Krebsgesellschaft, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj und 190007; CDM); Deutsche Krebshilfe(dpa) RR); und die Dänische Krebsgesellschaft (R204-A12454; RR).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 Naht, Nadel mit dreieckigem Schnitt (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 Mikronaht (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson Pinzette | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson-Pinzette mit | Zähnen Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo Mikronadelhalter | Fine Science Tools | Nr. 12061-01 | |
| CO2 Beatmungskammer für Mäuse-Euthanasie | |||
| Deionisiertes Wasser (Milli-Q IQ 7000, Reinst-Laborwassersystem) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Einweg-Tablett aus Polystyrol (~30 > 50 cm) | |||
| Seziermikroskop (Greenough, mit zweiarmigem Schwanenhals) | Leica | S6 D | |
| Doppelendiger Mikroskopspatel | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont Mikropinzette (zwei) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont Mikrozange mit 45°; Spitzen (zwei) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Haarschneider | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey-Nadelhalter (mit Wolframkarbid-Backen) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenöser 24-Gauge-Katheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenöser 26-Gauge-Katheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo-Schere (harter Schnitt, gerade) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Mikrozange mit Ringspitzen (zwei) | Aesculap | FM571R | |
| Mikrofederschere (Vannas, gebogen) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Häutung Periostotom | Aesculap | D0543R | |
| Nadeln (27 Gauge; Mikrolanze) | BD | 21018 | |
| Papiertuch (steril) oder chirurgische Serviette | |||
| Zackenschere (CeramaCut, gerade) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatel (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Spritzen (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Spritzen (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Sehnenschere (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 Esel Anti-Meerschweinchen IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 Esel Anti-Kaninchen IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(Albumin-Rinderfraktion V, Standardqualität, lyophilisiert) | Serva | 11930.03 | |
| Kollagen IV polyklonaler Antikörper (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Wirt: Kaninchen |
| PBS (pH 7,4, 10&fach;, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Wirt: |
| polyklonaler Ziegen-Periostin-Antikörper (ein freundliches Geschenk von Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Wirt: Meerschweinchen | ||
| Skalpell Einweg mit Klinge Nr.11 (Stk. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normales Eselsserum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| strong>IMAGING | |||
| Detektoren (Hybrid-Detektor (Leica, HyD S-Modell) und Photomultiplier-Röhren (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluoreszenz-Lichtquelle | Leica | EL6000 | |
| Mikroskop (inverses Multiphotonenmikroskop) | Leica | SP5-X MP | |
| Objektiv (Lambdablau, 20&fach;, 0,70 numerische Apertur (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Zwei-Photonen-Ti– Saphirlaser (Spectra-Physik, Mai Tai DeepSee Modell) | |||
| Weißlichtlaser (WLL) | Leica | ||
| DEZELLULARISIERUNG | |||
| 70% Ethanol (absoluter Alkoholgehalt 99,9%); absoluter Alkoholgehalt muss mit deionisiertem Wasser auf 70% (vol/vol) eingestellt werden | Pflaumen | 1680766 | |
| deionisiertes Wasser (Milli-Q IQ 7000, Reinstwassersystem für Labor) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-zu-Schlauch-Verschraubungen (1/8 Zoll) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7,4, 10-fach, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Schlauchpumpe (mit 12 Kanälen) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silikonschlauch (mit 2 mm Innendurchmesser und 4 mm Außendurchmesser) | Ole Dich | 31399 | |
| Natriumazid | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Natriumdesoxycholat (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Natriumdodecylsulfat | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H& E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute | ethanol Plum | 201152-1L | |
| Deckgläser (24x50mm; 1000 Stück) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 Stück) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Kryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX Eindeckmedium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y Lösung alkoholisch 0,5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather Mikrotomklinge Edelstahl, C35 (50 Stück) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Objektträger (25 x 75 mm; 144 Stück) | Thermofisher | ||
| Mayers Hämatoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT Verbindung | VWR | 361603E | |
| Objektträger (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylol | Sigma | 534056-4L |
Referenzen
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
