Charakterisierung und funktionelle Vorhersage von Bakterien im Eierstockgewebe

Summary

Immunhistochemische Färbung und 16S ribosomale RNA-Gensequenzierung (16S rRNA-Gen) wurden durchgeführt, um Bakterien in krebsartigen und nicht krebsartigen Eierstockgeweben in situ zu entdecken und zu unterscheiden. Die kompositorischen und funktionellen Unterschiede der Bakterien wurden mit Hilfe von BugBase und Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt) vorhergesagt.

Abstract

Die Theorie eines "sterilen" weiblichen oberen Fortpflanzungstraktes stößt aufgrund von Fortschritten beim Bakteriennachweis auf zunehmenden Widerstand. Ob Eierstöcke Bakterien enthalten, ist jedoch noch nicht bestätigt. Hierin wurde ein Experiment zum Nachweis von Bakterien im Eierstockgewebe eingeführt. Wir wählten Eierstockkrebspatientinnen in der Krebsgruppe und nicht-krebserregende Patientinnen in der Kontrollgruppe aus. Die 16S rRNA-Gensequenzierung wurde verwendet, um Bakterien im Eierstockgewebe von den Krebs- und Kontrollgruppen zu unterscheiden. Darüber hinaus haben wir die funktionelle Zusammensetzung der identifizierten Bakterien mitHilfe von BugBase und PICRUSt vorhergesagt. Diese Methode kann auch in anderen Eingeweiden und Geweben eingesetzt werden, da in den letzten Jahren nachgewiesen wurde, dass viele Organe Bakterien beherbergen. Das Vorhandensein von Bakterien in Eingeweiden und Geweben kann Wissenschaftlern helfen, krebshaftes und normales Gewebe zu bewerten und kann bei der Behandlung von Krebs helfen.

Introduction

In letzter Zeit wurde eine zunehmende Anzahl von Artikeln veröffentlicht, die die Existenz von Bakterien in abdominalen festen Eingeweiden wie Niere, Milz, Leber und Eierstock^{belegen 1,2}. Geller et al. fanden Bakterien in Pankreastumoren, und diese Bakterien waren resistent gegen Gemcitabin, ein Chemotherapeutikum². S. Manfredo Vieira et al. kamen zu dem Schluss, dass Enterococcus gallinarum auf die Lymphknoten, Leber und Milz übertragbar ist und die Autoimmunität antreiben kann³.

Da der Gebärmutterhals eine Rolle als Verteidiger spielt, sind Bakterien im oberen weiblichen Fortpflanzungstrakt, der Gebärmutter, Eileiter und Eierstöcke enthält, nur minimal erforscht. In den letzten Jahren haben sich jedoch einige neue Theorien etabliert. Bakterien können während des Menstruationszyklus aufgrund von Veränderungen der Schleimhäute Zugang zur Gebärmutterhöhle haben^4,5. Darüber hinaus bestätigten Zervomanolakis et al., dass der Uterus zusammen mit den Eileitern eine Peristaltikpumpe ist, die vom endokrinen System der Eierstöcke gesteuert wird, und diese Anordnung ermöglicht es Bakterien, in das Endometrium, die Eileiter und die Eierstöcke einzudringen⁶.

Der obere Fortpflanzungstrakt ist dank der Entwicklung bakterieller Nachweismethoden kein Rätsel mehr. Verstraelen et al. verwendeten eine barcoded paired-end Sequenzierungsmethode, um Uterusbakterien zu entdecken, indem sie auf die hypervariable V1-2-Region des 16S-RNA-Gens⁷abzielten. Fang et al. verwendeten barcoded sequencing bei Patienten mit Endometriumpolypen und zeigten das Vorhandensein verschiedener intrauteriner Bakterien⁸. Darüber hinaus fanden Miles et al. und Chen et al. unter Verwendung des 16S-RNA-Gens Bakterien im Genitalsystem von Frauen, die sich einer Salpingo-Oophorektomie und Hysterektomie unterzogen hatten, bzw.^5,9.

