Methodenartikel

Zellfreie Produktion von Proteoliposomen für die funktionelle Analyse und Antikörperentwicklung gegen Membranproteine

DOI:

10.3791/61871

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22. September 2020

 , 
1Graduate School of Medicine, Ehime University, 2Proteo-Science Center, Ehime University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes zellfreies Verfahren zur Herstellung von hochwertigem Proteoliposom mittels Doppelschichtdialysemethode unter Verwendung eines weizenzellenfreien Systems und Liposomen. Diese Methode bietet geeignete Mittel für die funktionelle Analyse von Membranproteinen, das Screening von Wirkstoffzielen und die Entwicklung von Antikörpern.

Zusammenfassung

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Membranproteine spielen eine wesentliche Rolle in einer Vielzahl von zellulären Prozessen und erfüllen lebenswichtige Funktionen. Membranproteine sind in der Wirkstoffforschung von medizinischer Bedeutung, da sie das Ziel von mehr als der Hälfte aller Medikamente sind. Ein Hindernis für die Durchführung biochemischer, biophysikalischer und struktureller Studien von Membranproteinen sowie für die Antikörperentwicklung war die Schwierigkeit, große Mengen an hochwertigem Membranprotein mit korrekter Konformation und Aktivität herzustellen. Hier beschreiben wir eine "Bilayer-Dialysemethode" mit einem weizenkeimzellfreien System, Liposomen und Dialysebechern, um Membranproteine effizient zu synthetisieren und gereinigte Proteoliposomen in kurzer Zeit mit einer hohen Erfolgsrate herzustellen. Membranproteine können ebenso hergestellt werden wie in mehreren Milligramm, wie GPCRs, Ionenkanälen, Transportern und Tetraspaninen. Diese zellfreie Methode trägt dazu bei, Zeit, Kosten und Aufwand für die Herstellung hochwertiger Proteoliposomen zu reduzieren und bietet geeignete Mittel für die funktionelle Analyse von Membranproteinen, das Screening von Wirkstoffzielen und die Antikörperentwicklung.

Einleitung

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Membranproteine sind eines der wichtigsten Wirkstoffziele in Diagnose und Therapie. Tatsächlich sind die Hälfte der kleinen Wirkstoffe Membranproteine wie G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) und Ionenkanäle1. Im Laufe der Jahre haben Forscher an biochemischen, biophysikalischen und strukturellen Studien von Membranproteinen gearbeitet, um ihre Struktur und Funktion aufzuklären 2,3. Die Entwicklung monoklonaler Antikörper gegen Membranproteine wird ebenfalls aktiv durchgeführt, um funktionelle und strukturelle Studien zu beschleunigen und therapeutische und diagnostische Anwendungen ....

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Protokoll

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1. Herstellung von pEU-Expressionsplasmid

HINWEIS: Das pEU-Expressionsplasmid sollte Startcodon, offenen Leserahmen des Zielmembranproteins und Stopcodon im Fragment enthalten (siehe Abbildung 1). Fügen Sie bei Bedarf Erkennungs-/Reinigungs-Tag-Sequenz(en) an der entsprechenden Position hinzu. Für das Subklonen ist entweder die Restriktionsenzymverdauung oder das nahtlose Klonen anwendbar. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das eine nahtlose Klonmethode verwendet.

  1. Bereiten Sie das DNA-Fragment vor.
    1. Amplifizieren Sie das interessierende Gen durch PCR unter Verwendung der cDNA-Vorlage, Primer 1 ....

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Ergebnisse

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Mit diesem Protokoll können teilweise gereinigte Proteoliposomen in kurzer Zeit erhalten werden. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 2A dargestellt. Fünfundzwanzig GPCRs der Klassen A, B und C wurden erfolgreich mit der Doppelschichtdialysemethode (kleiner Maßstab) synthetisiert und teilweise durch Zentrifugation und Pufferwäsche gereinigt. Obwohl die Menge der synthetisierten Proteine je nach Proteintyp variiert, können bei Verwendung großer Dialysebecher in der Regel 50 bis 400 μg .......

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Diskussion

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Das vorgestellte Protokoll bietet eine Methode zur Herstellung von Membranproteinen mit einer hohen Erfolgsrate. Dieses Protokoll ist einfach, hochgradig reproduzierbar und leicht zu skalieren. Es hat auch das Potenzial, den Zeit- und Kostenaufwand für Experimente zu reduzieren, die eine große Menge an Membranproteinen verbrauchen. Die Zweischichtdialysemethode verbessert die Produktivität um das 4- bis 10-fache im Vergleich zur Doppelschichtmethode oder Dialysemethode (Abbildung 2B)

