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Methodenartikel

Untersuchung der Proteindynamik mittels Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie

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DOI:

10.3791/61862

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13. April 2022

1NSD, Oak Ridge National Laboratory

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung der Struktur und Dynamik von zwei Modellproteinen, die eine wichtige Rolle für die menschliche Gesundheit spielen. Die Technik kombiniert die biophysikalische Charakterisierung auf dem Labortisch mit der Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie, um auf die Dynamik auf Zeit- und Längenskalen zuzugreifen, die für Proteininterdomänenbewegungen relevant sind.

Zusammenfassung

Die Aktivität und Funktionalität der meisten menschlichen Körperproteine hängt mit Konfigurationsänderungen ganzer Subdomänen innerhalb der Proteinkristallstruktur zusammen. Die Kristallstrukturen bilden die Grundlage für jede Berechnung, die die Struktur oder Dynamik eines Proteins beschreibt, meist mit starken geometrischen Einschränkungen. Diese Einschränkungen aus der Kristallstruktur sind jedoch in der Lösung nicht vorhanden. Die Struktur der Proteine in der Lösung kann sich vom Kristall aufgrund von Umlagerungen von Schleifen oder Subdomänen auf der Pico-Nanosekunden-Zeitskala (d. h. dem internen Proteindynamik-Zeitregime) unterscheiden. Die vorliegende Arbeit beschreibt, wie Zeitlupe auf Zeitskalen von mehreren zehn Nanosekunden mittels Neutronenstreuung erreicht werden kann. Insbesondere die dynamische Charakterisierung von zwei großen menschlichen Proteinen, einem intrinsisch ungeordneten Protein, dem eine klar definierte Sekundärstruktur fehlt, und einem klassischen Antikörperprotein, wird durch Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie (NSE) in Kombination mit einer breiten Palette von Laborcharakterisierungsmethoden behandelt. Weitere Einblicke in die Dynamik der Proteindomäne wurden mithilfe mathematischer Modellierung erzielt, um die experimentellen Neutronendaten zu beschreiben und die Überschneidung zwischen kombinierten diffusiven und internen Proteinbewegungen zu bestimmen. Die Extraktion des internen dynamischen Beitrags zur aus NSE erhaltenen Zwischenstreufunktion, einschließlich der Zeitskala der verschiedenen Bewegungen, ermöglicht einen weiteren Einblick in die mechanischen Eigenschaften einzelner Proteine und die Weichheit von Proteinen in ihrer fast natürlichen Umgebung in der überfüllten Proteinlösung.

Einleitung

Sondierung der Dynamik weicher Materie mit Neutronen
Die Untersuchung der dynamischen Eigenschaften von Proteinen und Peptiden ist ein wichtiger Teil der biophysikalischen Forschung, und es gibt heute viele gut entwickelte Methoden, um Zugang zu einer Vielzahl von Energielandschaften zu erhalten1. Die experimentell aufgedeckte Dynamik der Proteine mit ihrer biologischen Funktion in Beziehung zu setzen, ist eine weitaus schwierigere Aufgabe, die komplexe mathematische Modelle und computergestützte Dynamiksimulationen erfordert. Die Bedeutung der Neutronenspektroskopie für die Analyse von Proteinbewegungen wurde in mehreren gut aufgenommenen und weithin anerkannten Studienhervorgehoben 1,2,3,4,5. Bevor die vielfältige Energielandschaft der internen Proteindynamik erforscht wird, ist ein kurzer Überblick über die dynamischen Prozesse in weicher Materie erforderlich und wie Neutronen auf sie zugreifen können.

Die Empfindlichkeit von Neutronen gegenüber der Isotopenkonfiguration und die Art der Wechselwirkungen, die sie mit weicher Materie zeigen, macht die Neutronenstreuung zu einer der vielseitigsten Untersuchungstechniken6. Es gibt ein breites Spektrum von Korrelationslängenskalen und Korrelationszeiten, auf die Neutronen zugreifen können, von nuklearen Anregungen und atomaren Schwingungen bis hin zu kollektiven Bewegungen und langsamen Relaxationsprozessen wie isotropen Rotationen und diffusiven Bewegungen. Bei der Untersuchung der gestreuten Neutronen für ihren Energietransfer können drei Hauptwechselwirkungen unterschieden werden: die elastische Streuung, bei der kein Energieaustausch zwischen einfallendem Neutron und Teilchen in der Probe stattfindet; die inelastische Streuung mit einem großen, quantifizierbaren Energieaustausch zwischen Neutron und Teilchen; und der eigentümliche Fall der quasi-elastischen Streuung, der einen sehr kleinen Energietransfer im Vergleich zur einfallenden Neutronenenergie 1,7 bezeichnet. Diese Wechselwirkungen geben präzise Aufschluss über das untersuchte Material und bilden die theoretische Grundlage verschiedenster Neutronenstreutechniken.