Bakterien im Tumorgewebe haben in den letzten Jahren zunehmend an Aufmerksamkeit gewonnen. Banerjee et al. entdeckten, dass sich die Mikrobiomsignatur zwischen Eierstockkrebspatientinnen und Kontrollpersonen unterschied¹⁰. EinNoxynatronum sibiricum war mit dem Tumorstadium assoziiert, und Methanosarcina vacuolata könnte verwendet werden, um Eierstockkrebs zu diagnostizieren¹¹. Neben Eierstockkrebs wurden andere Krebsarten wie Magen, Lunge, Prostata, Brust, Gebärmutterhals und Endometrium nachweislich mit Bakterien^{assoziiert 12 , 13,14},^15,16,17,18. Poore et al. schlugen eine neue Klasse mikrobiell basierter onkologischer Diagnostik vor, die ein Krebsfrüherkennung im Frühstadium vorsieht¹⁹. In diesem Protokoll untersuchten wir die Unterschiede zwischen krebsösen und normalen Eierstockgeweben, indem wir die Zusammensetzung und Funktion von Bakterien in diesen beiden Geweben verglichen.

Immunhistochemische Färbung und 16S rRNA-Gensequenzierung wurden durchgeführt, um das Vorhandensein von Bakterien in den Eierstöcken zu bestätigen. Die Unterschiede und vorhergesagten Funktionen der Ovarialbakterien in krebsartigen und nicht-krebsartigen Eierstockgeweben wurden untersucht. Die Ergebnisse zeigten die Existenz von Bakterien im Eierstockgewebe. Anoxynatronum sibiricum und Methanosarcina vacuolata waren mit dem Stadium bzw. der Diagnose von Eierstockkrebs verbunden. Sechsundvierzig signifikant unterschiedliche KEGG-Signalwege, die in beiden Gruppen vorhanden waren, wurden verglichen.

Protocol

Diese Studie wurde von der Medizinischen Institutionellen Ethikkommission des ersten angeschlossenen Krankenhauses der Xi'an Jiaotong Universität (Nr. XJTUIAF2018LSK-139). Von allen eingeschlossenen Patienten wurde eine Einwilligung nach Aufklärung eingeholt.

1. Kriterien für den Eintritt in die Krebsgruppe und die Kontrollgruppe

1. Für die Krebsgruppe werden Patientinnen aufgenommen, bei denen hauptsächlich Eierstockkrebs diagnostiziert wird, und nach einer Laparotomie wird nachgewiesen, dass sie serösen Eierstockkrebs durch pathologische Befunde haben.
2. Für die Kontrollgruppe werden Patienten aufgenommen, bei denen in erster Linie ein Uterusmyom oder eine Uterusadenomyose diagnostiziert wird, ohne eine Ovarialerkrankung aufwies, und die sich einer Hysterektomie und Salpingo-Oophorektomie unterzogen haben.
   HINWEIS: Dieser Standard ist nicht eindeutig. Patienten mit Erkrankungen, die die Eierstöcke nicht betreffen und sich einer Hysterektomie und Einer Salpingo-Oophorektomie unterziehen, können ebenfalls aufgenommen werden.
3. Schließen Sie Patienten mit einem oder mehreren der folgenden Kriterien aus:
   Schwangere oder stillende Frauen.
   Einnahme von Antibiotika 2 Monate vor der Operation.
   Fieber oder erhöhte Entzündungsmarker.
   Entzündungen jeglicher Art.
   Nach einer neoadjuvanten Chemotherapie.

2. Sammeln Sie Proben

1. Legen Sie während der Operation die resezierten Eierstöcke in ein steriles Röhrchen und legen Sie das Röhrchen für den Transport in flüssigen Stickstoff. Vermeiden Sie es, während des gesamten Verfahrens etwas anderes zu berühren.
2. Trennen Sie die Eierstöcke mit einer neuen sterilen Pinzette unter einem Laminar-Flow-Schrank in etwa 1 cm dicke Gewebeproben. Nach der Trennung die Proben bei -80 °C konservieren.
   HINWEIS: Alle Verfahren zum Sammeln von Proben sind aseptisch, einschließlich der Trennung der Eierstöcke.

