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Methodenartikel

Untersuchung der Proteindynamik mittels Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie

2K Ansichten

DOI:

10.3791/61862

13. April 2022

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung der Struktur und Dynamik von zwei Modellproteinen, die eine wichtige Rolle für die menschliche Gesundheit spielen. Die Technik kombiniert die biophysikalische Charakterisierung auf dem Labortisch mit der Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie, um auf die Dynamik auf Zeit- und Längenskalen zuzugreifen, die für Proteininterdomänenbewegungen relevant sind.

Zusammenfassung

Die Aktivität und Funktionalität der meisten menschlichen Körperproteine hängt mit Konfigurationsänderungen ganzer Subdomänen innerhalb der Proteinkristallstruktur zusammen. Die Kristallstrukturen bilden die Grundlage für jede Berechnung, die die Struktur oder Dynamik eines Proteins beschreibt, meist mit starken geometrischen Einschränkungen. Diese Einschränkungen aus der Kristallstruktur sind jedoch in der Lösung nicht vorhanden. Die Struktur der Proteine in der Lösung kann sich vom Kristall aufgrund von Umlagerungen von Schleifen oder Subdomänen auf der Pico-Nanosekunden-Zeitskala (d. h. dem internen Proteindynamik-Zeitregime) unterscheiden. Die vorliegende Arbeit beschreibt, wie Zeitlupe auf Zeitskalen von mehreren zehn Nanosekunden mittels Neutronenstreuung erreicht werden kann. Insbesondere die dynamische Charakterisierung von zwei großen menschlichen Proteinen, einem intrinsisch ungeordneten Protein, dem eine klar definierte Sekundärstruktur fehlt, und einem klassischen Antikörperprotein, wird durch Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie (NSE) in Kombination mit einer breiten Palette von Laborcharakterisierungsmethoden behandelt. Weitere Einblicke in die Dynamik der Proteindomäne wurden mithilfe mathematischer Modellierung erzielt, um die experimentellen Neutronendaten zu beschreiben und die Überschneidung zwischen kombinierten diffusiven und internen Proteinbewegungen zu bestimmen. Die Extraktion des internen dynamischen Beitrags zur aus NSE erhaltenen Zwischenstreufunktion, einschließlich der Zeitskala der verschiedenen Bewegungen, ermöglicht einen weiteren Einblick in die mechanischen Eigenschaften einzelner Proteine und die Weichheit von Proteinen in ihrer fast natürlichen Umgebung in der überfüllten Proteinlösung.

Einleitung

Sondierung der Dynamik weicher Materie mit Neutronen
Die Untersuchung der dynamischen Eigenschaften von Proteinen und Peptiden ist ein wichtiger Teil der biophysikalischen Forschung, und es gibt heute viele gut entwickelte Methoden, um Zugang zu einer Vielzahl von Energielandschaften zu erhalten1. Die experimentell aufgedeckte Dynamik der Proteine mit ihrer biologischen Funktion in Beziehung zu setzen, ist eine weitaus schwierigere Aufgabe, die komplexe mathematische Modelle und computergestützte Dynamiksimulationen erfordert. Die Bedeutung der Neutronenspektroskopie für die Analyse von Proteinbewegungen wurde in mehreren gu....

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Protokoll

Die vorliegende Arbeit charakterisiert zwei Proteine: ein normales humanes Antikörperprotein IgG und das intrinsisch ungeordnete MBP. Die lyophilisierte Form der Proteine wurde aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Vorbereitung der Proteinprobe

  1. Es wird ein 50 mM Natriumphosphat + 0,1 M NaCl-Puffer hergestellt, indem die jeweiligen festen Reagenzien in schwerem Wasser (D2O) gewogen und gelöst werden (siehe Materialtabelle). Dies ist das deuterierte Pufferlösungsmittel für IgG.
    1. Stellen Sie den pH-Wert der Pufferlösung auf 6,6 ein.

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Ergebnisse

IgG-Protein aus humanen Serum- und Rinder-MBP-Proteinen wurde in hohen Konzentrationen (~50 mg/ml) inD2O-Basenpuffernrekonstituiert. Da die Proteine in hohen Konzentrationen gelöst waren, handelte es sich bei den erhaltenen Lösungen um überfüllte Proteinlösungen. Die mit NSE untersuchte Dynamik leidet unter der überfüllten Umgebung, in der sich die Proteine befinden (Strukturfaktorwechselwirkungen und hydrodynamische Effekte)5,28,39

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Diskussion

Die NSE-Spektroskopie liefert einen einzigartigen und detaillierten Blick auf die Dynamik von Proteinen, den andere spektroskopische Techniken nicht erzeugen können. Messungen über eine erweiterte Zeitskala ermöglichen Beobachtungen sowohl der translationalen als auch der Rotationsdiffusion der Proteine, wie hier dargestellt. Die segmentale Dynamik und andere interne Schwingungen entpuppen sich als starker Zerfall der kohärenten Streufunktion S(Q, t) auf einer kurzen Zeitskala und sind gut von den gesamten diffu.......