Bei der elastischen Streuung zeichnet der Detektor die Richtungen der Neutronen als Beugungsmuster auf, das die Position der Probenatome relativ zueinander zeigt. Es werden Informationen über die Korrelationen atomarer Positionen gewonnen (d.h. integrierte Intensität S(Q) bezüglich der Impulsübertragung Q, die sich nur auf strukturelle Informationen bezieht). Dieses Prinzip bildet die Grundlage der Neutronenbeugung8.

Komplexität entsteht, wenn die Energieübertragung aufgrund von Anregungen und internen Schwankungen im Probenmaterial nicht mehr Null ist. Dies bildet die Grundlage der Neutronenspektroskopie, bei der die gestreuten Neutronen sowohl als Funktion des Energietransfers E als auch des Impulstransfers Q untersucht werden. Es werden dynamische und strukturelle Informationen gewonnen. Die Neutronenspektroskopie misst die gleiche integrierte Intensität S(Q) für den Energietransfer (d.h. Geschwindigkeitsänderung der Neutronen aufgrund der Probenstreuung, S(Q,ω) = S(Q, E), die auch als dynamischer Strukturfaktor bezeichnet wird)9.

Zur Berechnung der Streuung aus einem Material ist es sinnvoller, die Paarkorrelationsfunktion 7,10 zu verwenden. Im Beugungsfall gibt die statische Paarkorrelationsfunktion G(r) die Wahrscheinlichkeit an, den Mittelpunkt eines Teilchens in einem gegebenen Abstand r vom Zentrum eines anderen Teilchens zu finden. Die Spektroskopie verallgemeinert die statische Paarkorrelationsfunktion und bezieht Energie/Frequenz/Zeit in die Streugleichung mit ein. Die Paarkorrelationsfunktion G(r) wird zu einer Funktion der Zeit G(r, t), die in eine ausgeprägte Atompaarkorrelationsfunktion G D(r, t) und eine Selbstkorrelationsfunktion GS(r, t) zerlegt werden kann. Diese beschreiben zwei Arten von Korrelationen: paarkorrelierte Bewegungen von Atomen, die die kohärente Streuung steuern, und Selbstkorrelation, die die inkohärente Streuungsteuert 10.

Kohärente Streuung ist die Streuung vom "Durchschnitt" und hängt von der relativen Phase der gestreuten Wellen ab. Im Kleinwinkelstreuregime interferieren die gestreuten Neutronenwellen aus verschiedenen Streuzentren (verschiedene Atome) konstruktiv (haben ähnliche Phasen), und die kollektive Bewegung der Atome wird mit starker Intensitätsverstärkung beobachtet. Die kohärente Streuung beschreibt im Wesentlichen die Streuung eines einzelnen Neutrons aus allen Kernen in der Probe10.

Wenn keine konstruktive Interferenz zwischen den gestreuten Neutronenwellen aus verschiedenen Zentren auftritt, wird ein einzelnes Atom zeitlich verfolgt und die Selbstkorrelation zwischen der Position des Atoms zum Zeitpunkt t = 0 und demselben Atom zum Zeitpunkt t beobachtet. Somit geht die Information über die relativen Positionen von Atomen verloren, und der Fokus liegt nur auf lokalen Fluktuationen. Die Streuung aus lokalen Schwankungen steuert die inkohärente Streuung. Inkohärente Streuung ist isotrop, trägt zum Hintergrundsignal bei und verschlechtert das Signal-Rauschen10,11.

Wenn wir alle oben genannten Punkte kombinieren, unterscheiden wir vier Hauptneutronenstreuprozesse10: (1) elastisch kohärent (misst die Korrelationen atomarer Positionen), (2) inelastisch kohärent (misst kollektive Bewegungen von Atomen), (3) elastisch inkohärent (trägt zum Hintergrund bei, reduziert die Streuintensität durch den Debye-Waller-Faktor (DWF) und misst den elastischen inkohärenten Strukturfaktor (EISF), der die Geometrie diffusiver Bewegungen in begrenzter Geometrie beschreibt, und (4) inelastisch inkohärent (misst die Dynamik einzelner Atome und die Selbstkorrelation).