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde vom Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) von AMED unter der Fördernummer JP20am0101077 unterstützt. Diese Arbeit wurde auch teilweise durch JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
&mal; 3 SDS-PAGE-ProbenpufferEnthält 10 % 2-Mercaptoethanol
5-20 % Gradient SDS-PAGE GelATTOE-D520L
70 % EthanolVerdünntes Ethanol durch Reinstwasser.
AgaroseTakara Bio
AmmoniumacetatNakalai tesque02406-95Da dieses Reagenz zerfließend ist, lösen Sie es nach dem Öffnen vollständig in Wasser auf und lagern Sie es bei -30 °C.
Ampicillin SodiumNakalai tesque02739-74
Asolectin Liposom, lyophilisiertCellFree SciencesCFS-PLE-ASLEin Fläschchen enthält 10 mg lyophilisierte Liposomen.
BSA-Standard1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µ L & mal; 1 SDS-PAGE-Probenpuffer
CBB-Gel-Färbung
cDNA-Klon von InteressePlasmid mit cDNA-Klon oder synthetischem DNA-Fragment
ChloroformNakalai tesque08402-84
Gekühlter InkubatorTemperaturbereich von 0 bis 40 &°; C oder breiter.
CreatinkinaseRoche Diagnostics04524977190
Dialysebecher (0,1 mL)Thermo Fisher Scientific69570Slide-A-Lyzer MINI Dialysegerät, 10 K MWCO, 0,1 mL
Dialysebecher (2 mL)Thermo Fisher Scientific88404Slide-A-Lyzer MINI Dialysegerät, 10 K MWCO, 2 ml DNA-Leitermarker
Thermo Fisher ScientificSM0311GeneRuler 1 kb DNA Leiter
DpnIThermo Fisher ScientificFD1703FastDigest DpnI
E. coli Stamm JM109
ElektrophoresekammerATTO
Ethanol (99,5%)Nakalai tesque14713-95
Ethidiumbromid
Verdampfungskolben, 100 mL
Gel-Imager
Gel-ScannerAls Ersatz verwenden wir Dokumentenscanner und LED-Immuninator.
LB-Bouillon
Lipide von InteresseAvanti Polar Lipids
MikrozentrifugeTOMYMX-307
NTP-MixCellFree SciencesCFS-TSC-NTPMischung aus ATP, GTP, CTP, UTP, zu je 25 mM
Nukleasefreies 25-ml-RöhrchenIWAKI362-025-MYP
Nufaltenfreie KunststoffröhrchenWatson BiolaboreNicht autoklavieren. Verwenden Sie sie getrennt von anderen Experimenten.
Nufaltenfreie SpitzenWatson Bio LabsNicht autoklavieren. Verwenden Sie sie getrennt von anderen Experimenten.
PBS-Puffer
PCR-AufreinigungskitMACHEREY-NAGEL740609NucleoSpin Gel und PCR Clean-up
pEU-E01-MCS VektorCellFree SciencesCFS-11
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1)Nippon-Gen311-90151
Plasmidvorbereitung Midi-KitMACHEREY-NAGEL740410NucleoBond Xtra Midi
Primer 1Thermo Fisher ScientificKundenspezifische Oligosynthese5'-CCAAGATATCACTAGnnnnnn-3'
Genspezifischer Primer, vorwärts. Die Großbuchstaben zeigen die Überlappungssequenz an, die für ein nahtloses Klonen hinzugefügt werden soll. Kleinbuchstaben nnnn…. (20-30 bp) zeigt eine genspezifische Sequenz.
Primer 2Thermo Fisher ScientificKundenspezifische Oligosynthese5'-CCATGGGACGTCGACnnnn-3'
Genspezifischer Primer, umgekehrt. Die Großbuchstaben zeigen die Überlappungssequenz an, die für ein nahtloses Klonen hinzugefügt werden soll. Kleinbuchstaben nnnn…. (20-30 bp) zeigt eine genspezifische Sequenz.
Primer 3Thermo Fisher ScientificCustom Oligo synthesis5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
Vorwärtsprimer für die Vektorlinearisierung. "Unterstrichen" funktioniert als Überlappung beim nahtlosen Klonen.
Primer 4Thermo Fisher ScientificCustom Oligo synthesis5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
Reverse Primer für die Vektorlinearisierung. "Unterstrichen" funktioniert als Überlappung beim nahtlosen Klonen.
Primer 5Thermo Fisher ScientificKundenspezifische Oligosynthese5'-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3'
Sequenzierungsprimer, vorwärts
Primer 6Thermo Fisher ScientificCustom Oligosynthese5' - CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3'
Sequenzierungsprimer, umgekehrter
ProteingrößenmarkerBio-Rad1610394Precision Plus Protein Standard
Rotationsverdampfer
nahtlose Klonierung EnzymmischungNew England BioLabsE2611LGibson Assembly Master Mix
Andere Reagenzien für die nahtlose Klonierung sind ebenfalls erhältlich.
SP6 RNA-Polymerase & RNase InhibitorCellFree SciencesCFS-TSC-ENZ
Submarine Elektrophoreseanlage
TAE Puffer
Transkriptionspuffer LMCellFree SciencesCFS-TSC-5TB-LM
TranslationspufferCellFree SciencesCFS-SUB-SGCSUB-AMIX SGC (&mal; 40) Stammlösung (S1, S2, S3, S4).
& mal vorbereiten; 1 Translationspuffer vor der Verwendung durch Mischen von Material S1, S2, S3, S4 und Reinstwasser.
ReinstwasserWir empfehlen, bei jedem Experiment Reinstwasser mit einem Reinstwasser-Produktionssystem zuzubereiten. Nicht autoklavieren.
Wir haben Reinstwasser mit Milli-Q Reference und dem Elix10-System hergestellt.
Als Ersatz kann handelsübliches nukleasefreies Wasser (kein DEPC-behandeltes Wasser) verwendet werden. Kümmern Sie sich nach dem Öffnen der Flasche um Verunreinigungen.
Der Ultraschall-HomogenisatorBransonSONIFIER Modell 450D-AdvancedDer Ultraschallreiniger kann als Ersatz verwendet werden.
UV-Transilluminator
Vakuum-Exsikkator
Weizenkeim-ExtraktCellFree SciencesCFS-WGE-7240WEPRO7240

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  2. Gusach, A., et al. Beyond structure: emerging approaches to study GPCR dynamics. Current Opinion in Structural Biology

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Schlagwörter

Zellfreie ProteinsyntheseMembranproteinproduktionProteoliposomen Pr parationBilayer DialysemethodeWeizenkeimsystemLiposomenbildungSDS PAGE AnalyseZentrifugationsreinigung

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