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Offenlegungen

Der Autor erklärt keine konkurrierenden finanziellen Interessen und keine Interessenkonflikte. Der Inhalt des Manuskripts basiert auf dem Vortrag, den der Autor in der HANDS-Neutron Scattering Applications in Structural Biology School zwischen 2019-2021 gehalten hat.

Danksagungen

Diese Forschung verwendete Ressourcen an der Spallation Neutron Source (BL-15, BL-6, Biologie und Chemielabors), einem DOE-Büro der Science User Facility, das vom Oak Ridge National Laboratory betrieben wird. Diese Forschung nutzte auch Ressourcen am MLZ-FRM2-Reaktor Garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) und am JCNS1 an der Forschungszentrum Jülich GmbH, Deutschland. Der Autor dankt Dr. Ralf Biehl und Dr. Andreas Stadler für ihre Hilfe bei der Modellierung und ihren Beitrag zur IgG- und MBP-Proteinforschung, Dr. Piotr A. Żołnierczuk für die Unterstützung der NSE-Datenreduktion, Dr. Changwoo Do für die Unterstützung bei SANS-Messungen und Rhonda Moody und Dr. Kevin Weiss für....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Rinder-MBP-ProteinlösungSigma-AldrichM1891lyophilisiertes Pulver, rekonstituiert in  D2O
D2O - schweres WasserSigma-AldrichArtikel-Nr. 151882flüssiges
dionisiertes Wasserim Haus-zumWaschen / Reinigen von ZellenDLS-Instrument
Zetasizer Nano ZS, FZ-Jü Elastische
StreustandardsSNS-NSE, ORNL-Al2O3  und Graphitpulver
EthanolSigma-Aldrich65350-M70%iges Ethanol zur Reinigung von Zellen
IgG-ProteinlösungSigma-AldrichI4506lyophilisiertes Pulver, rekonstituiert in  D2O
KWS-2Instrument JCNS Außenstation am MLZ,  Garching, Deutschland-Kleinwinkel-Neutronenmessgerät
Liquinox GeschirrspülmittelAlconox-Phosphat-freierflüssiger Laborglasreiniger
Na2HPO4· 7H2OSigma-AldrichArt.-Nr.S9390Dinatriumphosphat-Heptahydratsalz
NaClSigma-AldrichArt.Nr.S9888Natriumchloridsalz
NaH2PO4· H2OSigma-AldrichArtikel-Nr.: S9638Mononatriumphosphat-Monohydrat-Salz
Nanodrop-SpektralphotometerThermo ScientificKatalognummer:  ND-2000NanoDrop 2000/2000c Spektralphotometer
NeutronenausrichtungskameraNeutronOptics, GrenobleNOG210222100 x 100 mm Kamera mit Sony IMX249 CMOS Sensor
Parafilm M - Wachs ParafilmBemisParafilm M - 5259-04LC PM996Allzweck Laborfolie im Kartonspender
Phoenix-J-NSE SpektrometerJCNS Außenstation am MLZ,  Garching, Deutschland- Neutronenspektrometer
SasViewhttps://www.sasview.org/
SAXSpace, Anton Paar InstrumentFZ-Jü Lich-Kleinwinkel-Röntgengerät
Slide-A-Lyzer DialysemembranenThermo Scientific88400-88405Slide-A-Lyzer Mini-Dialysegeräte Röhrchen mit 3,5 K MWCO
SNS Remote Analysis ClusterNeutron Science Remote Analysis (sns.gov)https://analysis.sns.gov
SNS-NSE SpektrometerORNL, Oak Ridge, TN, USANeutronenspektrometer
Sterile SpritzenvorsatzfilterVWRN.A. PN:28145-5010,2 µ m Porengrößenfilter
Temperaturerzwingendes System (TFS)SPWissenschaftlich Teilenummer 100004055Probenumgebungsgeräte
Harnstoff -d4Sigma-AldrichProdukt-Nr. 176087deuteriertes Harnstoffsalz-Viskosimeter
FZ-Jü Lich-Fall-Kugel-Viskosimeter
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Referenzen

  1. Fitter, J., Gutberlet, T., Katsaras, J. Neutron Scattering in Biology: Techniques and Applications. , New York. (2006).
  2. Stadler, A., Monkenbusch, M., Biehl, R., Richter, D., Ollivier, J. Neutron spin-echo and TOF reveals protein dynamics in solution. Journal of the Physical Society of Jap....

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Intermedi re StreufunktionProteindom nendynamikKleinwinkel NeutronenstreuungDynamische LichtstreuungViskosit tsmessungenAtommodellierungMathematische ModellierungProbenvorbereitung