Dynamische Prozesse, auf die Neutronen in der Biologie zugreifen können, reichen von der Dämpfung niederfrequenter atomarer und molekularer Schwingungen, der Wechselwirkung von Lösungsmittelmolekülen mit Biooberflächen und Diffusionsprozessen in der Hydratationsschicht von Makromolekülen und begrenzter Geometrie bis hin zu kurzreichweitigen translationalen, rotationalen und taumelnden diffusiven Bewegungen sowie Proteindomänen und allosterischen Bewegungen1 . Die große Vielfalt an Neutronenmethoden und -instrumenten zur Messung der Proteindynamik basiert darauf, wie die Achromatisierung des einfallenden oder ausgehenden Neutronenstrahls erreicht wird und wie die Energieanalyse der gestreuten Neutronen durchgeführt wird. Von Dreiachsen- bis hin zu Flugzeit-, Rückstreu- und Spin-Echo-Spektrometern kann man dynamische Prozesse mit charakteristischen Zeiten zwischen 1 x 10-14 s und 1 x 10-6 s (Femtosekunden bis Mikrosekunden) untersuchen12.

Das Oak Ridge National Laboratory verfügt mit seinen beiden renommierten Neutronenquellen, der Spallation Neutron Source - SNS13 und dem High Isotope Flux Reactor - HFIR14, über eine der besten Suiten von Spektrometern zur Untersuchung der Dynamik in Biomaterialien. Einige der eloquentesten Beispiele sind die Verwendung des Kaltneutronen-Chopper-Spektrometers (CNCS) bei SNS15, um die dynamische Störung von Hydratationswasser um grün fluoreszierendes Protein in Lösung16 oder die kollektiven Schwingungen mehrerer Proteine17 unter Pikosekunden zu untersuchen. Ein wiederkehrendes Problem der Untersuchungen der inelastischen Neutronenstreuung ist, dass einige biologische Prozesse zu langsam sind, um beobachtet zu werden. Ohne extreme Setups, die zu einem enormen Verlust der Neutronenintensität führen, sind Time-of-Flight-Spektrometer auf eine Energieauflösung von 10 μeV begrenzt, was einer maximalen Zeitskala von ~200 ps10,11 entspricht. Dies reicht nicht aus, um großräumige Bewegungen in Proteinen zu beobachten. Daher werden häufig Instrumente mit höherer Energieauflösung wie die Rückstreuspektrometer benötigt. Die Kombination der Flugzeit- und Rückstreutechniken hat sich als leistungsfähig erwiesen, um die Veränderung der internen Dynamik von Cytochrom P450cam (CYP101) zu untersuchen, einem Enzym, das den Hydroxylierungskampfer18 katalysiert.

Die mikroskopische Diffusivität, die mit dem Rückstreuspektrometer an SNS-BASIS19 gemessen wurde, war überraschend gut definiert und konnte in die Diffusivität von Wasser (Hydratation, zytoplasmatisches und massenartiges Wasser) und die Diffusivität von Zellbestandteilen in planarischen Plattwürmern, dem ersten lebenden Tier, das durch Neutronenstreuunguntersucht wurde 20, getrennt werden. . Die Rückstreuung ist eine hochauflösende spektroskopische Technik, die aber auch auf mehrere μeV = mehrere Nanosekunden begrenzt ist, während sich die langsame Dynamik in Biomaterialien auch als Überlebenszeit der Korrelation zwischen atomaren Positionen oder Spinorientierungen manifestiert (z. B. Relaxationsprozesse, die regelmäßig im Zeitbereich von zehn bis Hunderten von Nanosekunden auftreten).

Die Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie (NSE) ist die einzige Neutronenstreutechnik, die eine so hohe Auflösung erreicht. Im Gegensatz zu anderen Neutronentechniken erfordert NSE keine Achromatisierung des Strahls, da es die quantenmechanische Phase der Neutronen verwendet, die ihre magnetischen Momente sind. Die Manipulation magnetischer Momente ermöglicht die Verwendung einer breiten Wellenlängenverteilung des Neutronenstrahls, während die Technik empfindlich auf sehr kleine Neutronengeschwindigkeitsänderungen in der Größenordnung von 1 x 10-4 reagiert. NSE wurde erfolgreich eingesetzt, um die langsame Dynamik von Proteinen in Lösung für viele Proteine zu untersuchen. Unter diesen vielen Pionierstudien erkennen wir die Untersuchung der segmentalen Flexibilität von Schweineimmunglobulin21 an; die gekoppelten Domänenbewegungen in Taq-Polymerase22; die Domänenbewegungen im Tetramer der Hefealkoholdehydrogenase23; die Änderung der Konformation in der Phosphoglyceratkinase bei Substratbindung3; die Aktivierung von Domänenbewegungen und die dynamische Ausbreitung allosterischer Signale im Na+/H+-Exchange Regulatory Cofactor 1 (NHERF1)-Protein4,24,25; die Dynamik eines kompakten Zustands der Quecksilberionenreduktase26; und die Diffusion von Hämoglobin in roten Blutkörperchen27. Zwei neuere Studien zur Proteindynamik haben die Flexibilität des humanen Antikörpers Immunglobulin G (IgG) als entropisches Frühjahr28 und die Eigenschaften des Lösungsmittelbeitrags zur Dynamik des intrinsisch ungeordneten Myelin-Basisproteins (MBP)5 aufgedeckt.

