Beurteilung der kardialen Reprogrammierung mit High-Content-Bildgebungsanalyse

Summary

Wir stellen ein Protokoll zur Quantifizierung direkt reprogrammierter induzierter Kardiomyozyten-ähnlicher Zellen (iCMs) in vitro unter Verwendung von High-Content-Bildgebungsanalysen vor. Diese Methode ermöglicht es uns, die Effizienz der kardialen Reprogrammierung automatisiert zu quantifizieren und iCMs direkt zu visualisieren.

Abstract

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode zur Quantifizierung von induzierten Kardiomyozyten-ähnlichen Zellen (iCMs) zu beschreiben, die in vitro durch eine Reprogrammierungstechnik direkt umprogrammiert werden. Die kardiale Reprogrammierung bietet eine Strategie zur Generierung neuer Kardiomyozyten. Durch die Einführung von kardiogenen Transkriptionsfaktoren in Fibroblasten; Fibroblasten können ohne Übergang durch den pluripotenten Stammzellzustand in iCMs umgewandelt werden. Die Umwandlungsrate von Fibroblasten in iCMs ist jedoch nach wie vor gering. Dementsprechend gibt es zahlreiche zusätzliche Ansätze, um die Effizienz der kardialen Reprogrammierung zu verbessern. Die meisten dieser Studien untersuchten die Effizienz der kardialen Reprogrammierung mittels Durchflusszytometrie, während gleichzeitig Immunzytochemie zur Visualisierung von iCMs durchgeführt wurde. Daher sind mindestens zwei separate Reihen von Reprogrammierungsexperimenten erforderlich, um den Erfolg der iCM-Reprogrammierung zu demonstrieren. Im Gegensatz dazu ermöglicht die automatisierte High-Content-Imaging-Analyse sowohl die Quantifizierung als auch die Qualifizierung der iCM-Reprogrammierung mit einer relativ kleinen Anzahl von Zellen. Mit dieser Methode ist es möglich, die Quantität und Qualität von iCMs mit einem einzigen Reprogrammierungsexperiment direkt zu beurteilen. Dieser Ansatz wird in der Lage sein, zukünftige kardiale Reprogrammierungsstudien zu erleichtern, die groß angelegte Reprogrammierungsexperimente erfordern, wie z. B. das Screening genetischer oder pharmakologischer Faktoren zur Steigerung der Reprogrammierungseffizienz. Darüber hinaus ist die Anwendung des High-Content-Imaging-Analyseprotokolls nicht auf die kardiale Reprogrammierung beschränkt. Es kann sowohl für die Reprogrammierung anderer Zelllinien als auch für Immunfärbeexperimente eingesetzt werden, die sowohl die Quantifizierung als auch die Visualisierung von immungefärbten Zellen erfordern.

Introduction

Die kardiale Reprogrammierung wurde als alternativer Ansatz zu stammzellvermittelten Ansätzen zur Erzeugung neuer Kardiomyozyten entwickelt. Da es nicht durch den Stammzellzustand übergeht, hat es ein hohes Potenzial, einige vererbte Einschränkungen bei stammzellvermittelten Ansätzen zu umgehen. Es wurde gezeigt, dass eine Virusinfektion von mindestens drei oder vier kardiogenen Transkriptionsfaktoren in Fibroblasten Fibroblasten in ein kardiales Schicksal umwandeln kann, indem Fibroblasten-Genprogramme eliminiert und kardiogene Transkriptionsnetzwerke in den Fibroblasten 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10

Protocol

Alle Eingriffe an den Tieren wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee des Vanderbilt University Medical Center durchgeführt.

1. Retrovirusgenerierung und kardiale In-vitro-Reprogrammierung

1. Kultur von Platin-E-Zellen in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 μg/ml Puromycin und 10 μg/ml Blasticidin, bis die Konfluenz der Platin-E-Zellen 70 % bis 80 % erreicht.
2. An Tag 1 werden ~0,55 x 10⁶ Zellen (erste Vertiefung) und ~0,18 x 10⁶ Zellen (zweite Vertiefung) in zwei separate Vertiefungen mit einer 12-Well-Platte mit 1 ....

Results

Nach Reprogrammierungsexperimenten haben wir iCMs mit Hilfe der High-Content-Imaging-Analyse, wie oben beschrieben, quantifiziert. In Abbildung 1 sind zusammengesetzte Bilder von 36 Bildgebungsstellen dargestellt, die für die High-Content-Bildgebungsanalyse verwendet wurden. iCMs werden in diesen Experimenten als doppelt-positive Zellen (α-Actinin⁺Titin-eGFP⁺) definiert. High-Content-Imaging-Analysen zeigen, dass ~26% der Zellen nach M-G-T-H-Transduktion beide kardialen.......

Discussion

In den vorangegangenen Reprogrammierungsstudien wurde die Reprogrammierungseffizienz mittels Durchflusszytometrie untersucht und die strukturelle Qualität von iCMs mittels Immunzytochemie in zwei separaten Experimenten nachgewiesen. Die Durchflusszytometrie-Analyse erfordert eine viel größere Anzahl von Startzellen, wodurch der Umfang der Experimente erhöht wird. Im Gegensatz dazu kann die High-Content-Imaging-Analyse sowohl die Qualität als auch die Quantität der iCM-Reprogrammierung du.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01	Tocris	2939
Anti-Hühner-Antikörper Alexa 488	Thermofisher	A11039
Anti-GFP-Antikörper	Invitrogen	A10262
Anti-Maus Alexa 555	Thermofisher	A21422
Anti-Α-Aktinin-Antikörper	Sigma	A7811
DAPI-Lösung	Vector Labs	H1200
Fugene 6	Promega	E2691
Insulin-Transferrin-SelenG Nahrungsergänzungsmittel	Invitrogen	41400-045
Medium 199	Invitrogen	11150059
MEM Vitaminlösung	Invitrogen	11120-052
MetaXpress Software	Molekulares Gerät
Micro XL automatisiertes Zellbildgebungssystem	Molekulares Gerät
Minimal essentielle Aminosäurelösung	Sigma	M7145
Opti-MEM	Gibco	31905-070
PES-Filter (0,45 &Mikro; m)	Thomas scientific	1159T84
Platninum E-Zellen	Cell Biolabs	RV-101
Polybrene	Sigma	H9268
SB431542	Sigma	S4317
Universeller Blockierungspuffer	BiogeneX	HK083-50K