3. Sequenzierung des 16S rRNA-Gens

1. Extrahieren Sie DNA.
   1. 1,2 ml Inhibit-EX-Puffer in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen geben. Dann fügen Sie 180-220 mg Proben in das Röhrchen hinzu. Die Probe vollständig mischen lassen (70 °C Wasserbad für 5 min und dann Wirbel für 15 s).
   2. Zentrifuge das Röhrchen für 1 min bei 600 x g.
   3. 550 μL des Überstandes in ein neues 1,5-ml-Röhrchen geben und 1 min bei 600 x g zentrifugiert werden.
   4. 400 μL des Überstandes mit 30 μL Proteinase K in ein weiteres 1,5 ml Röhrchen übertragen.
   5. Fügen Sie 400 μL Puffer AL hinzu und verwenden Sie einen Wirbelmischer für 15 s.
   6. Bei 70 °C 10 min inkubieren.
   7. Fügen Sie 400 μL 96-100% Alkohol hinzu. Verwenden Sie einen Wirbelmischer für 15 s.
   8. 600 μL Mischung in eine Absorptionssäule und Zentrifuge für 1 min bei 13700 g geben. Tauschen Sie das Unterrohr aus. Wiederholen Sie diesen Schritt 11 Mal.
   9. Fügen Sie 500 μL Puffer AW1 hinzu, Zentrifuge für 1 min bei 13.700 x g, und wechseln Sie das untere Rohr.
   10. Fügen Sie 500 μL Puffer AW2 hinzu, Zentrifuge für 3 min bei 13.700 x g und wechseln Sie das untere Rohr.
   11. Zentrifuge für 3 min bei 13.700 x g.
   12. Die Mischung in ein neues 1,5-ml-Röhrchen geben, 200 μL Puffer-ATE hinzufügen, bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren und 1 min bei 13.700 x g zentrifugieren.
2. Qualitätsprüfung. Verwenden Sie 1% Sepharose GelElektrophorese, um die Qualität zu testen. Fügen Sie 400 ng Probe, 120 V, 30 Minuten hinzu. Ideales Ergebnis: DNA-Konzentration: ≥ 10 ng/μL, DNA-Reinheit: A260/A280 = 1,8-2,0, Brutto-DNA: ≥ 300 ng.
3. Bereiten Sie die Bibliotheken mit einem metagenomischen 16S-Sequenzierungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers vor.
   1. Führen Sie eine PCR durch. Kurz gesagt, jede 25 μL PCR-Reaktion enthält 12,5 ng Proben-DNA als Eingang, 12,5 μL 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix und 5 μL jedes Primers bei 1 μM.
   2. Führen Sie die PCR mit dem folgenden Protokoll durch: ein erster Denaturierungsschritt bei 95 ° C für 3 min, gefolgt von 25 Denaturierungszyklen (95 ° C, 30 s), Glühen (55 ° C, 30 s) und Verlängerung (72 ° C, 30 s) und einer abschließenden Dehnung von 5 min bei 72 ° C.
   3. Reinigen Sie das PCR-Produkt von der Reaktionsmischung mit magnetischen Perlen gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.1 und 3.3.2.
   5. Qualitätsprüfung. Bitte beachten Sie Schritt 3.2.
   6. Wiederholen Sie Schritt 3.3.3.
   7. Qualitätsprüfung. Verwenden Sie 1% Sepharose-Gelelektrophorese, um Verunreinigungen zu testen, ein Spektralphotometer zum Testen der Reinheit, ein Fluorometer zum Testen der Konzentration und ein RNA-Assay-Kit zum Testen der Integrität. Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers. Normalisieren und Bündeln der Bibliotheken; dann Sequenz (2 x 300 bp Paired-End-Leseeinstellung) unter Verwendung von 600-Zyklus-V3-Standard-Durchflusszellen, wodurch ungefähr 100.000 gepaarte 2 x 300 Basislesevorgänge erzeugt werden.
      HINWEIS: Die Primersequenzen in voller Länge: 16S Amplicon Polymerase Kettenreaktion (PCR) Forward Primer: 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGA GACAG-[CCTACGGGNGGCWGCAG] und 16S Amplicon PCR Reverse Primer: 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GACTACHVGGGTATCTAATCC].