Der vorliegende Artikel erklärt die Grundprinzipien von NSE, die vielfältigen vorbereitenden Methoden, die für eine gründliche Untersuchung der Proteindynamik empfohlen werden, sowie die Methodik und das experimentelle Protokoll für die NSE-Datenerfassung am NSE-Spektrometer an der SNS, SNS-NSE. Das Protokoll charakterisiert zwei Proteine: IgG, ein normales menschliches Antikörperprotein, und das intrinsisch ungeordnete Protein MBP. Die biophysikalischen Implikationen, die Forschungsrelevanz der Beispiele und die Grenzen der Technik werden kurz diskutiert.

NSE-Spektroskopie, die Methode zur Messung der langsamen Dynamik
NSE ist eine polarisierte Technik, die die Neutronenflugzeit verwendet, um den Energieaustausch (Polarisationsverlust) aufgrund der quasi-elastischen Wechselwirkung zwischen Neutronen und Atomen in einer Probe zu messen. Im Kern der NSE-Spektroskopie liegen zwei Grundprinzipien: (1) die Fähigkeit des Neutronenspins, im Magnetfeld mit einer Frequenz proportional zur magnetischen Stärke figure-introduction-1zu präzessieren, nämlich der Larmorfrequenz29, und (b) das Spin-Echo oder Hann-Echo, das die Manipulation und Neufokussierung des Polarisationssignals bei Anlegen einer Reihe von Hochfrequenzimpulsen30 darstellt.

Die Grundlagen des NSE-Prozesses können in einigen einfachen Schritten 6,11 mithilfe von Abbildung 1 zusammengefasst werden. (1) Der von der Quelle erzeugte Neutronenstrahl (Position 1) wird polarisiert (Position 2), geführt und transportiert (Position 3) und erreicht den Eingang des NSE-Spektrometers, wo er vom ersten Pi-Halb-Flipper um 90° gedreht wird (Position 4). (2) Der polarisierte Strahl (z. B. neutronenmagnetische Momente) wird senkrecht zu den Magnetfeldlinien des ersten Magneten (erste Präzessionszone, Position 5) und beginnt zu präzessieren. (3) Am Ende des Magneten akkumulieren Neutronenspins einen bestimmten Präzessionswinkel, der proportional zur magnetischen Feldstärke und der im Inneren verbrachten Flugzeit ist (im Wesentlichen umgekehrt proportional zur Neutronengeschwindigkeit). Die einzelnen Neutronengeschwindigkeiten werden innerhalb ihres Präzessionswinkels am Ende der ersten Präzessionszone kodiert. (4) In der Nähe der Stichprobenposition kehrt der Pi-Flipper (Position 6) die Ausrichtung des Spins um 180° um und ändert das Vorzeichen des Präzessionswinkels. (5) Die Neutronen interagieren mit den Molekülen der Probe (Position 7) und werden gestreut. (6) Die gestreuten Neutronen treten in die zweite Präzessionszone (Position 8) ein und treten in sie vor, werden aber umgekehrt. (7) Ein weiterer Pi-Halb-Flipper (Position 9) wird verwendet, um die Ausrichtung des Spins von senkrecht zur horizontalen Richtung zu drehen. Dadurch wird die Präzession gestoppt, wodurch der Präzessionswinkel φ in eine Polarisation proportional zu cos(φ) übersetzt wird. (8) Der Analysator (Position 10) wählt die Neutronen anhand einer Orientierung aus. Wenn die Wechselwirkung mit der Probe elastisch ist, ändert sich die Geschwindigkeit des Neutrons nicht. Die Neutronen verbringen eine identische Menge an Zeit damit, in der ersten und zweiten Präzessionszone zu fliegen, und die akkumulierten Präzessionswinkel werden vollständig zurückgewonnen. Die volle Polarisation wird auf dem Detektor (Position 11) als Echo der ursprünglichen Polarisation (d.h. Spin-Echo) wiederhergestellt. (9) Bei NSE ist die Streuung jedoch quasi-elastisch, so dass ein kleiner Energieaustausch zwischen Neutronen und Probenmolekülen nach der Streuung durch die Probe zu unterschiedlichen Neutronengeschwindigkeiten führt. Aufgrund der unterschiedlichen Geschwindigkeiten werden die Neutronen eine zusätzliche Zeit damit verbringen, durch die zweite Präzessionszone zu fliegen und ihren Präzessionswinkel nicht richtig wiedererlangt zu haben. Eine partielle Polarisation wird auf dem Detektor abgerufen, und der Verlust der Polarisation aufgrund der Spinrelaxation ist proportional zur cos-Fourier-Transformation der Spektralfunktion S(Q, ω), der Zwischenstreufunktion F(Q, t). (10) Der Zeitparameter der Funktion F(Q, t) ist proportional zur Präzessionsmagnetfeldstärke. Die Abtastung des Polarisationsverlustes in Abhängigkeit von der magnetischen Feldstärke ergibt daher eine Relaxationsfunktion, die von den dynamischen Prozessen innerhalb der Probe abhängt.

figure-introduction-2
Abbildung 1: Aufnahme des NSE-Spektrometers am SNS (SNS-NSE) und Neutronenflugbahnschema mit den wichtigsten Funktionskomponenten. Von rechts nach links: 1 = Neutronenquelle; 2 = Chopper-Bender-Polarizer-Sekundärverschlusssystem; 3 = Leitfäden für den Strahltransport; 4 = Pi/2 Flipper für erste 90° Drehung; 5 = erste Präzessionszone; 6 = Pi-Flipper für 180° Drehung; 7 = Probenfläche und Probenumgebung (hier ist der Kryoofen dargestellt); 8 = zweite Präzessionszone; 9 = Pi/2 Flipper für zweite 90° Drehung; 10 = Analysator; 11 = Detektor. (Beachten Sie, dass sich Teile von 3 sowie 2 und 1 hinter der blauen Wand in der Abschirmung befinden; die Chopper werden durch einen Geschwindigkeitswähler für reaktorbasierte NSE ersetzt.) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Protokoll

Die vorliegende Arbeit charakterisiert zwei Proteine: ein normales humanes Antikörperprotein IgG und das intrinsisch ungeordnete MBP. Die lyophilisierte Form der Proteine wurde aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Vorbereitung der Proteinprobe

  1. Es wird ein 50 mM Natriumphosphat + 0,1 M NaCl-Puffer hergestellt, indem die jeweiligen festen Reagenzien in schwerem Wasser (D2O) gewogen und gelöst werden (siehe Materialtabelle). Dies ist das deuterierte Pufferlösungsmittel für IgG.
    1. Stellen Sie den pH-Wert der Pufferlösung auf 6,6 ein.
  2. Es wird ein 20 mM Natriumphosphat + 6 M Harnstoffpuffer hergestellt, indem die jeweiligen festen Komponenten in schwerem Wasser (D2O)gewogen und gelöst werden. Dies ist das deuterierte Pufferlösungsmittel für MBP.
    1. Stellen Sie den pH-Wert der Pufferlösung auf 4,7 ein.
  3. Filtern Sie die Pufferlösungsmittel mit 0,2 μm Porengrößenfiltern (siehe Materialtabelle).
  4. Die gereinigten proteinlyophilisierten Pulver werden in den deuterierten Lösungsmitteln für die jeweiligen Proteine (Schritte 1.1.-1.2.) bei hoher Proteinkonzentration (~50 mg/ml) gewogen und gelöst.
  5. Laden Sie die Proteinlösung in Dialysekörbe mit Dialysemembranen von 3,5 K MWCO und dialysieren Sie gegen den gefilterten Puffer für 24 h bei 10 °C für MBP und 25 °C für IgG (siehe Materialtabelle), indem Sie die Röhrchen leicht schütteln, um einen Diffusionsgradienten zu erzeugen.
  6. Verdünnen Sie die Proteinlösung mit dem Dialysepuffer in einer Reihe von Konzentrationen: 1, 2, 5, 10 und 50 mg / ml.
  7. Bestimmen Sie die genauen Konzentrationen mit einem Nanodrop-Spektralphotometer (siehe Materialtabelle).

2. Vorläufige Probencharakterisierung durch dynamische Lichtstreuung (DLS)

  1. Laden Sie 80 μL jeder Proteinlösung aus der oben vorbereiteten Konzentrationsreihe (Schritt 1.6.) in die DLS-Einwegzelle (siehe Materialtabelle) und bestimmen Sie die Diffusionskoeffizienten, wobei der Durchschnitt über 10 Akquisitionen beträgt.
  2. Zeichnen Sie die translationalen Diffusionskoeffizienten als Funktion der Proteinkonzentration auf und extrapolieren Sie auf Nullkonzentration.
  3. Laden Sie jede Proteinlösung aus der Konzentrationsreihe in die Kapillarröhrchen eines Viskosimeters (siehe Materialtabelle) und messen Sie die dynamische Viskosität.
  4. Zeichnen Sie die gemessenen dynamischen Viskositäten in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration auf und extrapolieren Sie auf die Konzentration Null.
    HINWEIS: Die Extrapolation der DLS-Diffusion auf die Nullkonzentration ergibt den Wert der translationalen Diffusion für ein einzelnes Protein. Die Extrapolation der dynamischen Viskosität auf die Nullkonzentration muss den experimentell für die Pufferlösung gemessenen dynamischen Viskositätswert ergeben.