4. Analysieren Sie 16S rRNA-Gensequenzierungsdaten

1. Filtern Sie die Rohlesevorgänge jeder Probe basierend auf der Sequenzierungsqualität mit dem Softwarepaket QIIME 2-201802²⁰.
   1. Kopieren Sie drei Dateien in das Verzeichnis: emp-paired-end-sequences_01
      eine forward.fastq.gz Datei, die die Vorwärtssequenz enthält, liest,
      eine reverse.fastq.gz Datei, die die umgekehrte Sequenz enthält, liest,
      eine barcodes.fastq.gz Datei, die die zugehörigen Barcode-Lesevorgänge enthält
   2. Ausführen
      qiime tools import \
      --Typ EMPPairedEndSequences \
      --input-path emp-paired-end-sequences_01 \--output-path emp-paired-end-sequences_02.qza
2. Entfernen Sie die Primer- und Adaptersequenzen.
   qiime cutadapt trim-paired \
   --i-demultiplexed-sequences demultiplexed-seqs_02.qza \
   --p-front-f GCTACGGGGGG \
   --p-front-r GCTACGGGGGG \
   --p-Fehlerrate 0 \
   --Quality-Cutoff 25 \
   --o-trimmed-sequences trimmed-seqs_03.qza \
   --ausführlich
3. Verkürzen Sie Sequenzlesevorgänge, bei denen beide gepaarten Endpunktqualitäten kleiner als 25 sind. Siehe oben --quality-cutoff 25
4. Analysieren Sie die Sequenzierungsdaten.
   1. Sammeln Sie Sequenzen, um operative taxonomische Einheiten (OTUs) mit einem Ähnlichkeits-Cutoff von 97% zu bilden.
      qiime vsearch dereplicate-sequences \
      --i-sequences trimmed-seqs_03.qza \
      --o-dereplicated-table table_04.qza \
      --o-dereplicated-sequences rep-seqs_04.qza
      ​
      qiime vsearch cluster-features-closed-reference \
      --i-table table_04.qza \
      --i-sequences rep-seqs_04.qza \
      --i-reference-sequences 97_otus.qza \
      --p-perc-identity 0,97 \
      --o-clustered-table table-cr-97.qza \
      --o-clustered-sequences rep-seqs-cr-97.qza \
      --o-unmatched-sequences unmatched-cr-97.qza
   2. Berechnen Sie für die OTUs die relative Häufigkeit in jeder Stichprobe. Informationen zur Häufigkeit finden Sie in Tabelle-cr-97.qza
5. Verwenden Sie einen nativen Bayes'schen Klassifikator, der auf das RDP-Trainingsset (Version 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/) abzielt, um alle Sequenzen zu sortieren. Zugeordnete Taxoninformationen befinden sich in table-cr-97.qza
6. Weisen Sie OTUs innerhalb der angegebenen OTU eine Klassifikation zu, die die Hauptkohärenz der Sequenzen widerspiegelt. Richten Sie dann die OTUs aus. Siehe Tabelle-cr-97.qza und rep-seqs-cr-97.qza
7. Führen Sie basierend auf den Beispielgruppeninformationen Alphadiversität (einschließlich der Chao 1-, ACE-, Shannon-, Simpson- und Evenness-Indizes) und der UniFrac-basierten Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) durch.
   qiime tools export \
   --Eingabepfad, Tabelle-cr-97.qza \
   --Ausgabepfad exportiert-Feature-Tabelle
   exportierte-Feature-Tabelle
   
   Qiime Diversität alpha \
   --i-table table-cr-97.qza \
   --p-metric observed_otus \
   --o-alpha-diversity observed_otus_vector.qza
   
   qiime Vielfalt beta \
   --i-table table-cr-97.qza \
   --p-metric braycurtis \
   --o-Distance-Matrix unweighted_unifrac_distance_matrix.qza