3. Sammlung der Kleinwinkelstreuung (Neutron oder Röntgen)

  1. Messung der Kleinwinkel-Neutronenstreuung (SANS) und/oder der kleinwinkligen Röntgenstreuung (SAXS) (siehe Materialtabelle) an vier Proteinkonzentrationen, vorzugsweise 2 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml und 50 mg/ml.
  2. Normalisieren Sie SANS- und SAXS-Spektren durch Proteinkonzentration.
  3. Passen Sie den Proteinformfaktor P(Q) mithilfe der Ensemble-Optimierung31 und/oder der SasView32-Software an die SANS- und SAXS-Spektren an.
  4. Berechnen Sie den Strukturfaktor S(Q, c), indem Sie das SANS- und SAXS-Signal für jede Konzentration durch P(Q) dividieren.
    HINWEIS: Leser, die daran interessiert sind, Kleinwinkelstreudaten als Unterstützung für NSE-Messungen zu messen und zu interpretieren, werden gebeten, die Referenzen 23,28,31,32,33 gründlich zu konsultieren.

4. Messung von NSE

  1. Richten Sie sich für das Experiment ein und mounten Sie das Beispiel mit den folgenden Schritten.
    1. Wählen Sie die Dicke der Zelle für die Probenbeladung basierend auf der Konzentration der Proteinlösung, der für die Messung erforderlichen Temperatur und der verfügbaren Lösungsmenge.
      HINWEIS: In dieser Studie wurden transparente Toplader-Quarzbehälter von 40 mm x 30 mm x 4 mm verwendet.
    2. Reinigen Sie die Zelle wiederholt, abwechselnd zwischen phosphatfreiem Geschirrspülmittel (siehe Materialtabelle), entionisiertem Wasser und 70% Ethanol.
    3. Trocknen Sie die Zelle im Konvektionsofen; 80 °C für die Quarzzellen nicht überschreiten.
    4. Laden Sie 4 ml Proteinlösung in die Zelle und schließen Sie sie mit Kappen. Verwenden Sie Wachsfolie oder ein anderes Dichtungsmittel (siehe Materialtabelle), um die Probenzellen zu versiegeln.
      HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurden 4,8 ml Lösung bei ~50 mg/ml verwendet, um eine ausreichende Streuintensität zu erhalten.
    5. Laden Sie 4 ml Dialysepuffer in einen identischen Behälter wie die Proteinprobe und versiegeln Sie ihn.
    6. Transportieren Sie Proben zur Beamline, schließen Sie den Verschluss und betreten Sie den Spektrometer-Höhlenbereich34.
    7. Montieren Sie die Probenzelle auf dem Aluminium-Probenhalter, indem Sie die Schrauben und die Halteplatten anziehen (Abbildung 2, linke Seite).
      HINWEIS: Man kann zwei Probenzellen gleichzeitig montieren, da für alle Proben das gleiche Messprotokoll benötigt wird.
    8. Montieren Sie die Graphitprobe und/oder die Al2O3 Pulverprobe in einem identischen Behälter wie die Proteinprobe. Dies sind Standards, die von der SNS-NSE-Beamline-Unterstützung bereitgestellt werden.
    9. Platzieren Sie den Probenhalter, indem Sie ihn vorsichtig in die Dose des Temperaturantriebssystems (TFS, siehe Materialtabelle) schieben.
      HINWEIS: TFS ist die am häufigsten verwendete Probenumgebung bei SNS-NSE und pumpt trockene Luft in den Probenbehälter, um die gewünschte Temperatur zu erreichen (Abbildung 2, mittlere und rechte Abbildung).
    10. Schließen Sie den TFS-Deckel und stellen Sie die Temperatur auf den gewünschten Wert ein, indem Sie auf den interaktiven Bildschirm des TFS zugreifen.
    11. Montieren Sie die Neutronenkamera (siehe Materialtabelle) für die Ausrichtung der Proben am Strahl.
    12. Kehren Sie das Instrumentengehäuse auf, evakuieren Sie, schließen Sie die Türen und öffnen Sie den Balkenverschluss.
      HINWEIS: Probenzellen werden von der SNS-NSE-Beamline-Unterstützung bereitgestellt. Die verfügbaren Beispielzellen und die Beispielumgebungsbibliothek finden Sie auf der SNS-NSE-Beamline-Webseite 7,35.
  2. Sammeln Sie die NSE-Daten mit den folgenden Schritten.
    1. Richten Sie die Probe im Neutronenstrahl mit der Neutronenkamera und den vier unabhängigen Probenöffnungen aus.
    2. Öffnen Sie die SNS-NSE-Datenerfassungssoftware36 und sammeln Sie Stichprobenstatistiken, indem Sie Beugungsscans für die gewünschten Streuwinkel und Wellenlängen ausführen.
    3. Richten Sie die Messparameter basierend auf den für jede Probe gesammelten Statistiken ein, indem Sie die Messmakros bearbeiten, die vom assistierenden Instrumentenwissenschaftler bereitgestellt werden.
    4. Starten Sie den Scan, indem Sie den Protokollnamen an der Eingabeaufforderung eingeben, und erfassen Sie Echos für das Beispiel.
    5. Beginnen Sie mit dem Scannen und erfassen Sie Echos auch für die elastische Referenz und das gepufferte Lösungsmittel. Führen Sie für den Probenwechsel einen intermittierenden Strahlverschlussbetrieb durch.

figure-protocol-1
Abbildung 2: NSE-Messsystem. Linkes Feld: Proteinlösungsproben in Quarzbehältern, die mit Schrauben und Platten auf dem Aluminium (Al) -Probenhalter montiert sind. Der Al-Probenhalter bietet die Möglichkeit, zwei Proben gleichzeitig in der Probenumgebung zu montieren. Mittleres Feld: Die Probe des Temperaturantriebssystems (TFS) kann auf der Probenstufe montiert werden, das Neutronenstrahlfenster befindet sich auf der rechten Seite, während die für die Ausrichtung verwendete Neutronenkamera auf der linken Seite sichtbar ist. Rechte Platte: Wenn Sie den Probenhalter mit zwei Proben in die Probe legen, können Sie mit Siliziumfenstern (Si) arbeiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

5. NSE-Datenreduktion

HINWEIS: SNS-NSE ist mit einer speziellen Software namens DrSpine (Datenreduktion für Spin-Echo)37,38 ausgestattet, die auf dem ORNL Neutron Sciences Remote Analysis Cluster, einem Quick User Guide und integriertem Hilfe-Support verfügbar ist.

  1. Melden Sie sich mit den ORNL-Benutzeranmeldeinformationen beim Neutron Sciences Remote Analysis Cluster (siehe Tabelle der Materialien) an und klicken Sie auf die Schaltfläche Sitzung starten .
  2. Richten Sie die Datenreduktionssoftware mit den folgenden Schritten ein.
    1. Öffnen Sie im Benutzerverzeichnis ein Terminalfenster und geben Sie Folgendes ein: source/SNS/software/nse/etc/setup_nse.sh.
    2. Geben Sie als Nächstes Folgendes ein: drspine_create_env.sh.
  3. Erstellen Sie einen Ordner für die Datenreduktion im Basisverzeichnis und kopieren Sie die bereitgestellten Skripts und Makros aus dem freigegebenen Verzeichnis.
  4. Bearbeiten, umbenennen und speichern Sie das bereitgestellte Reduktionsmakro entsprechend.
  5. Geben Sie drspine an der Eingabeaufforderung ein und drücken Sie die Eingabetaste , um die Softwarereduktionsumgebung zu starten.
  6. Geben Sie "den Namen des Reduktionsmakros" ein, der in Schritt 5.4 bearbeitet wurde. in der Eingabeaufforderung innerhalb der Softwareumgebung und drücken Sie die Eingabetaste.

6. NSE-Datenanpassung

  1. Bearbeiten Sie das Python-Skript "stapler-drspine.py", das vom assistierenden Instrument Scientist bereitgestellt wird, mit den Namen der reduzierten Dateidaten.
    HINWEIS: Das Python-Skript ist für Benutzer des Instruments frei verfügbar.
  2. Bearbeiten Sie die Funktion so, dass sie aus der bereitgestellten Bibliothek passt.
  3. Geben Sie den Namen des bearbeiteten Skripts "stapler-drspine.py" an der Eingabeaufforderung ein und drücken Sie die Eingabetaste , um reduzierte NSE-Daten zu lesen, anzupassen und darzustellen.
    HINWEIS: Der Instrument Scientist stellt eine Vorlage für das Reduktionsmakro und das Python-Skript "stapler-drspine.py" bereit, das NSE-reduzierte Daten lesen und anpassen kann. Die endgültigen reduzierten NSE-Daten liegen im ASCII-Format vor und können von verschiedenen bevorzugten Softwares gelesen werden.