5. Bakterielle Funktion vorhersagen

1. Um die zugehörige Darstellung der Eigenschaften der Bakterien vorherzusagen, verwenden Sie BugBase²¹. Die OTU-Eingabetabelle für BugBase wird mit den folgenden Befehlen vorbereitet.
   biom convert -i otu_table.biom -o otu_table.txt --to-tsv
   biom convert -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --table-type="OTU table" --to-json
   HINWEIS: Die Vorhersage basiert auf sechs Phänotypkategorien (Ward et al. unveröffentlicht) (https://bugbase.cs.umn.edu/): Grammfärbung, Sauerstofftoleranz, Fähigkeit, Biofilme zu bilden, Gehalt an mobilen Elementen, Pathogenität und oxidative Stresstoleranz.
2. Vorhersage der funktionellen Zusammensetzung eines Metagenoms durch PICRUSt unter Verwendung von Markergendaten und einer Datenbank mit Referenzgenomen²².
   make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t /mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom &
   normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
   predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
   categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG_Pathways" -l 1 -o picrust_L1.biom
   categorize_by_function.py -f -i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions. L1.txt
3. Analysieren Sie die Funktionsunterschiede zwischen den einzelnen Gruppen mit Hilfe von STAMP^23,24. Bitte beachten Sie die Zitate, um die Software zu bedienen.

6. Daten

1. Verwenden Sie statistische Software, um die Signifikanz der Ergebnisse zu berechnen. Die Angabe der statistischen Signifikanz sollte als P < 0,05 gesetzt werden.
2. Bewerten Sie Unterschiede in Alter und Parität durch den t-Test des Schülers. Beurteilen Sie Unterschiede im Wechseljahrsstatus, bluthochdruck und Diabetes in der Anamnese durch den Chi-Quadrat-Test. Beurteilen Sie Unterschiede in der Anzahl der ovariellen Bakteriellen Taxa durch den Mann-Whitney U-Test.

Results

Patienten
Insgesamt wurden 16 qualifizierte Patienten in die Studie eingeschlossen. Die Kontrollgruppe umfasste 10 Frauen mit der Diagnose eines gutartigen Uterustumors (unter ihnen wurde bei 3 Patienten ein Uterusmyom und bei 7 Patienten eine Uterusadenomyose diagnostiziert). In der Zwischenzeit umfasste die Krebsgruppe 6 Frauen mit der Diagnose serösen Eierstockkrebs (unter ihnen wurden 2 Patienten mit Stadium II und 2 von ihnen mit Stadium III diagnostiziert). Die folgenden Merkmale zeigten keine U...

Discussion

Eierstockkrebs hat einen bemerkenswerten Einfluss auf die Fruchtbarkeit von Frauen²⁵. Die meisten Eierstockkrebspatientinnen werden in späten Stadien diagnostiziert, und die 5-Jahres-Überlebensrate beträgt weniger als 30%¹⁸. Die Bestätigung von Bakterien in den abdominalen festen Eingeweiden, einschließlich Leber, Bauchspeicheldrüse und Milz, wurde veröffentlicht. Die Existenz von Bakterien im oberen weiblichen Fortpflanzungstrakt tritt auf, weil der Gebärmutterhals nicht e...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2200 TapeStation Software	Agilgent USA
AmpliSeq für Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories	Illumina
Image-pro plus 7	Media Cybernetics
Leica ASP 300S	Leica Biosystems Division of Leica Microsystems
Leica EG 1150	Leica Biosystems Division of Leica Microsystems
Leica RM2235	Leica Biosystems Division of Leica Microsystems
LPS Core monoklonaler Antikörper, Klon WN1 222-5	Hycult Biotech
Mag-Bind RxnPure Plus magnetische Kügelchen	Omega Biotek	M1386-00
Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit	Omega Biotek	M4029-01
MiSeq	Illumina	SY-410-1003
Silva-Datenbank	Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie und Jacobs University
das QuantiFluor dsDNA-System	Promega	E2670
Trimmomatic	Bjö rn Usadel
ZytoChem Plus (HRP) Anti-Kaninchen (DAB) Kit	Zytomed Systems	HRP008DAB-RB