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Ergebnisse

IgG-Protein aus humanen Serum- und Rinder-MBP-Proteinen wurde in hohen Konzentrationen (~50 mg/ml) inD2O-Basenpuffernrekonstituiert. Da die Proteine in hohen Konzentrationen gelöst waren, handelte es sich bei den erhaltenen Lösungen um überfüllte Proteinlösungen. Die mit NSE untersuchte Dynamik leidet unter der überfüllten Umgebung, in der sich die Proteine befinden (Strukturfaktorwechselwirkungen und hydrodynamische Effekte)5,28,39

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Diskussion

Die NSE-Spektroskopie liefert einen einzigartigen und detaillierten Blick auf die Dynamik von Proteinen, den andere spektroskopische Techniken nicht erzeugen können. Messungen über eine erweiterte Zeitskala ermöglichen Beobachtungen sowohl der translationalen als auch der Rotationsdiffusion der Proteine, wie hier dargestellt. Die segmentale Dynamik und andere interne Schwingungen entpuppen sich als starker Zerfall der kohärenten Streufunktion S(Q, t) auf einer kurzen Zeitskala und sind gut von den gesamten diffu...

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Offenlegungen

Der Autor erklärt keine konkurrierenden finanziellen Interessen und keine Interessenkonflikte. Der Inhalt des Manuskripts basiert auf dem Vortrag, den der Autor in der HANDS-Neutron Scattering Applications in Structural Biology School zwischen 2019-2021 gehalten hat.

Danksagungen

Diese Forschung verwendete Ressourcen an der Spallation Neutron Source (BL-15, BL-6, Biologie und Chemielabors), einem DOE-Büro der Science User Facility, das vom Oak Ridge National Laboratory betrieben wird. Diese Forschung nutzte auch Ressourcen am MLZ-FRM2-Reaktor Garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) und am JCNS1 an der Forschungszentrum Jülich GmbH, Deutschland. Der Autor dankt Dr. Ralf Biehl und Dr. Andreas Stadler für ihre Hilfe bei der Modellierung und ihren Beitrag zur IgG- und MBP-Proteinforschung, Dr. Piotr A. Żołnierczuk für die Unterstützung der NSE-Datenreduktion, Dr. Changwoo Do für die Unterstützung bei SANS-Messungen und Rhonda Moody und Dr. Kevin Weiss für die Unterstützung des SNS-Biochemielabors.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Rinder-MBP-ProteinlösungSigma-AldrichM1891lyophilisiertes Pulver, rekonstituiert in  D2O
D2O - schweres WasserSigma-AldrichArtikel-Nr. 151882flüssiges
dionisiertes Wasserim Haus-zumWaschen / Reinigen von ZellenDLS-Instrument
Zetasizer Nano ZS, FZ-Jü Elastische
StreustandardsSNS-NSE, ORNL-Al2O3  und Graphitpulver
EthanolSigma-Aldrich65350-M70%iges Ethanol zur Reinigung von Zellen
IgG-ProteinlösungSigma-AldrichI4506lyophilisiertes Pulver, rekonstituiert in  D2O
KWS-2Instrument JCNS Außenstation am MLZ,  Garching, Deutschland-Kleinwinkel-Neutronenmessgerät
Liquinox GeschirrspülmittelAlconox-Phosphat-freierflüssiger Laborglasreiniger
Na2HPO4· 7H2OSigma-AldrichArt.-Nr.S9390Dinatriumphosphat-Heptahydratsalz
NaClSigma-AldrichArt.Nr.S9888Natriumchloridsalz
NaH2PO4· H2OSigma-AldrichArtikel-Nr.: S9638Mononatriumphosphat-Monohydrat-Salz
Nanodrop-SpektralphotometerThermo ScientificKatalognummer:  ND-2000NanoDrop 2000/2000c Spektralphotometer
NeutronenausrichtungskameraNeutronOptics, GrenobleNOG210222100 x 100 mm Kamera mit Sony IMX249 CMOS Sensor
Parafilm M - Wachs ParafilmBemisParafilm M - 5259-04LC PM996Allzweck Laborfolie im Kartonspender
Phoenix-J-NSE SpektrometerJCNS Außenstation am MLZ,  Garching, Deutschland- Neutronenspektrometer
SasViewhttps://www.sasview.org/
SAXSpace, Anton Paar InstrumentFZ-Jü Lich-Kleinwinkel-Röntgengerät
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SNS-NSE SpektrometerORNL, Oak Ridge, TN, USANeutronenspektrometer
Sterile SpritzenvorsatzfilterVWRN.A. PN:28145-5010,2 µ m Porengrößenfilter
Temperaturerzwingendes System (TFS)SPWissenschaftlich Teilenummer 100004055Probenumgebungsgeräte
Harnstoff -d4Sigma-AldrichProdukt-Nr. 176087deuteriertes Harnstoffsalz-Viskosimeter
FZ-Jü Lich-Fall-Kugel-Viskosimeter
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